头蛋白通过STAT3依赖途径的小胶质细胞极化调控和铁稳态重塑缓解神经病理性疼痛

Noggin alleviates neuropathic pain by regulating microglial polarization and remodeling iron homeostasis via a STAT3-dependent pathway

摘要

目的 痛觉敏化作为神经病理性疼痛(neuropathic pain，NP)的核心特征，与中枢神经系统内炎症失衡密切相关。本研究探讨鞘内注射头蛋白(noggin，NOG)对腰5脊神经结扎(spinal nerve ligation，SNL)模拟的NP模型大鼠的痛觉超敏、小胶质细胞(microglia，MG)活化、极化及铁代谢的影响，并分析下游信号转导及转录激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)在MG表型转化中的作用。 方法 66只Sprague-Dawley(SD)大鼠被随机分为假手术(Sham)组、SNL组和SNL+NOG组。通过Von-Frey纤维检测大鼠的机械痛缩足阈值(paw withdrawal threshold，PWT)。分别采用蛋白质印迹法和逆转录聚合酶链反应(real-time polymerase chain reaction，RT-PCR)检测相关蛋白质和mRNA的表达水平，包括MG活化标志物CD11b、STAT3和磷酸化STAT3(phosphorylated STAT3， p-STAT3)，M1型极化标志物CD86、CD32、白细胞介素(interleukin，IL)-1β、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-alpha，TNF-α)和CC趋化因子受体2(CC chemokine receptor 2，CCR2)，以及M2型极化标志物CD204、CD163、CX3C趋化因子受体1(CX3C chemokine receptor 1，CX3CR1)、IL-10和精氨酸酶1(arginase-1，ARG-1)，铁转运蛋白(ferroportin，FPN；编码基因为SLC40A1)、铁调素(hepcidin，编码基因为HAMP)、转铁蛋白受体(transferrin receptor，TFR；编码基因为TFRC)、二价金属离子转运蛋白1(divalent metal ion transporter 1，DMT-1；编码基因为SLC11A2)。结合免疫荧光观察p-STAT3在MG中的表达及定位。体外实验将原代MG分为对照(Control)组、骨形态发生蛋白4(bone morphogenetic protein 4，BMP4)组及BMP4+Stattic(STAT3抑制剂)组，分析用Stattic抑制STAT3后对MG活化、极化和铁代谢的影响。 结果 在动物实验中，与Sham组比较，SNL组和SNL+NOG组大鼠术后的PWT显著降低(P<0.05)，脊髓内CD11b和p-STAT3的蛋白质表达水平均显著升高(均P<0.05)，促炎M1型MG标志物CD86的蛋白质及CD86、CD32、IL-1β、TNF-α和CCR2的mRNA的表达水平均明显升高(均P<0.05)，而抗炎M2型MG标志物CD204的蛋白质和CD204和ARG-1的mRNA的表达水平均显著下降(均P<0.05)，hepcidin的蛋白质和铁蓄积相关基因HAMP、SLC11A2、TFRC的mRNA的表达水平均显著升高(均P<0.05)，而FPN的蛋白质和铁释放相关基因SLC40A1的mRNA的表达水平均明显降低(均P<0.05)。与SNL组比较，SNL+NOG组大鼠术后的PWT显著升高(P<0.05)；其脊髓内CD11b和p-STAT3的蛋白质表达水平均显著降低(均P<0.05)，CD86的蛋白质和除TNF-α外的M1型MG标志物的mRNA的表达水平均显著降低(均P<0.05)，而CD204的蛋白质及CD204和ARG-1的mRNA的表达水平均显著升高(均P<0.05)；铁代谢标志物中，hepcidin的蛋白质和HAMP的mRNA的表达水平均明显降低(均P<0.05)，而FPN的蛋白质和SLC40A1的mRNA的表达水平明显升高(均P<0.05)。在体外实验中，与Control组比较，BMP4组原代MG中CD11b、p-STAT3、STAT3、CD86和hepcidin蛋白的表达水平均显著升高(均P<0.05)，同时CD204和FPN蛋白的表达水平均显著下调(均P<0.05)。与BMP4组比较，BMP4+Stattic组原代MG中CD11b、p-STAT3、CD86和hepcidin蛋白的表达水平均显著下调(均P<0.05)，p-STAT3/STAT3比值降低(P<0.05)，同时CD204和FPN蛋白的表达水平明显升高(均P<0.05)。 结论 NOG通过拮抗STAT3信号通路，调节MG极化平衡并改善铁代谢紊乱，从而缓解SNL诱导的NP。

