机械刺激通过初级纤毛调控软骨细胞凋亡与基质代谢延缓膝骨关节炎的机制

Mechanism by which mechanical stimulation regulates chondrocyte apoptosis and matrix metabolism via primary cilia to delay osteoarthritis progression

摘要

目的 膝骨关节炎(osteoarthritis，OA)是最常见的慢性退行性疾病之一，主要病理变化为软骨细胞凋亡和细胞外基质退化。机械刺激可以延缓软骨细胞凋亡并促进细胞外基质合成，但其分子机制不明确。本研究旨在探究初级纤毛(primary cilia，PC)在介导机械刺激影响OA进展中的作用。 方法 体内实验：构建鞭毛内转运体88(intraflagellar transport 88，IFT88)条件性敲除的IFT88^flox/flox 小鼠(即初级纤毛缺失小鼠)，并以野生型小鼠为对照。通过外科手术(前交叉韧带横切术联合内侧半月板失稳术)建立OA模型，进行跑台运动干预，通过苏木精-伊红(hematoxylin-eosin，HE)染色、番红O-固绿染色和免疫组织化学评估OA进展，末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL)染色评估凋亡水平，转棒测试评估下肢功能。体外实验：提取小鼠关节软骨原代细胞，使用慢病毒转染技术降低IFT88基因表达，构建初级纤毛缺失细胞模型；使用白细胞介素-1β诱导炎症环境，通过细胞拉力器施加循环拉伸应变(cyclic tensile strain，CTS)模拟机械负荷对关节软骨的影响；免疫荧光和蛋白质印迹法检测II型胶原α1链(type II collagen α1 chain，COL2A1)、初级纤毛、IFT88和半胱天冬酶12(cysteinyl aspartate specific proteinase 12，caspase-12)的蛋白质表达水平，反转录聚合酶链反应检测COL2A1 mRNA水平，流式细胞术检测细胞凋亡程度。 结果 体内实验显示：野生型OA小鼠经跑台运动后国际骨关节炎研究学会(Osteoarthritis Research Society International，OARSI)评分和凋亡阳性细胞率显著降低，且平衡能力改善；而IFT88敲除的OA小鼠未表现出显著变化。体外实验发现：CTS可抑制白细胞介素-1β诱导的原代关节软骨细胞外基质降解和细胞凋亡；但在初级纤毛表达受抑制的细胞中，上述保护作用消失。 结论 机械刺激通过初级纤毛介导信号转导，抑制关节软骨退变和细胞凋亡，延缓OA进展。

Abstract

Objective Osteoarthritis (OA) is one of the most common chronic degenerative diseases, with chondrocyte apoptosis and extracellular matrix (ECM) degradation as the major pathological changes. The mechanical stimulation can attenuate chondrocyte apoptosis and promote ECM synthesis, but the underlying molecular mechanisms remain unclear. This study aims to investigate the role of primary cilia (PC) in mediating the effects of mechanical stimulation on OA progression. Methods In vivo, conditional knockout mice lacking intraflagellar transport 88 (IFT88^flox/flox IFT88 knockout; i.e., primary cilia-deficient mice) were generated, with wild-type mice as controls. OA models were established via anterior cruciate ligament transection combined with destabilization of the medial meniscus, followed by treadmill exercise intervention. OA progression was evaluated by hematoxylin-eosin staining, safranin O-fast green staining, and immunohistochemistry; apoptosis was assessed by TUNEL staining; and limb function by rotarod testing. In vitro, primary articular chondrocytes were isolated from mice and transfected with lentiviral vectors to suppress IFT88 expression, thereby constructing a primary cilia-deficient cell model. Interleukin-1β (IL-1β) was used to induce an inflammatory environment, while cyclic tensile strain (CTS) was applied via a cell stretcher to mimic mechanical loading on chondrocytes. Immunofluorescence and Western blotting were used to detect the protein expression levels of type II collagen α1 chain (COL2A1), primary cilia, IFT88, and caspase-12; reverse transcription polymerase chain reaction was performed to assess COL2A1 mRNA levels; and flow cytometry was used to evaluate apoptosis. Results In vivo, treadmill exercise significantly reduced Osteoarthritis Research Society International (OARSI) scores and apoptotic cell rates, and improved balance ability in wild-type OA mice, whereas IFT88-deficient OA mice showed no significant improvement. In vitro, CTS inhibited IL-1β-induced ECM degradation and apoptosis in primary chondrocytes; however, this protective effect was abolished in cells with suppressed primary cilia expression. Conclusion Mechanical stimulation delays OA progression by mediating signal transduction through primary cilia, thereby inhibiting cartilage degeneration and chondrocyte apoptosis.

