O-GlcNAc修饰的YTHDF2通过m ⁶ A修饰调节抑癌基因PER1促进膀胱癌的发展

O-GlcNAcylated YTHDF2 promotes bladder cancer progression by regulating the tumor suppressor gene PER1 via m⁶A modification

摘要

目的 膀胱癌是一种常见恶性肿瘤，发病率高且预后较差。N⁶-甲基腺苷(N⁶-methyladenosine，m⁶A)修饰广泛参与各种生理过程，其中m⁶A识别蛋白YTH N⁶-甲基腺嘌呤RNA结合蛋白F2(YTH N⁶-methyladenosine RNA binding protein F2，YTHDF2)在膀胱癌进展中发挥重要作用。本研究深入探究O-连接N-乙酰氨基葡萄糖(O-linked N-acetylglucosamine，O-GlcNAc)修饰的YTHDF2调控下游靶基因周期昼夜节律调节器1(period circadian regulator 1，PER1)进而影响膀胱癌细胞增殖的分子机制。 方法 采用癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas，TCGA)预测YTHDF2在膀胱癌的表达。采用实时荧光定量PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction，RT-qPCR)、蛋白质印迹法或免疫组织化学染色检测YTHDF2、PER1和增殖相关蛋白质[增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)、微小染色体维持复合体组分2(minichromosome maintenance complex component 2，MCM2)、细胞周期蛋白D1(cyclin D1，CCND1)]在临床水平(20对膀胱癌和癌旁正常组织)和细胞水平[正常膀胱上皮细胞(SV-HUC-1)和膀胱癌细胞(T24、5637、EJ-1、SW780、BIU-87)]的表达。敲低5637和SW780细胞中的YTHDF2，采用细胞计数试剂盒-8(Cell Counting Kit-8，CCK-8)、平板克隆和EdU检测细胞增殖情况。采用生物信息学预测YTHDF2的糖基化修饰位点，免疫沉淀(immunoprecipitation，IP)检测临床组织及细胞中YTHDF2蛋白的O-GlcNAc修饰水平。采用DMSO、OSMI-1(抑制糖基化)、Thiamet G(促进糖基化)处理膀胱癌细胞并加入放线菌酮(cycloheximide，CHX)，IP检测YTHDF2泛素化水平。对膀胱癌细胞进行YTHDF2的敲低及Thiamet G处理，检测PER1 mRNA稳定性、PER1 m⁶A修饰及细胞增殖情况。TCGA网站预测组织中PER1的表达水平；SRAMP网站预测PER1可能存在的m⁶A修饰位点。甲基化RNA免疫沉淀(methylated RNA immunoprecipitation，MeRIP)检测PER1 m⁶A修饰水平；最后检测敲低YTHDF2和PER1对5637和SW780细胞增殖的影响。 结果 与癌旁正常组织比较，YTHDF2在膀胱癌组织中的mRNA表达水平上调2.5倍，蛋白质水平升高2倍，且O-GlcNAc修饰水平增加3.5倍(均P<0.01)。YTHDF2在膀胱癌细胞系中上调，且敲低YTHDF2抑制膀胱癌细胞活力(P<0.001)，下调增殖相关蛋白PCNA、MCM2、CCND1的表达(均P<0.05)，细胞克隆数较正常组降低3倍(P<0.01)，抑制细胞增殖。YTHDF2在膀胱癌细胞中O-GlcNAc修饰水平升高。OSMI-1显著降低YTHDF2蛋白稳定性(P<0.01)，促进其泛素化；Thiamet G则发挥相反作用(P<0.001)。添加Thiamet G可以逆转敲低YTHDF2引起的细胞功能变化，促进膀胱癌细胞增殖(P<0.01)，上调PCNA、MCM2、CCND1的表达(均P<0.05)。YTHDF2靶向识别PER1 m⁶A修饰进而促进PER1 mRNA的降解。回复实验结果显示敲低PER1逆转敲低YTHDF2对膀胱癌细胞增殖的抑制，促进膀胱癌细胞增殖(P<0.001)，上调PCNA、MCM2、CCND1的表达(均P<0.05)，提示YTHDF2通过调节PER1促进膀胱癌细胞的增殖。 结论 O-GlcNAc修饰的YTHDF2通过m⁶A修饰下调抑癌基因PER1，进而促进膀胱癌的发展。

