肌萎缩侧索硬化相关FUS基因突变调控细胞应激反应的异质性

Heterogeneity in the regulation of cellular stress responses by FUS gene mutations associated with amyotrophic lateral sclerosis

摘要

目的 肌萎缩侧索硬化(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)是一种以运动神经元选择性死亡为核心特征的进行性神经退行性疾病，临床异质性显著且缺乏有效治疗手段，其病因与致病机制尚未完全阐明。融合性肉瘤(fused in sarcoma，FUS)基因作为ALS的关键致病基因之一，其编码蛋白质的致病突变主要分布于C端的核定位信号(nuclear localization signal，NLS)区域，而不同NLS突变位点在致病力、临床表型及分子机制上存在明显差异。本研究聚焦FUS蛋白NLS区域的2种典型致病突变(FUS^R514S和FUS^P525L)，探究其对细胞应激反应的调控差异并进行相关机制探索。 方法 采用美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)在线工具对12个物种的FUS蛋白序列进行同源性比对，明确R514和P525位点的进化保守性。利用PyMOL软件对蛋白质数据库(Protein Data Bank，PDB)中核转运蛋白与FUS蛋白复合物的三维结构(PDB ID：5YVG)进行分析，并通过PyMOL软件完成可视化展示。FUS突变体模型的构建采用PyMOL中的突变向导工具，通过选择目标构象异构体并执行突变流程实现。基于人胚肾细胞株(human embryonic kidney 293T，HEK293T)构建FUS基因野生型(FUS^WT)和突变型(FUS^R514S、FUS^P525L)Tet-on诱导表达细胞模型，分别采用蛋白质印迹法和免疫荧光法检测FUS蛋白的表达水平及亚细胞定位。采用洋地黄皂苷透化提取实验，结合十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)与蛋白质印迹法比较野生型和突变型FUS蛋白的聚集状态。采用蓝色非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(blue native PAGE，BN-PAGE)技术检测FUS蛋白突变对复合体稳定性的影响。采用流式细胞术测定线粒体膜电势及活性氧(reactive oxygen species，ROS)水平。利用亚砷酸钠诱导应激颗粒(stress granules，SGs)形成，并通过免疫荧光分析野生型和突变型FUS蛋白对SGs的影响。通过蛋白质印迹法检测线粒体功能相关蛋白[线粒体外膜转运酶20 kD亚基(translocase of outer membrane 20 kD subunit，Tom20)、电压依赖性阴离子通道1(voltage-dependent anion channel 1，VDAC1)等]及整合应激反应(integrated stress response，ISR)通路关键分子[磷酸化真核起始因子2α(eukaryotic initiation factor 2 alpha，eIF2α)、激活转录因子4(activating transcription factor 4，ATF4)]的蛋白质表达水平变化。 结果 序列比对分析显示R514和P525位点在12个物种的FUS蛋白中高度保守。三维结构的蛋白模型分析显示，FUS^R514S和FUS^P525L的突变破坏了FUS与核输入蛋白β2之间的氢键作用或疏水相互作用，削弱了二者结合的稳定性。蛋白质印迹法结果表明诱导表达野生型和突变型FUS蛋白的细胞模型建立成功，且外源性FUS蛋白表达对内源性FUS蛋白有轻微抑制作用。免疫荧光法结果显示野生型FUS蛋白主要定位于细胞核，而FUS^R514S和FUS^P525L突变型FUS蛋白均异常定位于细胞质，呈颗粒状分布。与野生型FUS蛋白相比，2种突变型FUS蛋白对线粒体膜电势、ROS水平及线粒体功能相关蛋白质的稳态水平均无显著影响(均P>0.05)。亚砷酸钠诱导后，突变型FUS蛋白形成SGs的速度比野生型快，形成的SGs直径更大，且突变型FUS蛋白在细胞中的分布和聚集状态与野生型不同(均P<0.05)。亚砷酸钠撤药后野生型与突变型FUS蛋白对SGs解聚影响的差异无统计学意义(P>0.05)。基础状态下，FUS^R514S突变型FUS蛋白的eIF2α磷酸化水平显著高于野生型，ATF4蛋白水平也呈升高趋势(均 P<0.05)；而FUS^P525L突变型与野生型FUS蛋白之间的差异无统计学意义(P>0.05)。亚砷酸钠处理后各组eIF2α磷酸化水平均升高，但突变型间的差异消失。 结论 FUS蛋白NLS序列的不同致病突变通过不同机制影响细胞应激反应，参与ALS的发生和发展，其中P525L可促进较大应激颗粒形成，R514S更易激活细胞ISR。