Graphical abstract

关键词

膝骨关节炎 / 软骨 / 初级纤毛 / 机械刺激 / 鞭毛内转运体88

Key words

osteoarthritis / cartilage / primary cilia / mechanical stimulation / intraflageller transport 88

膝骨关节炎(osteoarthritis，OA)是全球范围内常见的慢性关节退行性疾病，影响全球约7.6%的人口^[1]。膝OA导致患者慢性疼痛及下肢功能障碍，严重影响生活质量，并造成巨大的社会经济负担^[2]。尽管存在多种治疗手段，运动疗法仍被强烈推荐为一线非药物治疗手段。

在身体活动过程中，关节软骨受到多种机械刺激，这些机械刺激有利于维持关节软骨的结构和功能^[3]。在体外试验中，接受机械刺激的组织工程软骨也更接近正常软骨^[4]。Deng等^[5]的研究证明，跑台运动可以逆转OA大鼠模型中出现的细胞凋亡和代谢紊乱。Zhang等^[6]发现机械刺激会重塑白细胞介素(interleukin，IL)-1诱导之后的OA细胞转录组。在人的OA软骨细胞中也出现了类似的结果，循环拉伸刺激可以避免软骨细胞受细胞焦亡影响^[7]。然而，机械刺激在OA进程中的具体机制还需进一步研究。

初级纤毛是定位于细胞膜上的细长感觉细胞器，由9对乙酰化微管构成。它们能够感知细胞外环境中的物理和化学变化，并将这些信息传递至细胞内^[8]。初级纤毛在关节软骨的生理和病理方面均发挥重要作用^[9-10]，增加初级纤毛可以提高组织工程软骨的机械特性^[11]。而初级纤毛缺失的小鼠在生长过程中更易发生OA，表现为青少年小鼠胫骨内侧软骨厚度进行性减少，成年期小鼠软骨明显萎缩^[12-13]。此外，Zhou等^[14]也发现：从OA患者膝关节中分离的软骨细胞，其纤毛特征与健康供体来源细胞存在显著差异。本课题组^[15]前期工作也发现超声刺激可以通过初级纤毛调节OA进展。

研究^[16-17]表明：机械刺激可以延缓软骨细胞凋亡并促进细胞外基质如II型胶原α1链(type II collagen α1 chain，COL2A1)和聚集蛋白聚糖(aggrecan，ACAN)等的合成，但其分子机制不明确。机械刺激会改变肌腱细胞中初级纤毛的长度和发生率^[18]。多项研究证明机械刺激对骨骼^[19-20]、肌腱^[21]、肌肉^[22]的作用需要通过初级纤毛介导，然而关于初级纤毛在软骨细胞中介导机械刺激的研究仍然有限。Deren等^[23]发现去除初级纤毛会影响肥大软骨细胞和软骨生成细胞对机械刺激的响应。因此，本研究旨在探究软骨细胞中初级纤毛在介导机械刺激影响OA进展中的作用。

1 材料与方法

1.1 伦理声明

本研究已通过中南大学湘雅二医院动物伦理委员会批准(审批号：2020519)。

1.2 实验动物

24只12周龄C57小鼠购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司；24只鞭毛内转运体88(intraflagellar transport 88，IFT88)敲除(IFT88^flox/flox )小鼠购自上海南方模式生物科技有限公司，构建步骤为将COL2A1-CreERT2小鼠与IFT88^flox/flox 小鼠交配，获得基因型为COL2A1-CreERT2⁺; IFT88^flox/flox 的基因敲除小鼠和基因型为COL2A1-CreERT2^-;IFT88^flox/flox 的野生型(Wild-type，WT)同窝对照小鼠。实验小鼠饲养于恒温恒湿环境(温度25 ℃，湿度40%)。