Abstract

Objective Bladder cancer is a common malignancy with high incidence and poor prognosis. N⁶-methyladenosine (m⁶A) modification is widely involved in diverse physiological processes, among which the m⁶A recognition protein YTH N⁶-methyladenosine RNA binding protein F2 (YTHDF2) plays a crucial role in bladder cancer progression. This study aims to elucidate the molecular mechanism by which O-linked N-acetylglucosamine (O-GlcNAc) modification of YTHDF2 regulates its downstream target, period circadian regulator 1 (PER1), thereby promoting bladder cancer cell proliferation. Methods Expression of YTHDF2 in bladder cancer was predicted using The Cancer Genome Atlas (TCGA). Twenty paired bladder cancer and adjacent normal tissues were collected at the clinical level. Normal bladder epithelial cells (SV-HUC-1) and bladder cancer cell lines (T24, 5637, EJ-1, SW780, BIU-87) were examined by quantitative real-time PCR (RT-qPCR), Western blotting, and immunohistochemistry for expression of YTHDF2, PER1, and proliferation-related proteins [proliferating cell nuclear antigen (PCNA), minichromosome maintenance complex component 2 (MCM2), Cyclin D1]. YTHDF2 was silenced in 5637 and SW780 cells, and cell proliferation was assessed by Cell Counting Kit-8 (CCK-8), colony formation, and EdU assays. Bioinformatics was used to predict glycosylation sites of YTHDF2, and immunoprecipitation (IP) was performed to detect O-GlcNAc modification levels of YTHDF2 in tissues and cells. Bladder cancer cells were treated with DMSO, OSMI-1 (O-GlcNAc inhibitor), or Thiamet G (O-GlcNAc activator), followed by cycloheximide (CHX), to assess YTHDF2 ubiquitination by IP. YTHDF2 knockdown and Thiamet G treatment were further used to evaluate PER1 mRNA stability, PER1 m⁶A modification, and cell proliferation. TCGA was used to predict PER1 expression in tissues; SRAMP predicted potential PER1 m⁶A sites. Methylated RNA immunoprecipitation (MeRIP) assays measured PER1 m⁶A modification. Finally, the effects of knocking down YTHDF2 and PER1 on 5637 and SW780 cell proliferation were assessed. Results YTHDF2 expression was significantly upregulated in bladder cancer tissues compared with adjacent tissues (mRNA: 2.5-fold; protein: 2-fold), which O-GlcNAc modification levels increased 3.5-fold (P<0.001). YTHDF2 was upregulated in bladder cancer cell lines, and its knockdown suppressed cell viability (P<0.001), downregulated PCNA, MCM2, and CyclinD1 (all P<0.05), reduced colony numbers 3-fold (P<0.01), and inhibited proliferation. YTHDF2 exhibited elevated O-GlcNAc modification in cancer cells. OSMI-1 reduced YTHDF2 protein stability (P<0.01) and enhanced ubiquitination, while Thiamet G exerted opposite effects (P<0.001). Thiamet G reversed the proliferation-suppressive effects of YTHDF2 knockdown, promoting cell proliferation (P<0.01) and upregulating PCNA, MCM2, and CyclinD1 (all P<0.05). Mechanistically, YTHDF2 targeted PER1 via m⁶A recognition, promoting PER1 mRNA degradation. Rescue experiments showed that PER1 knockdown reversed the inhibitory effect of YTHDF2 knockdown on cell proliferation, upregulated PCNA, MCM2, and Cyclin D1 (all P<0.05), and promoted bladder cancer cell proliferation (P<0.001). Conclusion O-GlcNAc modification YTHDF2 promotes bladder cancer development by downregulating the tumor suppressor gene PER1 through m⁶A-mediated post-transcriptional regulation.

Graphical abstract

关键词

膀胱癌 / O-连接N-乙酰葡萄糖糖基化 / N⁶-甲基腺苷修饰 / YTH N⁶-甲基腺嘌呤RNA结合蛋白F2 / 周期昼夜节律调节器1

Key words

bladder cancer / O-linked N-acetylglucosamine glycosylation / N⁶-methyladenosine modification / YTH N⁶-methyladenosine RNA binding protein F2 / period circadian regulator 1

膀胱癌是泌尿生殖系统最常见的恶性肿瘤，其发病率在人类癌症中排名第9^[1]。目前，手术、化学治疗和放射治疗是其最常见的治疗方法^[2-3]。辅助化学治疗常用于高危膀胱癌患者，但约30%的患者在根治性膀胱切除术后出现并发症，无法接受该治疗^{[2, 4]}。因此，深入探究调控膀胱癌进展的分子机制及新的生物靶点至关重要。