Abstract

Objective Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a progressive neurodegenerative disease characterized by the selective death of motor neurons, exhibiting marked clinical heterogeneity and lacking effective treatment. The etiology and pathogenic mechanisms remain incompletely understood. The FUS (fused in sarcoma) gene is one of the key causative genes in ALS. Pathogenic mutations in the encoded protein are predominantly clustered in the C-terminal nuclear localization signal (NLS) region, and distinct NLS mutation sites show considerable differences in pathogenic potency, clinical phenotypes, and molecular mechanisms. This study focuses on 2 representative pathogenic NLS mutations of FUS (FUS^R514S and FUS^P525L) to investigate their differential regulation of cellular stress responses and explore the underlying mechanisms. Methods Multiple sequence alignment of FUS protein homologs from 12 species was performed using an online tool from the National Center for Biotechnology Information (NCBI) to determine the evolutionary conservation of residues R514 and P525. The three-dimensional (3D) structure of the nuclear transport receptor-FUS complex [Protein Data Bank (PDB) ID: 5YVG] was analyzed and visualized using PyMOL. Structure of FUS mutants were generated using the mutation wizard tool in PyMOL by selecting the target conformational isomer and executing the mutation workflow. Tet-on inducible expression cell models for FUS wild-type (WT) and mutant FUS (FUS^R514SS and FUS^P525L) were established in human embryonic kidney 293T (HEK293T) cells. Protein expression levels and subcellular localization of FUS were assessed by Western blotting and immunofluorescence assay, respectively. FUS aggregation states were compared between WT and mutant FUS using a digitonin-based permeabilization and extraction assay, followed by sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and Western blotting analysis. Blue native PAGE (BN-PAGE) was used to evaluate the stability of FUS-containing complexes. Mitochondrial membrane potential and reactive oxygen species (ROS) levels were measured by flow cytometry. Stress granule (SG) formation was induced using sodium arsenite, and the effects of WT and mutant FUS on SG dynamics were analyzed by immunofluorescence assay. Protein expression changes of mitochondrial function-related proteins [translocase of outer membrane 20 kD subunit (Tom20) and voltage-dependent anion channel 1 (VDAC1)] and key molecules of the integrated stress response (ISR) pathway [phosphorylated-eukaryotic initiation factor 2 alpha (p-eIF2α) and activating transcription factor 4 (ATF4)] were examined by Western blotting. Results Sequence alignment revealed that R514 and P525 are highly conserved across FUS homologs from 12 species. Structural analysis indicated that the FUS^R514S and FUS^P525L mutations disrupt hydrogen bonding or hydrophobic interactions between FUS and importin-β2, weakening the stability of these interactions. Western blotting confirmed the successful establishment of inducible WT and mutant FUS expression cell models, and exogenous FUS expression slightly suppressed endogenous FUS protein levels. Immunofluorescence assay demonstrated that WT FUS is predominantly localized in the nucleus, whereas both FUS^R514S and FUS^P525L mutants mislocalize to the cytoplasm with a punctate, granular distribution. Compared with WT FUS, neither mutant significantly affected mitochondrial membrane potential, ROS levels, or the homeostasis of mitochondrial function-related proteins (all P>0.05). Upon sodium arsenite exposure, mutant FUS formed SGs more rapidly, generated SGs with larger diameters, and displayed distinct intracellular distribution and aggregation patterns relative to WT (P>0.05). After drug withdrawal, WT and mutant FUS showed no significant difference in their effects on SG disassembly (P<0.05). Under basal conditions, FUS^R514S exhibited significantly higher eIF2α phosphorylation levels than WT, and ATF4 protein levels also showed an increasing trend (P<0.05). No statistically significant difference was observed between FUS^P525L and WT FUS in these measures (P>0.05). Sodium arsenite treatment increased eIF2α phosphorylation across all groups, eliminating inter-mutant differences. Conclusion Distinct pathogenic NLS mutations of FUS differentially regulate cellular stress responses through different mechanisms, contributing to ALS initiation and progression. Among these, FUS^P525L promotes the formation of larger stress granules, whereas FUS^R514S more readily activates the cellular ISR.