1.3 试剂与仪器

小动物跑台购自安徽耀坤生物科技有限公司；他莫昔芬购自美国Sigma-Aldrich公司；转棒装置购自巴西赛恩莱博公司；COL2A1抗体(货号ARG20787)购自上海帛龙生物科技有限公司；ACAN抗体(货号13880-1-AP)购自美国Proteintech公司；免疫组织化学二抗购自英国Abcam公司；罗氏(Roche)原位细胞死亡检测试剂盒购自德国Merck Chemicals公司；NanoZoomer S360全切片扫描系统购自日本滨松光子学株式会社；CELLOAD-300循环机械牵张系统购自瀚淼生物科技(苏州)有限公司；慢病毒由上海艾贝迈生物技术公司(abm Biology Technology)构建；Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒(货号AP101-60)购自浙江杭州联科生物有限公司；0.5% Triton X- 100/磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline，PBS)透化液(货号BS084-100ml)、免疫荧光Alexa Fluor偶联二抗均购自美国Thermo Fisher Scientific公司；含DAPI的抗荧光淬灭封片剂(货号P0131)购自上海碧云天生物技术有限公司；5%山羊血清/PBS封闭液(货号ZLI-9022)购自美国ORIGENE公司；乙酰化α微管蛋白一抗(货号T7451)购自德国Sigma-Aldrich公司；COL2A1一抗(货号A0563)和β-actin一抗均购自武汉爱博泰克生物科技有限公司；BD FACSCanto II流式细胞仪购自美国BD Biosciences公司；检测分析荧光显微镜购自德国卡尔·蔡司股份公司(Carl Zeiss AG)；ECL化学发光检测试剂盒购自美国Advansta公司；ChemiDoc XRS⁺成像系统和CFX Connect检测系统(货号1855201)均购自美国Bio-Rad Laboratories公司；乙酰化α微管蛋白、caspase-12、二抗兔IgG均购自美国Cell Signaling Technology公司；TRIzol^TM试剂(货号15596026)购自美国Ambion公司；RevertAid反转录试剂盒(货号K1691)购自美国Thermo Fisher公司；SYBR^® Green Pro Taq HS预混液(货号AG11701)购自湖南艾科瑞生物工程有限公司；GAPDH mRNA引物(货号B661304)购自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.4 方法

1.4.1 <italic>IFT88</italic>敲除小鼠模型的建立

使用他莫昔芬诱导软骨特异性IFT88敲除小鼠：按1.9 mg/25 g的剂量通过腹腔注射，每24 h给药1次，连续5 d；末次注射后需间隔7 d再进行下一步操作。

1.4.2 OA小鼠模型的建立及分组

通过外科手术建立OA小鼠模型，包括前交叉韧带横切术(anterior cruciate ligament transection，ACLT)和内侧半月板失稳术(destabilisation of the medial meniscus，DMM)。野生型小鼠随机分为4组：假手术组(sham组)、OA手术组(OA组)、假手术+运动组(sham/TE组)、OA手术+运动组(OA/TE组)。基因敲除小鼠对应分为：基因敲除假手术组(KO-sham组)、基因敲除OA手术组(KOOA组)、基因敲除假手术+运动组(KO-sham/TE组)、基因敲除OA手术+运动组(KOOA/TE组)。每组6只。

1.4.3 跑台运动

依据文献[13]及预实验结果，在术后第4周，运动组的小鼠进行跑台运动，参数为恒定速度10 m/min，每日30 min，每周5 d，持续4周。所有小鼠在正式训练前2 d完成跑台环境适应性训练。