N⁶-甲基腺苷(N⁶-methyladenosine，m⁶A)是哺乳动物细胞中最常见的核糖核酸(ribonucleic acid，RNA)修饰，影响RNA剪接、核输出、定位、翻译和降解。m⁶A修饰过程由甲基转移酶复合物催化、去甲基化酶去除，同时m⁶A修饰位点的识别由阅读器蛋白执行^[5]。异常的m⁶A修饰与多种恶性肿瘤进展有关^[6]。例如，甲基转移酶样蛋白14(methyltransferase like protein 14，METTL14)介导长链非编码RNA D4Z4结合元件转录本(long non-coding RNA D4Z4 binding element transcript，lncDBET)的m⁶A修饰，上调lncDBET可促进膀胱癌的进展^[7]。YTH N⁶-甲基腺嘌呤RNA结合蛋白F2(YTH N⁶-methyladenosine RNA binding protein F2，YTHDF2)作为m⁶A修饰阅读器蛋白之一，在膀胱癌中扮演重要角色。Zhang等^[8]发现YTHDF2在膀胱癌中上调，并通过抑制RIG-I促进免疫逃避，进而加快膀胱癌发展。METTL3/YTHDF2 m⁶A轴通过下调SETD7和KLF4促进膀胱癌发生^[9]。上述研究表明YTHDF2可以促进膀胱癌的发生和发展。此外，YTHDF2还可以通过与下游靶基因的mRNA结合影响其稳定性。例如，在前列腺癌中YTHDF2直接结合到LHPP和NKX3-1的m⁶A修饰位点介导mRNA降解^[10]。然而，YTHDF2在膀胱癌中的下游调控机制还需深入探究。

周期昼夜节律调节器1(period circadian regulator 1，PER1)作为常见的肿瘤抑制因子，主要通过抑制细胞周期(主要是G₂期)发挥抑制肿瘤的作用。在黑色素瘤研究中，YTHDF2通过m⁶A修饰调节PER1促进肿瘤发展^[11]。然而，YTHDF2-PER1轴在膀胱癌中的研究较少。

糖基化是重要的翻译后修饰环节，对蛋白质的功能、亚细胞定位等特性产生深远影响。O-连接 N-乙酰氨基葡萄糖(O-linked N-acetylglucosamine， O-GlcNAc)糖基化是一种较为常见的糖基化类型，主要是通过O-GlcNAc糖基转移酶(O-GlcNAc transferase，OGT)将供体尿苷5’-二磷酸-N-乙酰基葡萄糖(uridine diphosphate N-acetylglucosamine，UDP-GlcNAc)的GlcNAc转移到目的蛋白质的丝氨酸和苏氨酸残基的羟基上，氧连接N-乙酰氨基葡萄糖糖苷酶(O-linked N-acetylglucosamine hydrolase，OGA)负责将GlcNAc移除^[12]。越来越多的证据表明O-GlcNAc糖基化的异常与肿瘤的发展有关，Yu等^[13]发现OGT介导酪蛋白激酶2α1(casein kinase 2 alpha 1，CSNK2A1)的O-GlcNAc修饰，促进结直肠癌进展。O-GlcNAc修饰在膀胱癌中表达显著升高，而升高的糖基化水平抑制自噬，促进肿瘤细胞增殖^[14]。褪黑激素通过抑制细胞周期蛋白依赖性样激酶5的O-GlcNAc修饰来减少膀胱癌细胞的增殖并促进细胞凋亡^[15]。值得注意的是，在肝癌中，YTHDF2蛋白第263位丝氨酸(Ser263)易发生O-GlcNac糖基化修饰，O-GlcNAc修饰减弱YTHDF2的泛素化降解、增强其蛋白质稳定性，从而促进肿瘤进展^[16]，但相关的机制研究在膀胱癌中较少，值得进一步研究。

综合上述研究，本研究提出假设：m⁶A阅读器YTHDF2被O-GlcNAc修饰后，降低YTHDF2蛋白的泛素化水平，YHHDF2蛋白水平上调，之后通过m⁶A修饰，促进下游靶基因PER1的mRNA降解，下调PER1的表达，促进肿瘤细胞增殖，加速膀胱癌的发展。本研究旨在深入探究O-GlcNAc修饰的YTHDF2调控膀胱癌进展的分子机制，以期为克服膀胱癌治疗困境提供全新线索。

1 材料与方法

1.1 伦理声明

本研究已获得中南大学湘雅二医院伦理委员会批准[审批号：2019伦审(科)第102号]。所有患者均签署知情同意书。

1.2 材料

1.2.1 病例资料及细胞

选取2019年5月至2020年1月就诊于中南大学湘雅二医院的膀胱癌患者。纳入标准：患者活检组织病理学诊断为膀胱癌。排除标准：近期接受过癌症相关治疗。收集20对膀胱癌患者肿瘤组织及其相应旁癌组织样本。