Graphical abstract

关键词

肌萎缩侧索硬化 / 融合性肉瘤基因 / 应激反应 / 应激颗粒 / 整合应激反应

Key words

amyotrophic lateral sclerosis / fused in sarcoma gene / stress response / stress granules / integrated stress response

肌萎缩侧索硬化(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)作为一种复杂的神经退行性变性疾病，以运动神经元死亡为主要特征，其临床异质性与致病基因突变密切相关^[1-5]。融合性肉瘤(fused in sarcoma，FUS)基因突变是ALS的重要致病因素之一^[6-7]。FUS蛋白是一种脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)/核糖核酸(ribonucleic acid，RNA)结合蛋白，广泛参与调控RNA的转录、剪切、处理及定位等过程，对维持神经元的正常生理功能发挥至关重要的作用^[8-9]。然而，ALS患者特定的FUS基因突变会导致该蛋白质在细胞质中异常积聚，进而破坏细胞的正常功能并促进神经元死亡^[10]。

FUS蛋白的核定位信号(nuclear localization signal，NLS)区域对其正常功能的发挥至关重要，NLS区域的突变会破坏FUS蛋白与核输入蛋白β2的相互作用，导致其无法正常进入细胞核，进而在细胞质中异常聚集^[11]。此外，FUS蛋白的NLS区域突变(如R514S和P525L)不仅影响其亚细胞定位，还可能通过多种机制影响应激颗粒(stress granules，SGs)的形成和动态变化。SGs是细胞在应激条件下形成的一种无膜结构，由非翻译信使RNA和多种RNA结合蛋白组成，其形成有助于细胞在应激条件下保存能量并保护细胞免受损伤^[12-14]。然而，异常的SGs形成和动态变化可能导致神经元损伤，进而加剧ALS的病理进程^[15]。研究^[16-17]发现：ALS相关FUS蛋白的NLS区域突变导致FUS在SGs中累积，且存在于变性的运动神经元细胞质内含物中，这正是ALS和额颞叶痴呆(frontotemporal dementia，FTD)的主要病理特征^[18]；ALS/FTD患者尸检脑组织的FUS聚集物中通常含有SGs标志蛋白质^[16]。因此，深入研究FUS蛋白的NLS区域突变对SGs形成和动态变化的影响对揭示ALS的发病机制具有极其重要的意义。