1.4.4 转棒测试评价下肢功能

通过转棒实验评估小鼠的平衡能力、协调性、体能及运动规划能力。实验中采用转棒装置，刺激小鼠在圆形转动平面持续行走。小鼠在转棒上停留的时间提示膝关节功能状态。测试参数为固定转速30 r/min，其中前1 min为加速阶段(从3 r/min逐步升至30 r/min)，最终记录小鼠稳定运动持续时间。

1.4.5 国际骨关节炎研究学会评分

转棒测试结束后，采用颈椎脱臼法处死小鼠，完整剥离膝关节，在4%多聚甲醛固定液中固定 48 h；随后置于EDTA脱钙液中脱钙14 d后进行石蜡包埋。沿矢状面连续切取膝关节组织切片，厚度 5 μm，分别进行苏木精-伊红(hematoxylin-eosin，HE)染色与番红O-固绿(safranin-O fast green，S-O)染色。染色切片经光学显微镜成像后，依据国际骨关节炎研究学会(Osteoarthritis Research Society International，OARSI)评分系统评估软骨损伤的严重程度。

1.4.6 免疫组织化学检测

石蜡切片经脱蜡复水化处理后进行抗原修复，10%山羊血清封闭非特异性结合位点，4 ℃下与一抗孵育过夜，次日与二抗反应显色。使用抗体如下：COL2A1(稀释比1꞉1 000)、ACAN抗体(稀释比1꞉400)。染色切片采用NanoZoomer S360全切片扫描系统进行数字化图像采集。

1.4.7 末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法检测细胞凋亡

石蜡切片经脱蜡复水化处理后，使用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL)染色检测细胞凋亡率，严格依照罗氏原位细胞死亡检测试剂盒说明书流程进行染色。染色切片使用NanoZoomer S360全切片扫描系统成像，并借助ImageJ软件进行图像分析，计算阳性细胞数占总细胞数的百分比，为阳性细胞率。

1.4.8 原代软骨细胞分离与培养

使用2周龄雄性C57小鼠膝关节分离原代软骨细胞，于37 ℃、5% CO₂培养箱中扩增培养，取第1~3代细胞进行实验。IL-1β干预24 h建立OA细胞模型。将细胞接种于0.1%聚赖氨酸包被的柔性硅胶皿上，连接循环机械牵张系统，施加4%~12%单向循环拉伸应变(cyclic tensile strain，CTS)，频率0.3 Hz，持续加载12 h。根据实验结果筛选最优应变参数用于后续研究。

1.4.9 慢病毒转染

IFT88基因敲低慢病毒shRNA插入序列如下：靶点a-694，5'-GCAGGAAGACTGAAAGTGAATTTC-AAGAGAATTCACTTTCAGTCTTCCTGC-3'；靶点b-1744，5'-GTTGTTCCAACTGATTCCCAAGTTCA-AGAGACTTGGGAATCAGTTGGAACAAC-3'；靶点c-2381，5'-GCCCTCAGATAGAAAGACCAATTCAA-GAGATTGGTCTTTCTATCTGAGGGC-3'；对照shRNA，5'-GGGTGAACTCACGTCAGAATTCAAGAGATTCT-GACGTGAGTTCACCC-3'。搭载无同源靶点shRNA双链的慢病毒载体作为阴性对照，病毒感染实验严格按照制造商操作手册执行。根据最佳感染复数(multiplicity of infection，MOI)预实验确定每组细胞所需病毒液体积，MOI=慢病毒滴度×病毒液体积/待转的总细胞数。转染效率通过蛋白质印迹法进行验证。

1.4.10 流式细胞术检测细胞凋亡

使用Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒，通过流式细胞术检测细胞凋亡。具体步骤：处理后的细胞经PBS清洗2次，胰蛋白酶消化后离心收集，重悬于500 μL结合缓冲液中，加入5 μL Annexin V-FITC与10 μL PI染液，室温避光孵育15 min。样本经BD FACSCanto II流式细胞仪检测分析。细胞凋亡率=(早期凋亡细胞数+晚期凋亡细胞数)/总细胞数×100%。