人正常膀胱上皮细胞SV-HUC-1和膀胱癌细胞T24、5637、EJ-1、SW780、BIU-87均购自中国科学院上海细胞库。

1.2.2 主要试剂

杜尔贝科改良伊格尔培养基(Dulbecco’s modified Eagle medium，DMEM)、胎牛血清、TRIzol试剂均购自美国Invitrogen公司；二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白质定量试剂盒购自美国Thermo Fisher Scientific公司；增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)、微小染色体维持复合体组分2(minichromosome maintenance complex component 2，MCM2)、细胞周期蛋白D1(cyclin D1，CCND1)、YTHDF2、O-GlcNAc、泛素(ubiquitin，Ub)和PER1一抗均购自英国Abcam公司；山羊抗兔及抗鼠二抗均购自北京中杉金桥生物技术有限公司；增强化学发光(enhanced chemiluminescence，ECL)发光液、细胞计数试剂盒-8(Cell Counting Kit-8，CCK-8)、5-乙炔基-2’-脱氧尿苷(5-ethynyl-2’- deoxyuridine，EdU)检测试剂盒均购自上海碧云天生物技术有限公司；多种短发夹RNA(short hairpin RNA，shRNA)序列包括shYTHDF2-1、shYTHDF2-2、shPER1-1、shPER1-2及shNC均购自上海吉玛制药技术有限公司；结晶紫染液购自中国Biosharp公司；甲基化RNA免疫沉淀(methylated RNA immunoprecipitation，MeRIP)检测试剂盒购自广州市锐博生物科技有限公司；放线菌酮(cycloheximide，CHX)、放线菌素D、OSMI-1(O-GlcNAc转移酶抑制剂)、Thiamet G(OGA抑制剂)均购自美国Sigma-Aldrich公司；Prime-Script RT和SYBR Premix试剂盒均购自日本TaKaRa公司。

1.3 方法

1.3.1 <italic>YTHDF2</italic>基因在泛癌中的表达分析

通过癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas，TCGA)数据库TCGA泛癌图谱(Pan-Cancer Atlas)分析YTHDF2基因在泛癌肿瘤组织与对应正常组织中的表达水平差异。

1.3.2 YTHDF2蛋白糖基化修饰位点预测

利用丹麦技术大学健康技术系(DTU Health Tech)提供的生物信息学工具平台对YTHDF2蛋白的O-糖基化修饰位点进行预测。输入YTHDF2蛋白的氨基酸序列(UniProt ID: Q9Y5A9)，通过上述工具的默认参数设置进行分析，综合预测结果(修饰概率≥50%)，确定YTHDF2蛋白中潜在的糖基化修饰位点。

1.3.3 <italic>PER1</italic> mRNA m⁶A甲基化修饰位点预测

本研究从NCBI GenBank数据库获取人PER1基因全长成熟mRNA序列，经序列比对验证无误后确保无内含子污染；通过SRAMP网站选择“成熟mRNA模式”及“通用型”预测范围，最终预测出PER1 mRNA序列上存在多个不同置信度(含高置信度)的潜在m⁶A甲基化位点，为后续采用MeRIP-qPCR实验验证修饰真实性奠定基础。

1.3.4 免疫组织化学染色

将组织切片脱蜡至水后置于含抗原修复液的高压锅中进行抗原修复，滴加过氧化氢进行封闭。添加一抗YTHDF2(1꞉2 000)并于4 ℃下孵育过夜，次日孵育相应二抗并洗涤。DAB染色2 min，苏木精染色5 min，并进行酸化和返蓝。最后切片脱水后封片，采用电子显微镜观察并拍照。

1.3.5 细胞转染

将对数生长期细胞接种于6孔板中，培养条件为：含10%胎牛血清和1%双抗的DMEM培养基，37 ℃，5% CO₂。待细胞汇合度达到70%左右时，采用Lipofectamine 2000试剂进行转染，48 h后，检测相应转染效率。

1.3.6 蛋白质印迹法

采用细胞裂解液提取细胞和组织中的总蛋白质并使用BAC试剂盒进行蛋白质定量。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)电泳后将蛋白质转移到聚偏二氟乙烯(Polyvinylidene Fluoride，PVDF)膜上，5%脱脂牛奶封闭，洗涤后将膜与一抗(1꞉1 000)孵育过夜，次日添加相应的二抗孵育1 h。最后使用ECL孵育PVDF膜进行显影。

1.3.7 实时荧光定量聚合酶链式反应

使用Trizol试剂提取组织或细胞的总RNA。使用Prime-Script RT试剂盒合成互补脱氧核糖核酸(complementary deoxyribonucleic acid，cDNA)，SYBR Premix进行实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real-time polymerase chain reaction，RT-qRCR)。内参为β-actin，使用2^-ΔΔCt方法计算基因表达情况。YTHDF2正向引物为5'-AGTAGGGCAAC-AGACACAGC-3'，YTHDF2反向引物为5'-TGGACC-GAAGCTTCTCCAAC-3'；PER1反向引物为5'-GCC-AACCAGGAATACTACCAGC-3'，PER1反向引物为5'-GTGTGTACTCAGACGTGATGTG-3'；β-actin正向引物为5'-CCCTGGAGAAGAGCTACGAG-3'，β-actin反向引物为5'-CGTACAGGTCTTTGCGGATG-3'。