Abstract

Objective Pain sensitization, as a core feature of neuropathic pain (NP), is closely associated with inflammatory imbalance within the central nervous system. To investigate the effects of intrathecal injection of noggin (NOG) on mechanical hypersensitivity, microglial (MG) activation and polarization, and iron metabolism in a spinal nerve ligation (SNL)-induced rat model of NP, and to explore the role of signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) in MG phenotypic transformation. Methods Sixty-six Sprague-Dawley (SD) rats were randomly divided into 3 groups: Sham, SNL, and SNL+NOG. Paw withdrawal threshold (PWT) was assessed using von Frey filaments. Western blotting and real-time polymerase chain reaction (RT-PCR) were used to detect spinal cord expression of MG activation marker CD11b, STAT3, phosphorylated STAT3 (p-STAT3), M1 polarization markers [CD86, CD32, interleukin (IL)-1β], tumor necrosis factor-alpha (TNF-α), and CC chemokine receptor 2 (CCR2), M2 markers [CD204, CD163, CX3C chemokine receptor 1 (CX3CR1), IL-10, and arginase-1 (ARG-1)], and iron metabolism-related proteins including ferroportin (FPN, gene: SLC40A1), hepcidin (gene: HAMP), transferrin receptor (gene: TFRC), and divalent metal transporter 1 (DMT-1, gene: SLC11A2). p-STAT3 localization in MGs was visualized via immunofluorescence. In vitro, primary MGs were divided into Control, bone morphogenetic protein-4 (BMP4), and BMP4+Stattic (STAT3 inhibitor) groups to examine the effects of STAT3 inhibition on MG activation, polarization, and iron regulation. Results In vivo, compared with the Sham group, the SNL and SNL+NOG groups exhibited significantly decreased PWT (P<0.05), elevated spinal CD11b and p-STAT3 protein levels (all P<0.05), increased M1 markers (CD86, CD32, IL-1β, TNF-α, and CCR2) (all P<0.05), and decreased M2 markers (CD204 protein; mRNA of CD204, ARG-1) (all P<0.05). Hepcidin protein and mRNA levels of HAMP, SLC11A2, and TFRC were significantly elevated, while FPN protein and SLC40A1 mRNA were reduced (all P<0.05). Compared to SNL alone, the SNL+NOG group showed increased PWT, decreased CD11b, p-STAT3, and M1 marker expression (except TNF-α), increased M2 marker expression, reduced hepcidin and HAMP levels, and increased FPN and SLC40A1 expression (all P<0.05). In vitro, BMP4 treatment increased CD11b, STAT3, p-STAT3, CD86, and hepcidin levels, while reducing CD204 and FPN (all P<0.05). Inhibition STAT3 with Stattic reversed these changes (all P<0.05). Conclusion NOG alleviates SNL-induced NP by antagonizing the STAT3 signaling pathway, thereby rebalancing microglial polarization and restoring iron metabolism.

Graphical abstract

关键词

头蛋白 / 神经病理性疼痛 / 小胶质细胞极化 / 铁代谢 / 信号转导及转录激活因子3

Key words

noggin / neuropathic pain / microglial polarization / iron metabolism / signal transducer and activator of transcription 3

神经病理性疼痛(neuropathic pain，NP)是由躯体感觉神经系统损伤或疾病所引发的慢性疼痛综合征。近期的流行病学数据^[1]显示：NP在人群中的发病率为7%~8%，其中约17%的患者表现为持续性剧烈疼痛，且病程超过3个月。目前NP的发病机制尚未完全阐明，临床治疗面临巨大挑战。痛觉敏化作为NP的核心特征，与中枢神经系统(central nervous system，CNS)内炎症失衡密切相关^[2]。小胶质细胞(microglia，MG)是CNS的常驻免疫细胞，其特征表型可以直接决定CNS的炎症倾向^[3]。在促炎途径中，活化的MG出现铁代谢紊乱，导致细胞内铁蓄积并引发氧化应激，最终极化为促炎M1型MG，该表型可大量分泌肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-alpha，TNF-α)、白细胞介素(interleukin，IL)-6、IL-8等促炎性细胞因子，进一步激活星形胶质细胞，共同加剧疼痛症状；在抗炎途径中，MG通过促进铁释放恢复铁稳态，并极化为抗炎M2型MG，后者可释放IL-4、IL-10等抗炎细胞因子以缓解炎症反应，从而改善疼痛。多项研究表明：在NP早期阶段，MG的铁代谢异常^[4-6]与M1/M2表型失衡^[7-10]是驱动中枢敏化的关键病理机制。因此，恢复MG的铁稳态及极化平衡以改善CNS炎症，可成为治疗NP的新策略，具有重要的转化医学价值。

骨形态发生蛋白4(bone morphogenetic protein 4，BMP4)作为转化生长因子-β(transforming growth factor-beta，TGF-β)超家族的重要成员，在细胞分化、器官发育以及CNS内环境稳态维持中发挥关键调节作用^[11]。研究^[12-13]发现：在CNS损伤和炎症性疾病中，MG在损伤局部聚集，并呈现BMP4高表达的特征。这提示BMP4可能参与MG的表型及CNS炎症的调控。笔者前期的研究^[14]首次证实在NP模型大鼠脊髓内BMP4的表达显著上调。进一步的研究^[15-16]发现鞘内给予外源性BMP4可特异性诱导MG发生铁蓄积和M1型极化，最终加重CNS炎症并诱发痛觉敏化。然而，BMP4调控MG的铁代谢和极化倾向的内在机制尚不明确。

头蛋白(noggin，NOG)作为BMP4的生理性拮抗剂，能够特异性阻断BMP4与其受体的结合，从而阻断其下游信号转导^[17]。笔者前期的研究^[18]发现：鞘内给予NOG可通过抑制脊髓内星形胶质细胞中信号转导及转录活化因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)的磷酸化水平，下调IL-6的表达，从而改善痛觉过敏症状。值得注意的是，除星形胶质细胞外，STAT3还参与MG的极化^[19]和铁代谢调控过程^[20]。鉴于此，笔者提出科学假设：NOG通过抑制STAT3的活性，逆转MG的极化失衡和铁过载状态，从而减轻CNS炎症并最终缓解疼痛症状。为了验证该假设，本研究拟建立腰5脊神经结扎(spinal nerve ligation，SNL)模型模拟NP，使用行为学、免疫荧光和分子生物学检测技术，系统评估鞘内给予NOG对疼痛行为学的影响，并深入探讨STAT3在NOG调控MG极化表型和重塑铁代谢中的作用，旨在为深入理解NP的发病机制和开发靶向BMP4信号通路的新型镇痛药物提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 伦理声明

本研究已获得经中南大学湘雅二医院动物伦理委员会审查批准(审批号：20240217)。所有操作均严格遵循国际实验动物护理与使用指南(Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments Version 2.0，ARRIVE-2.0)。

1.2 材料

1.2.1 实验动物

本研究选用无特定病原体(special pathogen free，SPF)级成年Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠66只，重量为200~250 g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供。手术干预前所有动物在标准化环境(温度21~23 ℃、湿度50%~55%)中适应性饲养1周，自由摄食、饮水。实验前使用Von-Frey测痛纤维测定大鼠左后足机械痛缩足阈值(paw withdrawal threshold，PWT)，排除基础PWT超出10.0 g的大鼠。