FUS蛋白的NLS区域内的常染色体显性突变是迄今为止FUS突变中最常见的类型^[19]。FUS通过其NLS中的3个表位[包括N端PGKM疏水序列、中部富含精氨酸的α-螺旋及C端的脯氨酸-酪氨酸(proline-tyrosine，PY)基序(一种介导蛋白互作的特征性短序列)]与核输入蛋白β2相互作用，在其介导下入核^{[11, 20]}。临床研究^[21]发现FUS蛋白NLS区域中不同位点的突变与患者的临床表现有关。这可能是由于氨基酸侧链生物化学性质的差异，不同程度地影响FUS突变蛋白质与其他生物大分子的相互作用，进而影响其参与的细胞生物学过程^[19]。其中，FUS^R514S突变位于中部α-螺旋的起始部位，FUS^P525L则改变了C端核心PY序列，携带这2种突变的患者通常表现出典型的ALS症状，且病情迅速恶化^[21]。特别是FUS^P525L突变的患者，相较于FUS^R514S突变的患者，往往有更低的发病年龄[FUS^P525L突变患者为22.0岁，FUS^R514S突变患者为(32.5±3.5)岁]和更短的生存期(FUS^P525L突变患者为6个月，FUS^R514S突变患者为36个月)^[21]。尽管这2种突变均会导致ALS，但其在分子层面上的差异可能对疾病的严重程度和进展速度产生影响。因此，本研究通过分析FUS蛋白的NLS区域(即FUS^R514S和FUS^P525L)突变的功能差异，旨在揭示ALS临床表型多样性的分子基础，为开发针对ALS的新型治疗策略奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

亚砷酸钠、多聚甲醛、Hoechst 33342、Flag抗体均购自美国Sigma公司；洋地黄皂苷购自瑞士Biosynth公司；十二烷基-β-D-麦芽糖苷(dodecyl-β-D-maltoside，DDM)、二硫苏糖醇(dithiothreitol，DTT)、4-(2-氨乙基)苯磺酰氟盐酸盐[4-(2-aminoethyl)benzenesulfonylfluoride hydrochloride，AEBSF]、抑肽酶、最佳蛋白酶抑制剂苯丁抑制素(bestatin)、E-64蛋白酶抑制剂、亮肽素半硫酸盐及胃蛋白酶抑制剂均购自上海麦克林公司；乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA)和苯甲基磺酰氟(phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF)均购自美国阿拉丁工业公司；曲拉通(Triton)X-100和吐温(Tween)-20均购自长沙鼎国生物技术有限公司；牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)购自北京索莱宝科技有限公司；β-actin抗体、细胞色素b-c1复合物亚基1(cytochrome b-c1 complex subunit 1，UQCRC1)抗体、多西环素(doxycycline，DOX)、Tris-HCl、溴酚蓝和引物均购自生工生物工程(上海)股份有限公司；MitoSOX Red、MitoTracker Red和嘌呤霉素(ant-pr-5)、Dulbecco的改良Eagle培养基(Dulbecco’s modified eagle medium，DMEM)和DPBS均购自美国赛默飞世尔科技公司Gibco品牌；胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)购自武汉普诺赛生命科技有限公司；胰酶购自长沙艾碧维生物科技有限公司；FUS、α-微管蛋白、胱天蛋白酶-3、T细胞限制性胞内抗原-1(T cell-restricted intracellular antigen-1，TIA-1)、线粒体外膜转运酶22 kD亚基(translocase of outer membrane 22 kD subunit，Tom22)、电压依赖性阴离子通道1(voltage-dependent anion channel 1，VDAC1)、琥珀酸脱氢酶复合体亚基A(succinate dehydrogenase complex subunit A，SDHA)抗体均购自美国Santa Cruz公司；Ras GTP酶激活蛋白结合蛋白1(Ras GTPase-activating protein-binding protein 1，G3BP1)、线粒体外膜转运酶20 kD亚基(translocase of outer membrane 20 kD subunit，Tom20)、线粒体外膜转运酶40 kD亚基(translocase of outer membrane 40 kD subunit，Tom40)、激活转录因子4(activating transcription factor 4，ATF4)、NADH-泛醌氧化还原酶75 kD亚基1(NADH-ubiquinone oxidoreductase 75 kD subunit 1，NDUFS1)、金属内肽酶1(metalloendopeptidase 1，OMA1)抗体均购自武汉三鹰生物技术有限公司；细胞色素c氧化酶IV亚型1(cytochrome c oxidase subunit 4 isoform 1，COX4)、真核起始因子2α(eukaryotic initiation factor 2 alpha，eIF2α)和磷酸化eIF2α(phospho-eIF2α)抗体均购自美国CST(Cell Signaling Technology)公司；PVDF膜 (0.45 µm)购自德国默克集团Millipore公司；普通和超灵敏度增强型化学发光(enhanced chemiluminescence，ECL)显影液分别购自美国Advansta公司和上海雅酶生物公司；限制性内切酶NheI-HF和BamHI-HF均购自美国NEB(New England Biolabs)公司；转染试剂聚乙烯亚胺(polyethylenimine，PEI)购自美国Polysciences公司。