1.3.8 CCK-8检测

将细胞接种在96孔板(5×10³个/孔)中并进行相应转染，随后在不同时间点(0、24、48、72 h)向细胞添加CCK-8溶液20 μL孵育4 h，最后使用酶标仪在450 nm处测定吸光度。

1.3.9 平板克隆检测

将对数生长期细胞接种在6孔板(1×10³个/孔)中，持续培养14 d。随后用4%多聚甲醛固定细胞15 min，结晶紫溶液染色20 min后，进行拍照。

1.3.10 EdU检测

将汇合度达到50%的细胞与EdU标记培养基孵育2 h，随后添加4%多聚甲醛固定细胞30 min，并在室温下用1% Triton X-100处理30 min。磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)洗涤后用Apollo将细胞染色30 min。然后使用Hoechst对细胞中的脱氧核糖核酸(complementary deoxyribonucleic acid，DNA)进行染色，最后用荧光显微镜进行观察。

1.3.11 免疫沉淀检测

用含有蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液裂解细胞。将细胞裂解物与2 μg YTHDF2抗体并于4 °C下孵育2 h，随后添加A/G琼脂糖珠孵育过夜。次日将磁珠从裂解缓冲液中分离并洗涤，采用蛋白质印迹法检测YTHDF2蛋白的O-糖基化修饰水平以及泛素化水平。

1.3.12 MeRIP检测

提取细胞RNA并用DNase I消化，随后使用超声破碎仪将RNA片段化。然后将抗m⁶A及免疫球蛋白G(immunoglobulin G，IgG)抗体分别与磁珠在免疫沉淀(immunoprecipitation，IP)缓冲液中于室温下预孵育1 h。随后将抗体-磁珠混合物添加到片段RNA中于4 ℃下孵育4 h。充分洗涤后使用蛋白酶K消化IP混合物，随后利用磁力架收集磁珠，吸取上清液。最后抽提RNA以分析PER1 mRNA的m⁶A修饰水平。

1.3.13 YTHDF2蛋白和<italic>PER1</italic> mRNA稳定性检测

分别采用DMSO、OSMI-1及Thiamet G处理细胞，随后用10 μg/mL放线菌酮处理细胞，提取不同时间点(0、12、24、36 h)的细胞蛋白质，通过蛋白质印迹法检测蛋白质表达情况。

接种细胞于6孔板，转染shYTHDF2并采用Thiamet G处理细胞，随后用放线菌素D处理细胞，检测不同时间点(0、12、24、36 h)的PER1 mRNA的表达情况。

1.4 统计学处理

采用GraphPad Prism 9.0统计学软件进行分析，计数资料用例表示，计量资料以均数±标准差表示。2组间比较采用Fisher精确检验，3组及以上之间的比较使用单因素方差分析。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 <bold><italic>YTHDF2</italic></bold>在膀胱癌中高表达，且<bold>O-</bold>糖基化水平上调

首先通过TCGA网站分析发现YTHDF2在膀胱癌、宫颈鳞状细胞癌、胆管癌等多种肿瘤组织中表达上调(图1A)。而在肾嫌色细胞癌、肾透明细胞癌、嗜铬细胞瘤和副神经节瘤等多种肾来源的恶性肿瘤中表达下调。由于YTHDF2在膀胱尿路上皮癌表达上调，进一步分析膀胱癌患者数据发现YTHDF2在膀胱癌组织中的表达显著升高(图1B)。随后在收集的20对膀胱癌患者癌组织与癌旁正常组织中发现YTHDF2的mRNA和蛋白质表达均高于其相应的癌旁正常组织(均P<0.05，图1C、1D)，其中mRNA表达较癌旁组织上调2.5倍(P<0.001)，蛋白质水平较癌旁组织升高2倍(P<0.01)。同时，免疫组织化学染色检测结果也得到相同结果(图1E)。此外，通过生物信息学预测结果发现YTHDF2蛋白存在糖基化修饰位点(图1F)，且IP检测结果显示肿瘤组织中YTHDF2的O-糖基化水平较癌旁正常组织上调，O-GlcNAc修饰水平增加约3.5倍(图1G，P<0.001)。上述结果均提示YTHDF2在膀胱癌中表达上调，且O-糖基化水平增加。