1.4.11 免疫荧光染色

用PBS清洗细胞2次，4%多聚甲醛固定液室温固定10 min，随后用PBS清洗3次(每次5 min)。样本经0.5% Triton X-100/PBS透化液处理，5%山羊血清/PBS封闭液封闭30 min。一抗4 ℃孵育过夜，充分洗涤后与Alexa Fluor偶联二抗室温避光孵育1 h。样本采用含DAPI的抗荧光淬灭封片剂封片10 min。阳性细胞百分比与荧光强度通过定量分析获得，图像通过荧光显微镜采集。

1.4.12 蛋白质印迹法

采用含1 mmol/L 苯甲基磺酰氟(phenylmethane-sulfonyl fluoride，PMSF)的RIPA裂解液冰上裂解细胞30 min，刮取收集细胞悬液。经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)分离后，蛋白质转印至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜。封闭条件为5% BSA封闭60 min，随后4 ℃孵育一抗过夜、室温二抗孵育45~60 min。使用ECL化学发光检测试剂盒显影，通过ChemiDoc XRS⁺成像系统采集蛋白质条带，使用ImageJ软件进行灰度值分析。实验独立重复3次。

1.4.13 RNA提取与反转录聚合酶链反应

通过TRIzol^TM分离软骨细胞总RNA，并按试剂说明书使用RevertAid反转录试剂盒进行cDNA合成，使用SYBR^® Green Pro Taq HS预混液及特异性引物标记。实时荧光定量PCR在CFX Connect检测系统上完成，通过2^-ΔΔCt法计算基因相对表达量，并以GAPDH为内参进行标准化分析。引物序列见表1。

1.5 统计学处理

采用SPSS 24.0统计学软件和GraphPad Prism 9软件进行数据分析。正态分布的计量资料以均数±标准差表示，比较采用配对双尾t检验或独立双尾t检验。使用Kendall协调系数检验组间初级纤毛与COL2A1变化趋势的一致性。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 跑台运动延缓手术诱导的<bold>OA</bold>进程

转棒测试后，处死小鼠并采集双侧膝关节进行组织学分析。结果显示软骨细胞排列明显紊乱，软骨中层结构模糊(图1A)。OARSI评分显示：与sham组及sham/TE组相比，OA组评分显著升高，而OA/TE组较OA组明显下降(图1B)。提示机械刺激对软骨退变具有保护作用。免疫组织化学染色显示：sham/TE组COL2A1较sham组有轻微增加，而OA组较sham组显著降低，但此降低在OA/TE组中得到部分恢复(图1D)。同样OA组ACAN表达也降低，而OA/TE组表达增加(图1D)。值得注意的是，sham组和sham/TE组染色均匀连续，而OA组和OA/TE组出现局部高染色区域(图1C)，提示OA后细胞外基质出现了代偿性增加。细胞凋亡检测结果也支持机械刺激对软骨的保护作用，TUNEL染色结果显示OA组阳性细胞率高于sham组(图1E)，但经4周跑台运动后，OA/TE组的凋亡率显著降低(图1F)。在功能测试方面，OA组在转棒测试评估中的持续时间较sham组明显缩短(图1G)。

2.2 <bold><italic>IFT88</italic></bold>敲除小鼠中跑台运动的保护效应消失

RT-PCR结果显示敲除小鼠中IFT88基因表达显著降低(图2A)，免疫荧光染色进一步证实敲除小鼠的纤毛阳性细胞比例显著降低(图2B)，表明模型构建成功。与KO-sham组相比，KOOA组OARSI评分显著升高，且4周跑台运动干预后未见改善(图2C、2D)，提示跑台运动在纤毛缺失的情况下未能发挥保护作用。免疫组织化学染色结果同样支持这一观点。与KO-sham组相比，敲除小鼠无论是否进行OA手术干预，跑台运动后COL2A1与ACAN的表达强度均无显著变化(图2E、2F)。TUNEL染色分析显示：手术干预对敲除小鼠凋亡率无影响，但跑台运动可降低KO-sham/TE组TUNEL阳性细胞比例(图2G、2H)，然而，在KOOA/TE组中，跑台运动未能减少凋亡率。转棒测试中，KOOA组与KOOA/TE组持续时间差异也无统计学意义(P>0.05，图2I)。上述结果表明跑台运动对初级纤毛缺失小鼠的OA进展无干预效应。