1.2.2 细胞

大鼠原代MG购自瑞士Lonza，复苏后接种于含10%胎牛血清+1%左旋谷氨酸+1%链霉素/青霉素的杜尔贝科改良伊格尔培养基(Dulbecco’s modified eagle medium，DMEM)中，并置于含5% CO₂的37 ℃恒温培养箱中培养。

1.2.3 主要试剂与仪器

一抗：羊抗兔CD86、CD204、铁转运蛋白(ferroportin，FPN；编码基因为SLC40A1)、铁调素(hepcidin，编码基因为HAMP)抗体，羊抗小鼠CD11b和离子钙结合衔接分子1(ionized calcium binding adapter molecule 1，Iba-1)抗体均购自美国Abcam；羊抗兔STAT3、磷酸化STAT3(phosphorylated STAT3，p-STAT3)均购自美国Cell Signaling Technology；羊抗兔甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗体购自武汉三鹰生物技术有限公司。

重组蛋白NOG购自美国Peprotech；STAT3抑制剂Stattic购自美国Selleck Chemicals；蛋白质印迹法和荧光二抗购自美国Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.；硬膜外导管PE-10购自美国Smiths medical；Von-Frey测痛纤维购自美国Stoelting Co.；逆转录聚合酶链反应(real-time polymerase chain reaction，RT-PCR)试剂盒购自北京天根生化科技有限公司；细胞裂解液购自上海碧云天生物技术股份有限公司；蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂均购自瑞士Roche。

荧光显微镜购自日本Olympus Corporation；电泳转膜仪和RT-PCR仪购自上海伯乐生命医学产品有限公司；-80 ℃深低温冰箱购自中国海尔集团公司；低温超速离心机购自中国赛默飞世尔科技有限公司；组织匀浆器购自美国Pro Scientific；酶标仪购自美国BioTek Instruments。

1.3 方法

1.3.1 动物实验分组与干预

将66只SD大鼠随机分为3组：假手术(Sham)组、SNL组和SNL+NOG组，其中Sham组18只(9只用于行为学检测，免疫荧光、蛋白质印迹法和RT-PCR检测各3只)，SNL组与SNL+NOG组各24只(9只用于行为学检测，9只用于蛋白质印迹法，免疫荧光和RT-PCR各3只)。各组干预情况：1)鞘内给予Sham组大鼠等量的人工脑脊液，给药同时暴露但不结扎腰5脊神经；2)鞘内给予SNL组大鼠等量的人工脑脊液，给药同时暴露并结扎腰5脊神经；3)SNL+NOG组大鼠鞘内置管并给予外源性NOG，剂量(浓度为50 ng/20 μL，每日1次，每次 20 μL，连续给药7 d)参考笔者前期的研究^[19]，第1次给药后暴露并结扎腰5脊神经。

1.3.2 细胞实验分组与干预

为了排除体内其他细胞的干扰，进一步在离体培养原代MG中检测BMP4对MG功能表型的影响。实验共分为3组：1)对照(Control)组不做任何处理；2)BMP4组使用外源性BMP4(浓度为50 ng/mL^[16])处理细胞；3)BMP4+Stattic组使用外源性BMP4(浓度为50 ng/mL)和Stattic(浓度为5.1 μmol/L)^[16]处理细胞。各组均处理24 h后进行相关检测。

1.3.3 SNL模型

采用笔者前期研究^{[14-15, 18]}中的方法建立SNL模型。操作步骤如下：大鼠经腹腔注射戊巴比妥钠 (30 mg/kg)麻醉后取俯卧位，以双侧髂嵴定位腰4~腰5椎间隙，消毒备皮后沿后正中线左侧0.5 cm处做长约1.5 cm的纵行切口，钝性分离皮下组织及椎旁肌群。用显微咬骨钳依次去除腰6椎体上关节突及横突，显露腰4~腰5神经根走行区。以8-0无菌丝线双重结扎腰5神经根，结扎力度以神经直径缩窄约1/3为标准，使用生理盐水冲洗手术视野，并逐层缝合肌层及皮肤。术后连续3 d肌肉注射青霉素[5×10⁴ U/(kg·d)]预防感染。对照组则暴露腰5神经，套线但不结扎。建模后，排除出现损伤侧后足拖地行走(提示腰4脊神经损伤)，或机械痛阈值显著高于1.4 g(提示套扎力度不够)的SNL组大鼠和出现左后足PWT的下降(提示套线时意外损伤腰5脊神经)的对照组大鼠。

1.3.4 鞘内给药

采用笔者前期研究^{[14-16, 18]}中的方法行改良鞘内置管和给药。操作步骤如下：大鼠麻醉后取俯卧位，以双侧髂嵴为解剖标志定位腰4~腰5间隙，常规消毒备皮后沿后正中线做1 cm纵行切口，钝性分离至椎板，切除腰4棘突及部分椎板暴露硬脊膜。将灭菌后的PE-10导管经暴露的椎间隙轻柔置入蛛网膜下腔，进管深度为1~2 cm，观察脑脊液是否回流以确认置管是否成功，逐层缝合切口并建立皮下隧道固定导管。大鼠苏醒后，予注射利多卡因(1%，10 μL)，观察双下肢运动功能丧失情况以确认置管是否成功；连续3 d监测PWT，排除因置管操作导致神经损伤(PWT显著下降)的大鼠。在确认置管成功后的第4天，经导管给予各组大鼠相应药物后实施SNL手术。

1.3.5 PWT测定

分别于鞘内置管前1天(P0)和SNL术后连续7 d(P1~P7)的固定时间窗(15:00~17:00)测定各组大鼠左后足的PWT。参照笔者前期研究^{[14-16, 18]}中的方法，操作步骤如下：将大鼠置于底部为金属网底的透明有机玻璃箱中适应30 min，保持避光、安静环境。随后使用0.4~15.0 g梯度纤维垂直刺激左侧后足第3~4跖骨间区域，每次刺激持续6~8 s，若10 s内出现缩足或舔足等回避行为则判定为阳性反应。为消除主观偏倚，所有行为学测试均由不知晓分组情况的实验人员操作，使用Dixon’s up and down的方法对测得的数据进行校正，获得50% PWT。