2.2 敲低<bold><italic>YTHDF2</italic></bold>抑制膀胱癌细胞的增殖能力

体外实验结果显示：与人正常膀胱上皮细胞(SV-HUC-1)比较，膀胱癌细胞(5637、EJ-1、SW780和BIU-87)中YTHDF2的表达均显著上调(均P<0.05，图2A)。随后为探究YTHDF2在膀胱癌细胞中的作用，本研究选择在5367和SW780细胞(高表达YTHDF2)中转染shYTHDF2，以敲低YTHDF2的表达水平，蛋白质印迹法结果表明转染shYTHDF2可以有效降低YTHDF2的表达水平(P<0.05，图2B、2C)。随后通过CCK8、平板克隆、EdU实验发现：敲低YTHDF2显著降低细胞的增殖能力(图2D~2F)。蛋白质印迹法检测结果显示：增殖相关蛋白质PCNA、MCM2、CCND1在敲低YTHDF2后的膀胱癌细胞中均明显下调(均P<0.05，图2G)。上述结果均表明敲低YTHDF2抑制膀胱癌细胞的增殖能力。

2.3 <bold>O-</bold>糖基化修饰的<bold>YTHDF2</bold>蛋白稳定性增强，促进膀胱癌细胞增殖

IP检测发现：与SV-HUC-1比较，YTHDF2蛋白的O-糖基化修饰水平在膀胱癌细胞中显著增加(图3A)。随后利用OSMI-1和Thiamet G处理5637和SW780细胞，结果显示OSMI-1显著降低了YTHDF2蛋白质稳定性并促进其泛素化；Thiamet G则发挥相反作用(图3B、3C)。此外，Thiamet G能够逆转敲低YTHDF2所导致的细胞增殖能力下调，以及PCNA、MCM2、CCND1蛋白质水平的下降(图3D~3G)。上述结果均表明O-糖基化修饰YTHDF2增强其蛋白质稳定性，从而促进膀胱癌细胞增殖。

2.4 <bold>YTHDF2</bold>靶向识别<bold>PER1</bold>，促进<bold><italic>PER1 </italic>mRNA</bold>的降解

通过TCGA预测发现PER1在膀胱癌组织中显著下调(图4A)。随后RT-qPCR检测发现膀胱癌组织中PER1 mRNA水平较癌旁正常组织明显降低(图4B)。此外，SRAMP网站预测到PER1具有多个m⁶A甲基化位点(图4C)，MeRIP结果显示PER1 m⁶A修饰水平在膀胱癌组织中上调(图4D)。随后，在5637和SW780细胞中敲低YTHDF2并加入Thiamet G，结果显示敲低YTHDF2上调PER1表达，增强PER1 mRNA稳定性并降低其m⁶A修饰水平，而Thiamet G逆转了这一趋势(图4E~4G)。综上，YTHDF2靶向识别PER1介导其m⁶A修饰，进而促进PER1 mRNA的降解。

2.5 <bold>YTHDF2</bold>通过调节<bold>PER1</bold>，促进膀胱癌细胞的增殖

RT-qRCR和蛋白质印迹法结果均表明转染shPER1可以有效降低PER1的表达水平(图5A、5B)。随后本研究对5637和SW780细胞分别进行YTHDF2和PER1的单独或联合敲低实验，结果显示敲低YTHDF2上调PER1表达，敲低PER1逆转这一趋势(图5C)。同时，本研究还发现下调YTHDF2抑制膀胱癌细胞增殖，下调PCNA、MCM2、CCND1的表达；敲低PER1逆转上述变化(图5D~5G)。这提示YTHDF2通过调节PER1，促进膀胱癌细胞的增殖。

3 讨 论

膀胱癌是一种常见的异质性疾病，对患者和医疗系统构成重大负担。因此亟须探究新的调控机制以克服膀胱癌的治疗困境。本研究揭示了O-糖基化修饰的YTHDF2通过调控PER1影响膀胱癌细胞增殖的分子机制，这丰富了糖基化修饰以及m⁶A修饰在癌症中的研究，为膀胱癌提供了新的生物治疗靶点。

m⁶A修饰是真核生物中RNA最普遍的内部可逆化学修饰之一，由于其在正常发育过程和癌症等人类疾病中具有调节作用，受到了研究者的广泛关注。m⁶A修饰是由调节蛋白(如METTL3、FTO)和m⁶A RNA结合蛋白(如YTHDF2)介导的。m⁶A修饰相关蛋白质在多种癌症类型中异常表达：例如，YTHDF2的高表达预示肺腺癌患者预后不良^[17]；下调YTHDF2触发三阴性乳腺癌细胞凋亡^[18]；YTHDF2促进尿路上皮膀胱癌细胞增殖和肿瘤生长^[8]。本研究发现YTHDF2在膀胱癌中高表达，敲低YTHDF2抑制膀胱癌细胞增殖，这与相关报道一致。