2.3 适度的机械刺激抑制<bold>IL-1β</bold>诱导的软骨退化

通过免疫荧光检测确定最佳拉伸参数，结果显示COL2A1基因表达在8%应变条件下达到峰值(图3A、3B)，故选择0.03 Hz频率、8%应变、持续12 h的CTS进行后续实验。随后，本研究评估IL-1β对软骨细胞外基质的影响，结果显示：IL-1β(10 ng/mL，24 h)干预显著抑制细胞外基质COL2A1基因的表达(图3C、3D)，而CTS可部分逆转该抑制效应(图3C、3D)。进一步发现，无论是否存在IL-1β干预，CTS均可调控初级纤毛表达模式(图3E)，其变化趋势与COL2A1 RNA水平表达一致性较高，Kendall协调系数为0.911，大于0.8，说明评价一致性强。此外，流式细胞术显示IL-1β处理显著增加细胞凋亡率，而CTS可抑制此效应(图3F、3G)。由于caspase-12是与细胞内钙离子(Ca²⁺)浓度相关的特异性凋亡标志蛋白，因此进一步通过蛋白质印迹试验验证其表达，结果显示IL-1β显著上调促凋亡蛋白caspase-12表达，而CTS处理可下调其表达水平，与流式细胞术结果相吻合(图3H、3I)。

2.4 在<bold><italic>IFT88</italic></bold>敲低细胞模型中，适度机械刺激的保护效应消失

为进一步探究适度机械刺激是否通过初级纤毛调控IL-1β诱导的细胞外基质降解及凋亡，本研究通过慢病毒转染敲低IFT88表达(图4A、4B)，从而构建初级纤毛缺失的软骨细胞模型。结果显示：在IFT88敲低的细胞中，IL-1β仍可诱导COL2A1表达下调，但CTS未能逆转COL2A1的抑制趋势(图4C、4D)。未经IL-1β处理的情况下，CTS仍可上调COL2A1的表达(图4C)，这可能提示初级纤毛并非CTS作用的唯一途径。细胞凋亡实验表明：在IFT88敲除细胞中，直接进行CTS无法降低细胞凋亡率，而IL-1β干预持续诱导细胞凋亡，且在敲除细胞中CTS无法抑制该效应(图4E、4F)。此外，caspase-12的表达在IFT88敲低的细胞中对IL-1β的刺激不敏感，即炎症未再诱导其上调；但在无IL-1β处理时，CTS处理反而显著上调caspase-12蛋白水平(图4G、4H)。这可能提示当初级纤毛缺失时，机械刺激可能通过其他通路激活促凋亡相关蛋白。

3 讨 论

初级纤毛作为机械刺激受体，突出于细胞膜表面，能够感知并传导外部机械信号，其组装与解离依赖于IFT蛋白家族，尤其是IFT-B复合体中的IFT88，在纤毛内顺向运输中起关键作用^[24]。既往研究^[25]表明沉默IFT88可显著抑制纤毛对机械刺激的响应能力。本研究采用条件性敲除IFT88构建的初级纤毛敲除小鼠模型，从整体水平验证了初级纤毛在机械刺激调控OA进展中的作用。适度的机械刺激可以减少炎症因子诱导的软骨细胞凋亡^[26-27]。适度的跑台运动可以减轻OA模型大鼠关节软骨的炎症反应和软骨细胞凋亡^[5]。

本研究体内实验中，野生型OA小鼠在接受为期4周的跑台运动后，OARSI评分明显下降，软骨细胞凋亡水平显著降低，证实跑台运动对关节软骨起保护作用。然而，在IFT88敲除的小鼠中，跑台运动干预不仅未能降低OARSI评分，也无法减少TUNEL阳性细胞比例，说明初级纤毛的缺失完全阻断了机械刺激所介导的保护效应。更重要的是，即使是KO-sham组的小鼠，其OARSI评分与凋亡水平也显著高于sham组，提示初级纤毛缺失会促进骨关节炎的进展，这一发现与之前的研究^[12-13]类似，再次验证了纤毛是软骨组织的重要机械感应器这一观点^[28]。转棒实验也表明敲除IFT88显著削弱了跑台运动干预对运动能力的提升效果。这些结果表明初级纤毛感知机械刺激信号并进行信号转导，是机械刺激在关节层面发挥保护效应的必要前提。