1.3.6 蛋白质印迹法

在动物实验部分，在SNL术后第1、4、7天(P1、P4、P7)深麻醉并处死大鼠，提取腰段脊髓，采用蛋白质印迹法检测大鼠脊髓内以下蛋白质的表达水平：MG活化标志物CD11b，以及STAT3、p-STAT3；M1型极化标志物CD86、CD32、IL-1β、TNF-α和CC趋化因子受体2(CC chemokine receptor 2，CCR2)以及M2型极化标志物CD204、CD163、CX3C趋化因子受体1(CX3C chemokine receptor 1，CX3CR1)、IL-10和精氨酸酶1(arginase-1，ARG-1)；铁代谢调节因子hepcidin和FPN。在细胞实验部分，通过洗涤和离心收集细胞，采用蛋白质印迹法检测大鼠脊髓内以下蛋白质的表达水平：CD11b、p-STAT3、STAT3、CD86、CD204、hepcidin、FPN。

在获得的动物组织和细胞成分中加入放射免疫沉淀法(radio immunoprecipitation assay，RIPA)裂解液+蛋白酶抑制剂+磷酸酶抑制剂混合液，使用组织匀浆机匀浆，并在低温超速离心机以12 000 r/min离心30 min。取上清，用二喹啉甲酸法(bicinchoninic acid assay，BCA)法检测总蛋白质浓度。取20 μg蛋白质样品，依次经上样缓冲液混合后煮沸变性，制胶，点样，电泳，转膜，5%脱脂奶粉封闭后，加入一抗孵育过夜，用含有Tween-20的Tris盐酸缓冲液(Tris-buffered saline with Tween-20，TBST)洗膜3次，每次10 min，根据种属选择羊抗兔/羊抗鼠-辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)标记二抗(稀释比：1꞉5 000)，室温下孵育1 h，用TBST洗膜3次，每次10 min，加入增强化学发光(enhanced chemiluminescence，ECL)液显影后曝光扫描，并使用Alpha-view图像处理软件计算各条带灰度值。

一抗包括CD204(稀释比1꞉1 000)、CD86(稀释比1꞉1 000)、FPN(稀释比1꞉800)、hepcidin(稀释比1꞉200)、CD11b(稀释比1꞉1 000)、STAT3(稀释比1꞉1 000)、 p-STAT3(稀释比1꞉2 000)和GAPDH(稀释比1꞉8 000)。

1.3.7 双重免疫荧光标记法

在SNL术后第7天(P7)深麻醉并处死大鼠，经左心室插管，先用37 ℃预温磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)灌注排空血液至肝变白，随后灌注4 ℃预冷的4%多聚甲醛溶液进行内固定，提取脊髓，并置于4%多聚甲醛溶液中，在4 ℃环境下外固定过夜，用PBS漂洗后经30%蔗糖脱水、最佳切削温度复合物(optimal cutting temperature compound，OCT)包埋处理，行10 μm冰冻(-20 ℃)切片。采用0.3%Triton破膜，驴血清封闭1 h，在4 ℃下与Iba-1(稀释比：1꞉150)和p-STAT3(稀释比：1꞉300)一抗一起孵育过夜后，用PBS漂洗(每次8 min，共3次)，加入驴抗鼠-异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)标记荧光二抗(稀释比：1꞉150)避光孵育1 h后再用PBS漂洗(每次8 min，共3次)，漂片后使用荧光抗淬灭剂封片，在荧光显微镜下观察脊髓背角处Iba-1和p-STAT3蛋白表达双阳性(Iba-1⁺p-STAT3⁺)的MG，并ImageJ软件计算荧光强度。

1.3.8 RT-PCR

在SNL术后第7天(P7)深麻醉并处死大鼠，提取腰段脊髓，采用TRIzol提取总mRNA，检测mRNA浓度后采用三步法RT-PCR(SYBR-green染料荧光定量RT-PCR)检测M1型极化标志物CD86、CD32、 IL-1β、TNF-α和CCR2和M2型极化标志物CD204、CD163、CX3CR1、IL-10、ARG-1，以及铁代谢标志物HAMP、SLC40A1、二价金属离子转运蛋白1(divalent metal ion transporter 1，DMT-1；编码基因为SLC11A2)和转铁蛋白受体(transferrin receptor，TFR；编码基因为TFRC)的mRNA表达水平，使用2^-ΔΔCt法对所得结果进行处理。相关引物详见表1。

1.4 统计学处理

采用SPSS19.0软件处理数据，Prism GraphPad 8.0软件作图。计量资料以均数±标准差表示，各组大鼠PWT数据采用双因素方差分析进行比较，随后使用Turkey’s多重比较进行两两比较。蛋白质印迹法、免疫荧光和RT-PCR的结果分析采用单因素方差分析，随后使用Sidak’s多重比较进行两两比较。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 NOG可缓解SNL诱导的大鼠疼痛

图1显示各组大鼠左后足的50%PWT在鞘内置管前1 d(P0)和SNL术后连续7 d(P1~P7)内的动态变化。3组大鼠术前(P0)50%PWT差异无统计学意义(P>0.05)。双因素方差分析结果表明3组之间存在显著的时间效应[F(4.946，118.7)=70.94，P<0.001]、干预效应[F(2，24)=343.5，P<0.001]及时间-干预交互效应[F(14，168)=14.41，P<0.001]。Turkey’s多重比较分析发现：与Sham组比较，SNL组和SNL+NOG组术后各时间点的50%PWT均显著降低(均P<0.001)。值得注意的是，SNL+NOG组的50%PWT在术后早期(P1和P2)与SNL组相比差异无统计学意义(P1：7.16±1.09 vs 5.63±1.54，P=0.50；P2：6.34±0.79 vs 4.51±1.58，P=0.19)，而从术后第3天起(P3~P7)均显著高于SNL组(P3：6.40±1.39 vs 2.40±1.34；P4：4.45±1.44 vs 1.34±0.87；P5：4.27±1.72 vs 1.38±0.77；P6：5.47±2.29 vs 1.39±0.60；P7：5.86±1.66 vs 0.95±0.36；均P<0.05)。鞘内给予NOG可显著改善SNL诱导的机械性痛觉敏化，且该保护作用具有时间依赖性的特征。