糖基化修饰在调节肿瘤增殖、凋亡和迁移方面发挥重要作用^{[13, 19]}。PIGT通过增加GLUT1糖基化促进膀胱癌细胞生长和转移^[20]。O-糖基化修饰通过上调EFEMP1促进骨肉瘤进展^[19]。O-糖基化修饰也与膀胱癌有关：ALNT6介导的异常O-糖基化促进膀胱癌进展^[21]。此外，O-糖基化修饰对靶蛋白的稳定性具有重要作用。例如，Ser121位点的O-糖基化修饰增强p53的稳定性^[22]。过表达GALNT6增加了EFEMP1的O-糖基化，从而减缓了EFEMP1的降解速率^[19]。本研究首先在临床和细胞水平发现膀胱癌中YTHDF2的O-糖基化水平上调，随后发现OSMI-1显著降低YTHDF2蛋白稳定性并促进其泛素化；而Thiamet G发挥相反作用，且Thiamet G还能逆转敲低YTHDF2表达对膀胱癌细胞增殖的抑制作用。上述结果与相关报道一致，表明O-糖基化修饰YTHDF2可增加其蛋白质的稳定性，从而促进膀胱癌细胞增殖，这补充了O-糖基化修饰在膀胱癌中的研究。

YTHDF2作为m⁶A修饰阅读器主要通过识别mRNA的m⁶A修饰位点促进mRNA降解。在肝内胆管癌中，YTHDF2靶向识别CDKN1B mRNA并促进其降解^[23]；在皮肤癌中，YTHDF2以m⁶A依赖性方式与PIDD1 mRNA结合，从而促进PIDD1 mRNA的降解^[24]；在黑色素瘤研究中，YTHDF2识别m⁶A修饰的PER1 mRNA促进其降解^[11]。本研究发现在膀胱癌中，敲低YTHDF2表达可上调PER1表达，增强PER1 mRNA稳定性并降低其m⁶A修饰水平，这一结果与相关研究一致。因此，本研究提出YTHDF2靶向识别PER1，促进PER1 mRNA的降解。此外，PER1在多类肿瘤中发挥抑癌作用^[25-26]。本研究发现敲低PER1可逆转敲低YTHDF2对膀胱癌细胞增殖的抑制作用，促进膀胱癌细胞增殖，上调PCNA、MCM2、CCND1的表达，这与相关研究一致。上述结果证明YTHDF2通过调节PER1促进膀胱癌细胞增殖。

综上所述，O-GlcNAc修饰的YTHDF2通过降低YTHDF2蛋白的泛素化水平上调其表达，而YTHDF2通过m⁶A修饰促进下游靶基因PER1的mRNA降解增加肿瘤细胞增殖以加速膀胱癌发展。本研究将为O-GlcNAc修饰的YTHDF2如何影响膀胱癌进展提供新的线索。然而，本研究还存在一定的局限性，如未进行体内实验验证，未来需构建膀胱癌小鼠模型以完善该机制。此外，有研究^[16]显示YTHDF2的Ser263位点易发生O-GlcNac糖基化修饰以促进肝癌进展，但本研究并未深入探讨膀胱癌中YTHDF2发生O-GlcNAc修饰的具体位点，未来研究应利用多组学分析并结合功能实验进行充分验证。

参考文献

[1] Bray F, Laversanne M, Sung H, et al. Global cancer statistics 2022: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries[J]. CA Cancer J Clin, 2024, 74(3): 229-263.

[2] Liu J, Gao Y, Song C, et al. Immunotherapeutic prospects and progress in bladder cancer[J/OL]. J Cell Mol Med, 2024, 28(5): e18101[2024-12-12].

[3] Nössing C, Herek P, Shariat SF, et al. Advances in preclinical assessment of therapeutic targets for bladder cancer precision medicine[J]. Curr Opin Urol, 2024, 34(4): 251-257.

[4] Lopez-Beltran A, Cookson MS, Guercio BJ, et al. Advances in diagnosis and treatment of bladder cancer[J/OL]. BMJ, 2024, 384: e076743[2024-12-12].

[5] Hu T, Wang G, Wang D, et al. m6A methylation modification: Potential pathways to suppress osteosarcoma metastasis[J]. Int Immunopharmacol, 2025, 145: 113759.

[6] Wu J, Wang X, Xu H, et al. Bioinformatics analysis of the correlation between m6A RNA methylation regulators and the immune infiltration and prognosis of bladder cancer[J]. Ann Transl Med, 2022, 10(24): 1386.

[7] Liu P, Fan B, Othmane B, et al. m⁶A-induced lncDBET promotes the malignant progression of bladder cancer through FABP5-mediated lipid metabolism[J]. Theranostics, 2022, 12(14): 6291-6307.

[8] Zhang L, Li Y, Zhou L, et al. The m6A reader YTHDF2 promotes bladder cancer progression by suppressing RIG-I-mediated immune response[J]. Cancer Res, 2023, 83(11): 1834-1850.

[9] Xie H, Li J, Ying Y, et al. METTL3/YTHDF2 m⁶ A axis promotes tumorigenesis by degrading SETD7 and KLF4 mRNAs in bladder cancer[J]. J Cell Mol Med, 2020, 24(7): 4092-4104.