在体外实验中，本研究观察到CTS可降低IL-1β诱导的细胞凋亡与细胞外基质丢失，提示适度的机械刺激可通过减轻炎性应激反应发挥保护作用，其机制可能与内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)通路中细胞内Ca²⁺浓度相关的特异性凋亡标志蛋白caspase-12有关。IL-1β刺激显著上调caspase-12表达，提示细胞处于ERS激活状态，而CTS可有效降低其表达水平，从而减轻凋亡。在IFT88敲低的细胞模型中，机械刺激的保护效应完全消失，表明纤毛不仅介导机械刺激的接收过程，还调节了凋亡级联反应，即初级纤毛缺失使得机械信号转导异常，导致Ca²⁺稳态失衡，进而通过ERS诱导细胞凋亡，而这一过程以caspase-12激活为特征^[29-31]。值得注意的是，在无炎症刺激状态下，CTS反而上调caspase-12的表达。作为ERS通路中关键但非终末效应分子，caspase-12表达增高并不意味着ERS进展至不可逆阶段，反之，细胞可能仍处于可调控的应激响应状态^[32]。伍伟挺等^[33]的研究结果证明：当机械刺激未超过阈值时，ERS仍处于适应性反应阶段，但该研究的机械刺激阈值为8%，可能与更高的拉伸频率和刺激时间有关。此外，郝晓霞^[34]指出，低强度机械刺激能够促进线粒体稳态，caspase-12水平上调但凋亡率不增加，原因可能是低强度刺激同时激活了抗凋亡机制，比如抗凋亡蛋白B细胞淋巴瘤2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)等。另有研究^[35]指出caspase家族在焦亡、坏死性凋亡、自噬等多种程序性死亡中均有交叉调控作用。Xiao等^[36]研究结果亦提示，CTS可能通过非凋亡性路径激活caspase-12。

初级纤毛与多种机械刺激通路存在协同作用，如压电型机械敏感离子通道组件(piezo-type mechanosensitive ion channel component，PIEZOs)和瞬时受体电位4(transient receptor potential vanilloid 4，TRPV4)等离子通道及整合素等^[37-38]。初级纤毛为响应机械刺激可能出现长度及弯曲程度改变，从而激活机械敏感的离子通道^[39-40]。初级纤毛深入细胞外基质中，且两者存在共定位，这种空间关系使得整合素和初级纤毛间的串扰关系密切，这一串扰在小脑祖细胞中已有研究^[41]。上述协同机制在软骨细胞外基质维持中发挥重要作用。

本研究也存在一定局限性：首先，CTS是在二维平面上施加，仅能模拟软骨细胞单层培养体系内的力学作用，而膝关节在体生物力学环境具有三维的复杂性；其次，虽然初步揭示了纤毛依赖性机械保护机制，但其具体下游通路如Ca²⁺信号、ERS等是否参与仍需进一步研究；再者，4周的干预周期可能不足以诱发细胞外基质蛋白的显著改变，这与关节软骨代谢缓慢的生理特性密切相关；另外，使用的是创伤性OA的小鼠模型，与人类退行性的慢性OA的形成过程有差异，存在转化医学的局限性。

综上，本研究系统整合体内与体外实验证据，提出初级纤毛是机械刺激发挥抗炎、抗凋亡及维持细胞外基质稳态的关键介导因子，可能通过细胞内Ca²⁺调控ERS-caspase-12轴发挥作用。未来，靶向增强纤毛机械感应功能或维持其结构完整性，有望成为运动医学干预OA的潜在治疗靶点。

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基金资助

湖南省自然科学基金(2021JJ30933)

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