2.2 NOG拮抗SNL诱导的脊髓内小胶质细胞活化

和STAT3的磷酸化水平升高

蛋白质印迹法结果显示：与Sham组比较，SNL组脊髓内CD11b的蛋白质表达水平在P1和P7时间点均显著升高(均P<0.01)，而P4时间点的差异无统计学意义(P=0.16，图2A~2B)；SNL组的STAT3的蛋白质表达水平在各个时间点的差异均无统计学意义(均P>0.05)，而p-STAT3的蛋白质表达水平在P4和P7时间点均显著升高(均P<0.001，图2A、2C、2D)。与SNL组比较，SNL+NOG组的CD11b的蛋白质表达水平在P1、P4和P7时间点均显著降低(均P<0.001， 图2A、2B)；SNL+NOG组的STAT3和p-STAT3的蛋白质表达水平在P1、P4和P7时间点均显著下降(均 P<0.01，图2A、2C、2D)。

免疫荧光双标结果(图3)进一步证实：与Sham组比较，SNL组脊髓背角处p-STAT3和Iba-1蛋白表达双阳性(Iba-1⁺p-STAT3⁺)的MG数量显著增加(P<0.001)；而SNL+NOG组Iba-1⁺p-STAT3⁺的MG数量较SNL组明显减少(P<0.01)。

2.3 NOG可逆转SNL诱导的脊髓内MG的M1/M2型极化偏移

蛋白质印迹法结果(图4A~4C)显示：与Sham组比较，SNL组促炎M1型MG标志物CD86蛋白的表达水平在P1、P4和P7时间点均明显升高(均P<0.05)，而抗炎M2型MG标志物CD204蛋白的表达水平在P1和P4时间点均显著下降(均P<0.01)；与SNL组比较，SNL+NOG组CD86的蛋白质表达水平在P1、P4、P7时间点均明显降低(均P<0.001)，而CD204的蛋白质表达水平在P1和P4时间点均明显升高(均P<0.001)。

RT-PCR结果显示：在P7时间点，与Sham组比较，SNL组的促炎M1型MG标志物CD86、CD32、IL-1β、TNF-α和CCR2的mRNA表达水平均显著升高(均P<0.05，图4D)，而抗炎M2型MG标志物的表达水平呈现复杂变化，表现为CD204和ARG-1的mRNA表达水平均显著下降(均P<0.05，图4E)，CD163和CX3CR1的mRNA表达水平均显著上升(均P<0.05，图4E)，而IL-10的mRNA表达水平则保持不变(P=0.12，图4E)；与SNL组比较，SNL+NOG组除TNF-α(P=0.06)外的其余M1型MG标志物的表达水平均显著降低(均P<0.05，图4D)，抗炎M2型MG标志物CD204和ARG-1的mRNA表达水平均明显升高(均P<0.05，图4E)，CD163和CX3CR1的mRNA表达水平均明显下降(均P<0.05，图4E)，而IL-10的mRNA表达水平则无明显变化(P=0.13，图4E)。

2.4 NOG重塑SNL模型大鼠脊髓内的铁代谢水平

蛋白质印迹法结果(图5A~5C)显示：与Sham组比较，SNL组表现出显著的铁代谢紊乱特征，表现为在P1、P4和P7时间点hepcidin蛋白表达水平均显著升高(均P<0.001)，而FPN蛋白表达水平在P4和P7时间点均明显降低(均P<0.05)。与SNL组比较，SNL+NOG组在P1、P4、P7时间点hepcidin蛋白表达水平均明显降低(均P<0.001，而FPN蛋白表达水平在P4、P7时间点均明显升高(均P<0.001)。

RT-PCR结果(图5D)显示：在P7时间点，与Sham组比较，SNL组铁蓄积相关基因HAMP、SLC11A2、TFRC的mRNA水平均明显升高(均P<0.05)，而铁释放相关基因SLC40A1的mRNA水平则明显降低(P<0.05)。NOG可有效逆转SNL诱导的HAMP和SLC40A1基因表达异常(均P<0.05)，SLC11A2(P=0.08)和TFRC(P=0.07)基因表达虽有降低趋势，但SNL组与SNL+NOG组间的差异无统计学意义。

2.5 拮抗STAT3信号转导对MG极化和铁代谢的影响

蛋白质印迹法结果(图6)显示：与Control组比较，BMP4组原代MG中CD11b、p-STAT3、STAT3、CD86和hepcidin蛋白的表达水平均显著升高(均P<0.05)，同时CD204和FPN蛋白的表达水平均显著下调(均P<0.05)。

进一步通过STAT3抑制剂Stattic进行干预，验证STAT3信号在MG极化和铁代谢中的作用，蛋白质印迹法结果(图6)显示：与BMP4组比较，BMP4+Stattic组原代MG中CD11b、p-STAT3、CD86和hepcidin蛋白的表达水平均显著下调(均P<0.05)，p-STAT3/STAT3比值显著降低(P<0.05)，同时CD204和FPN蛋白的表达水平明显升高(均P<0.05)。这提示STAT3在BMP4诱导的MG激活、极化失衡和铁蓄积过程中扮演重要角色。

3 讨 论

本研究发现鞘内给予外源性NOG可显著改善SNL诱导的机械痛觉敏化。机制研究表明：NOG通过抑制脊髓MG中STAT3的磷酸化，降低MG活化标志物CD11b的表达，并逆转SNL诱导的MG功能异常，包括极化和铁代谢紊乱。与此同时，体外实验进一步证实：外源性BMP4处理可模拟诱导原代MG出现类似的促炎极化和铁蓄积表型，而应用STAT3抑制剂则可有效阻断此效应。上述结果提示：NOG可通过拮抗BMP4信号，并依赖STAT3通路作为关键下游枢纽，调控MG的活化状态、极化表型及铁代谢稳态，最终减轻中枢炎症并改善NP症状。