[10] Li J, Xie H, Ying Y, et al. YTHDF2 mediates the mRNA degradation of the tumor suppressors to induce AKT phosphorylation in N6-methyladenosine-dependent way in prostate cancer[J]. Mol Cancer, 2020, 19(1): 152.

[11] Yu J, Chai P, Xie M, et al. Histone lactylation drives oncogenesis by facilitating m⁶A reader protein YTHDF2 expression in ocular melanoma[J]. Genome Biol, 2021, 22(1): 85.

[12] Thomas D, Rathinavel AK, Radhakrishnan P. Altered glycosylation in cancer: a promising target for biomarkers and therapeutics[J]. Biochim Biophys Acta Rev Cancer, 2021, 1875(1): 188464.

[13] Yu Z, He H, Jiang B, et al. O-GlcNAcylation of CSNK2A1 by OGT is involved in the progression of colorectal cancer[J]. Mol Biotechnol, 2025, 67(1): 272-283.

[14] Jin L, Yuan F, Dai G, et al. Blockage of O-linked GlcNAcylation induces AMPK-dependent autophagy in bladder cancer cells[J]. Cell Mol Biol Lett, 2020, 25: 17.

[15] Wu J, Tan Z, Li H, et al. Melatonin reduces proliferation and promotes apoptosis of bladder cancer cells by suppressing O-GlcNAcylation of cyclin-dependent-like kinase 5[J/OL]. J Pineal Res, 2021, 71(3): e12765[2024-12-12].

[16] Yang Y, Yan Y, Yin J, et al. O-GlcNAcylation of YTHDF2 promotes HBV-related hepatocellular carcinoma progression in an N⁶-methyladenosine-dependent manner[J]. Signal Transduct Target Ther, 2023, 8(1): 63.

[17] Hou G, Zhao X, Li L, et al. SUMOylation of YTHDF2 promotes mRNA degradation and cancer progression by increasing its binding affinity with m⁶A-modified mRNAs[J]. Nucleic Acids Res, 2021, 49(5): 2859-2877.

[18] Einstein JM, Perelis M, Chaim IA, et al. Inhibition of YTHDF2 triggers proteotoxic cell death in MYC-driven breast cancer[J]. Mol Cell, 2021, 81(15): 3048-3064.e9.

[19] Tong Z, Shen Y, Yuan Q, et al. GALNT6, transcriptionally inhibited by KLF9, promotes osteosarcoma progression by increasing EFEMP1 expression via O-glycosylation modification[J]. Biochim Biophys Acta Mol Cell Res, 2025, 1872(2): 119879.

[20] Tan M, Pan Q, Yu C, et al. PIGT promotes cell growth, glycolysis, and metastasis in bladder cancer by modulating GLUT1 glycosylation and membrane trafficking[J]. J Transl Med, 2024, 22(1): 5.

[21] Sun X, Wu H, Tang L, et al. GALNT6 promotes bladder cancer malignancy and immune escape by epithelial-mesenchymal transition and CD8⁺ T cells[J]. Cancer Cell Int, 2024, 24(1): 308.

[22] Xu Z, Ku X, Tomioka A, et al. O-linked N-acetylgalactosamine modification is present on the tumor suppressor p53[J]. Biochim Biophys Acta Gen Subj, 2020, 1864(8): 129635.

[23] Huang CS, Zhu YQ, Xu QC, et al. YTHDF2 promotes intrahepatic cholangiocarcinoma progression and desensitises cisplatin treatment by increasing CDKN1B mRNA degradation[J/OL]. Clin Transl Med, 2022, 12(6): e848[2024-12-12].

[24] Zhang Q, Man J, Zhao T, et al. YTHDF2 promotes arsenic-induced malignant phenotypes by degrading PIDD1 mRNA in human keratinocytes[J]. Chem Biol Interact, 2025, 406: 111352.

[25] Yang X, Zheng M, Ning Y, et al. Prognostic risk factors of serous ovarian carcinoma based on mesenchymal stem cell phenotype and guidance for therapeutic efficacy[J]. J Transl Med, 2023, 21(1): 456.

[26] Huang Y, Wang J, Zhang H, et al. LncRNA TPTEP1 inhibits the migration and invasion of gastric cancer cells through miR-548d-3p/KLF9/PER1 axis[J]. Pathol Res Pract, 2022, 237: 154054.

基金资助

长沙市自然科学基金(kq2208335)

RIGHTS & PERMISSIONS

开放获取(Open access)：本文遵循知识共享许可协议，允许第三方用户按照署名-非商业性使用-禁止演绎4.0(CC BY-NC-ND 4.0)的方式，在任何媒介以任何形式复制、传播本作品(https://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/)。