STAT3是CNS炎症反应的关键调控因子，其激活在驱动MG促炎活化中发挥核心作用。例如，在阿尔茨海默病和帕金森病等神经退行性变性疾病中， β-淀粉样蛋白^[21]和α-突触核蛋白^[22]等病理分子均可通过激活STAT3信号，驱动MG向促炎表型转化，进而加剧神经炎症反应。同样，在脑缺血^[23]和NP^[24]模型中，抑制STAT3信号通路可有效降低MG的活化程度，促进炎症的消散并缓解疼痛症状。这些发现共同说明了STAT3是调控MG功能状态的关键分子靶点。

笔者前期研究工作^{[14, 16]}揭示了在NP条件下BMP4可通过激活脊髓STAT3信号通路诱导星形胶质细胞活化。值得注意的是，MG也表达BMP4特异性受体^[25]，并且临床研究^{[12, 26]}观察到在多发性硬化患者的CNS炎症病灶中，浸润的MG表现出BMP4-SMADs信号的高度激活，这表明MG具备响应BMP4刺激的分子基础。然而，在NP条件下，BMP4是否直接通过STAT3信号通路调控小胶质细胞的活化状态，尚缺乏直接证据。本研究获得以下关键发现：首先，在体内SNL模型中，脊髓背角MG活化标志物CD11b的表达水平和STAT3的磷酸化水平均显著升高，且可被鞘内给予BMP4拮抗剂NOG有效抑制；其次，在体外实验中，外源性BMP4处理原代MG可显著上调CD11b的蛋白质表达水平，NP状态下的MG激活表型一致，且STAT3特异性抑制剂Stattic能完全阻断BMP4诱导的CD11b的表达上调。上述体内外结果共同证实：NOG通过拮抗上游BMP4，有效阻断BMP4-STAT3-MG活化轴。这一机制的发现为理解NOG如何进一步逆转SNL诱导的MG功能失调提供了新的思路。

尽管M1/M2极化二分法在全面反映MG功能连续谱和异质性方面存在一定局限，其仍然是当前评估MG促炎/损伤或抗炎/修复倾向的重要框架^[27]。在NP中，大量证据^[7-10]表明：MG向促炎M1表型的过度极化以及抗炎M2表型功能的减弱，是驱动CNS炎症级联反应和中枢敏化的重要因素。STAT3信号通路在调控MG极化中展现出独特的双重特性：一方面能够促进M1极化并增强IL-1β、IL-6和TNF-α等促炎因子的表达^[28-30]，另一方面又可驱动M2极化，通过抑制核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)的活性改善炎症微环境^[31-32]，这种看似矛盾的作用可能与疾病背景、刺激类型、信号时空特异性及其他信号的网络互作差异有关。

本研究发现：鞘内给予NOG显著逆转了SNL诱导的多种M1型标志物表达水平的升高，包括CD86、CD32、IL-1β和CCR2。TNF-α表达水平的下调差异虽无统计学意义，但仍呈下降趋势；在M2型标志物方面，NOG则表现出复杂的调控模式，既可提高CD204和ARG-1的表达水平，又同时降低了CD163和CX3CR1的表达水平，而IL-10则无明显变化。上述结果提示：NOG干预的核心效应是显著抑制MG的促炎M1型极化，同时，它选择性地影响部分抗炎M2型相关标志物的表达。这种极化表型的重塑以抑制促炎为主，并伴随部分修复功能的增强，最终共同促进了炎症微环境的改善，是NOG缓解NP的重要机制。

更重要的是，本研究证明了STAT3是介导BMP4调控MG极化的关键枢纽。体内层面，NOG有效抑制了SNL诱导的脊髓MG中STAT3的磷酸化水平的升高，这种STAT3活性的抑制与M1型标志物的表达水平下调及部分M2型标志物的表达水平上调一致；体外层面，外源性BMP4处理原代MG可诱导典型的极化失衡，表现为促炎标志物CD86的表达水平上调和抗炎标志物CD204的表达水平下调，且STAT3特异性抑制剂可有效阻断BMP4诱导的CD86/CD204表达失衡，说明BMP4对这2个关键极化标志物的调控是STAT3依赖性的。

因此，上述体内外结果共同表明：在NP条件下，BMP4通过激活STAT3信号通路，驱动MG向促炎M1表型极化。而NOG则通过阻断BMP4-STAT3轴有效逆转STAT3驱动的促炎极化倾向，并促进部分抗炎/修复相关表型(如CD204和ARG-1)的表达，从而重塑MG的极化平衡，使其整体向更具抗炎和稳态维持特性的状态偏移。这可能是NOG改善NP中枢炎症和疼痛症状的核心机制之一。

维持细胞内的铁稳态对于细胞功能至关重要，其核心在于铁摄取、铁储存和铁外排之间的动态平衡。其中，hepcidin扮演重要的调控角色，它通过诱导FPN的内化和降解，有效抑制铁外排，导致细胞内铁蓄积 ^[33-35]。值得注意的是，铁代谢紊乱与MG功能状态之间存在密切的双向作用：细胞内铁过载可通过芬顿效应(Fenton reaction)催化产生活性氧类(reactive oxygen species，ROS)，不仅诱发氧化损伤，还能显著增强MG的促炎活性并诱导其向M1型极化；相反，促进铁外排则可逆转这一过程，恢复MG的M1/M2极化平衡，进而减轻组织炎症^[36-38]。因此，打破铁过载和神经炎症之间的恶性循环，恢复MG铁稳态，是治疗NP的重要策略。既往研究^[39]已明确BMP4是铁代谢的关键调控因子，通过上调hepcidin的表达抑制铁外排，导致铁在胞内的蓄积。然而，在NP条件下，BMP4调控MG铁代谢的具体下游信号通路，特别是STAT3是否参与其中，尚未明确。本研究填补了这一关键空白，揭示了SNL模型中铁代谢紊乱的新机制：体内层面，SNL模型建立后，脊髓中MG的STAT3磷酸化水平升高和铁代谢严重紊乱，表现为促进铁蓄积的关键分子hepcidin的蛋白质表达水平及其编码基因HAMP的mRNA水平显著上调，以及铁摄取相关基因(TFRC和SLC11A2)的mRNA水平显著上调，而介导铁外排的关键蛋白质FPN的表达水平及其基因SLC40A1的mRNA水平则显著下调，这些改变共同导致了脊髓MG内的铁过载。重要的是，NOG在有效抑制STAT3磷酸化的同时，显著逆转了上述铁代谢相关分子的异常表达，从而有效维系了MG的铁稳态。体外层面，本研究发现外源性BMP4处理可显著诱导hepcidin的蛋白质表达水平上调和FPN的蛋白质表达水平下调。更为关键的是，应用STAT3抑制剂Stattic，可有效阻断BMP4通过hepcidin-FPN轴诱导的铁蓄积。这些结果共同表明：STAT3是BMP4调控铁代谢的关键节点，NOG通过抑制BMP4-STAT3信号通路恢复MG的铁稳态。

本研究的局限性在于：1)BMP4激活STAT3信号的具体激酶和中间信号通路有待进一步阐释； 2)NOG对M2亚型标志物的差异性调控仍需要进一步解析，例如利用单细胞转录组学等技术探究不同M2型MG亚群的功能及其对治疗的反应；3)MG的铁代谢重塑与极化表型的时空联系有待进一步的挖掘。

综上所述，本研究系统揭示了NP进展中的一种关键机制：鞘内给予BMP4拮抗剂NOG，通过抑制STAT3信号的激活，可显著改善SNL诱导的MG多维度功能失调，包括过度活化、极化失衡(M1/M2偏移)以及铁代谢紊乱(铁过载)。该结果为开发新型镇痛药物提供了新思路和实验依据。未来研究或可进一步探索NOG的中枢递送方案以及基于MG极化和铁代谢的联合治疗方案，以提升其临床转化潜力，从而造福更多NP患者。

参考文献

[1] Moisset X. Neuropathic pain: evidence based recommendations[J]. Presse Med, 2024, 53(2): 104232.

[2] Fiore NT, Debs SR, Hayes JP, et al. Pain-resolving immune mechanisms in neuropathic pain[J]. Nat Rev Neurol, 2023: 777.

[3] Borst K, Dumas AA, Prinz M. Microglia: immune and non-immune functions[J]. Immunity, 2021, 54(10): 2194-2208.

[4] Yu HY, Chang Q, Sun T, et al. Metabolic reprogramming and polarization of microglia in Parkinson’s disease: Role of inflammasome and iron[J]. Ageing Res Rev, 2023, 90: 102032.

[5] Wan KX, Jia M, Zhang H, et al. Electroacupuncture alleviates neuropathic pain by suppressing ferroptosis in dorsal root ganglion via SAT1/ALOX15 signaling[J]. Mol Neurobiol, 2023, 60(10): 6121-6132.

[6] Liu TL, Wang RX, Qi WQ, et al. Methyl ferulic acid alleviates neuropathic pain by inhibiting Nox4-induced ferroptosis in dorsal root Ganglia neurons in rats[J]. Mol Neurobiol, 2023, 60(6): 3175-3189.

[7] Atta AA, Ibrahim WW, Mohamed AF, et al. Microglia polarization in nociplastic pain: mechanisms and perspectives[J]. Inflammopharmacology, 2023, 31(3): 1053-1067.

[8] Inoue K. Microglia in neuropathic pain[J]. Adv Neurobiol, 2024, 37: 399-403.

[9] Li X, Shi HM, Zhang D, et al. Paeonol alleviates neuropathic pain by modulating microglial M1 and M2 polarization via the RhoA/p38MAPK signaling pathway[J]. CNS Neurosci Ther, 2023, 29(9): 2666-2679.

[10] Si WM, Li X, Jing B, et al. Stigmasterol regulates microglial M1/M2 polarization via the TLR4/NF-κB pathway to alleviate neuropathic pain[J]. Phytother Res, 2024, 38(1): 265-279.

[11] Wu MR, Wu SL, Chen W, et al. The roles and regulatory mechanisms of TGF-β and BMP signaling in bone and cartilage development, homeostasis and disease[J]. Cell Res, 2024, 34(2): 101-123.

[12] Harnisch K, Teuber-Hanselmann S, Macha N, et al. Myelination in multiple sclerosis lesions is associated with regulation of bone morphogenetic protein 4 and its antagonist noggin[J]. Int J Mol Sci, 2019, 20(1): 154.

[13] Shen WY, Liu SX, Wei XJ, et al. Infiltrating circulating monocytes provide an important source of BMP4 at the early stage of spinal cord injury[J/OL]. Dis Model Mech, 2023, 16(1): dmm049856[2025-03-01].

[14] Yang L, Liu SX, Wang YP. Role of bone morphogenetic protein-2/4 in astrocyte activation in neuropathic pain[J]. Mol Pain, 2019, 15: 1744806919892100.

[15] Liu CQ, Sun Q, Xu JM, et al. The role of bone morphogenetic protein 4 in microglial polarization in the process of neuropathic pain[J]. J Inflamm Res, 2022, 15: 2803-2817.

[16] Chen K, Wei XJ, Zhang WJ, et al. Bone morphogenetic protein 4 derived from the cerebrospinal fluid in patients with postherpetic neuralgia induces allodynia via the crosstalk between microglia and astrocyte[J]. Brain Behav Immun, 2024, 119: 836-850.

[17] Al-Sammarraie N, Mahmood M, Ray SK. Neuroprotective role of Noggin in spinal cord injury[J]. Neural Regen Res, 2023, 18(3): 492-496.

[18] 张文娟, 刘畅晴, 王鑫, 等. 鞘内给予外源性头蛋白对缓解神经病理性疼痛的作用[J]. 中南大学学报(医学版), 2021, 46(7): 673-679.

[19] ZHANG Wenjuan, LIU Changqing, WANG Xin, et al. Effect of intrathecal administration of exogenous noggin on neuropathic pain[J]. Journal of Central South University. Medical Science, 2021, 46(7): 673-679.

[20] Ren J, Zhu B, Gu GJ, et al. Schwann cell-derived exosomes containing MFG-E8 modify macrophage/microglial polarization for attenuating inflammation via the SOCS3/STAT3 pathway after spinal cord injury[J]. Cell Death Dis, 2023, 14(1): 70.

[21] Zhang ZZ, Tang JQ, Song JW, et al. Elabela alleviates ferroptosis, myocardial remodeling, fibrosis and heart dysfunction in hypertensive mice by modulating the IL-6/STAT3/GPX4 signaling[J]. Free Radic Biol Med, 2022, 181: 130-142.

[22] Varma VR, Desai RJ, Navakkode S, et al. Hydroxychloroquine lowers Alzheimer’s disease and related dementias risk and rescues molecular phenotypes related to Alzheimer’s disease[J]. Mol Psychiatry, 2023, 28(3): 1312-1326.

[23] Li H, Qian JL, Wang YC, et al. Potential convergence of olfactory dysfunction in Parkinson’s disease and COVID-19: The role of neuroinflammation[J]. Ageing Res Rev, 2024, 97: 102288.

[24] Zhu H, Jian ZH, Zhong Y, et al. Janus kinase inhibition ameliorates ischemic stroke injury and neuroinflammation through reducing NLRP3 inflammasome activation via JAK2/STAT3 pathway inhibition[J]. Front Immunol, 2021, 12: 714943.

[25] Lee JY, Park CS, Seo KJ, et al. IL-6/JAK2/STAT3 axis mediates neuropathic pain by regulating astrocyte and microglia activation after spinal cord injury[J]. Exp Neurol, 2023, 370: 114576.

[26] Miyagi M, Mikawa S, Sato T, et al. BMP2, BMP4, noggin, BMPRIA, BMPRIB, and BMPRII are differentially expressed in the adult rat spinal cord[J]. Neuroscience, 2012, 203: 12-26.

[27] Costa C, Eixarch H, Martínez-Sáez E, et al. Expression of bone morphogenetic proteins in multiple sclerosis lesions[J]. Am J Pathol, 2019, 189(3): 665-676.

[28] Wu YG, Song LJ, Yin LJ, et al. The effects and potential of microglial polarization and crosstalk with other cells of the central nervous system in the treatment of Alzheimer’s disease[J]. Neural Regen Res, 2023, 18(5): 947-954.

[29] Zhang ZH, Peng SJ, Xu TY, et al. Retinal microenvironment-protected Rhein-GFFYE nanofibers attenuate retinal ischemia-reperfusion injury via inhibiting oxidative stress and regulating microglial/macrophage M1/M2 polarization[J/OL]. Adv Sci (Weinh), 2023, 10(30): e2302909[2025-03-01].

[30] Shen YN, Zhang Y, Du JY, et al. CXCR5 down-regulation alleviates cognitive dysfunction in a mouse model of sepsis-associated encephalopathy: potential role of microglial autophagy and the p38MAPK/NF-κB/STAT3 signaling pathway[J]. J Neuroinflammation, 2021, 18(1): 246.

[31] Xian X, Cai LL, Li Y, et al. Neuron secrete exosomes containing miR-9-5p to promote polarization of M1 microglia in depression[J]. J Nanobiotechnology, 2022, 20(1): 122.

[32] Yin N, Zhao YZ, Liu CH, et al. Engineered nanoerythrocytes alleviate central nervous system inflammation by regulating the polarization of inflammatory microglia[J/OL]. Adv Mater, 2022, 34(27): e2201322[2025-03-01].

[33] Wang XP, Guo W, Chen YF, et al. PD-1/PD-L1 axis is involved in the interaction between microglial polarization and glioma[J]. Int Immunopharmacol, 2024, 133: 112074.

[34] Galy B, Conrad M, Muckenthaler M. Mechanisms controlling cellular and systemic iron homeostasis[J]. Nat Rev Mol Cell Biol, 2024, 25(2): 133-155.

[35] Ru Q, Li YS, Chen L, et al. Iron homeostasis and ferroptosis in human diseases: mechanisms and therapeutic prospects[J]. Signal Transduct Target Ther, 2024, 9(1): 271.

[36] Belot A, Puy H, Hamza I, et al. Update on heme biosynthesis, tissue-specific regulation, heme transport, relation to iron metabolism and cellular energy[J]. Liver Int, 2024, 44(9): 2235-2250.

[37] Li HX, Cao ZQ, Liu C, et al. Quercetin inhibits neuronal pyroptosis and ferroptosis by modulating microglial M1/M2 polarization in atherosclerosis[J]. J Agric Food Chem, 2024, 72(21): 12156-12170.

[38] Chen L, Yang YQ, Zhang N, et al. DHA and EPA alleviate depressive-like behaviors in chronic sleep-deprived mice: Involvement of iron metabolism, oligodendrocyte-lipids peroxidation and the LCN2-NLRP3 signaling axis[J]. Free Radic Biol Med, 2024, 225: 654-664.

[39] Yang XY, An JR, Dong QB, et al. Banxia-Houpu decoction inhibits iron overload and chronic intermittent hypoxia-induced neuroinflammation in mice[J]. J Ethnopharmacol, 2024, 318(Pt B): 117078.

[40] Arezes J, Foy N, McHugh K, et al. Antibodies against the erythroferrone N-terminal domain prevent hepcidin suppression and ameliorate murine thalassemia[J]. Blood, 2020, 135(8): 547-557.

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