样品缓冲液含Tris-HCl (20 mmol/L，pH 7.4)，EDTA(0.1 mmol/L)，NaCl(50 mmol/L)，甘油(10%)。4×SDS缓冲液含SDS(8%)，甘油(40%)，Tris(pH 6.8，240 mmol/L)，溴酚蓝(0.04%，质量体积比)、DTT(200 mmol/L)，PMSF(4 mmol/L)和4×蛋白酶抑制剂混合液。200×蛋白酶抑制剂混合液含100 mmol/L AEBSF盐酸盐、0.08 mmol/L抑肽酶、5 mmol/L Bestatin、1.5 mmol/L E-64蛋白酶抑制剂、2 mmol/L亮肽素半硫酸盐及1 mmol/L胃蛋白酶抑制剂。

免疫荧光成像采用德国蔡司公司的Axio Imager.M2 ApoTome 2(ApoTome.2)显微镜；蛋白质印迹法显影采用北京森西赛智科技有限公司的ChampChemi910化学发光成像系统；流式细胞术检测采用BD FACS CantoII流式细胞仪。

1.2 方法

1.2.1 FUS蛋白的NLS序列分析和结构预测分析

整合相关参考文献^{[11, 17, 20]}的核心信息绘制FUS蛋白的NLS结构特征简图。

采用美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)在线分析工具分析多物种FUS蛋白的同源性，从而判断致病突变位点的进化保守性。分析对象涵盖的12个物种为：人(NP_004951.1，human，Homo sapiens)、小鼠(NP_631888.1，mouse，Mus musculus)、大鼠(NP_001012137.1，rat，Rattus norvegicus)、斑马鱼(NP_957377.2，zebrafish，Danio rerio)、牛(XP_005224884.2，cattle，Bos taurus)、野猪(XP_001274349.1，wild boar，Sus scrofa)、狗(XP_005621295.2，dog，Canis lupus familiaris)、狨猴(XP_035123359.2，marmoset，Callithrix jacchus)、热带爪蟾(XP_012809196.1，tropical clawed frog，Xenopus tropicalis)、尖吻鲈(XP_001852409601，barramundi，Lates calcarifer)、黑猩猩(NP_0001315215.1，chimpanzee，Pan troglodytes)及仓鼠(XP_0003511037.1，hamster，Cricetulus griseus)。

利用PyMOL软件(2.4.0版本)对蛋白质数据库(Protein Data Bank，PDB)核输入蛋白(青色)与FUS蛋白(509-526位氨基酸，黄色)复合物的三维结构(PDB ID：5YVG)进行分析，并通过PyMOL软件完成可视化展示。FUS突变体的构建采用PyMOL中的突变向导工具(mutagenesis wizard)，通过选择目标构象异构体并执行突变流程实现。

1.2.2 质粒构建

以互补DNA(complementary DNA，cDNA)为模板，通过聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)扩增获得带有与载体相匹配同源臂的FUS^WT(野生型)和FUS^P525L(突变型)基因片段，引物序列见表1。使用限制性内切酶NheI-HF和BamHI-HF对pCW57.1-3×Flag-13×His质粒进行酶切，经琼脂糖凝胶电泳后切胶回收，获得线性载体片段。随后，用Gibson assembly同源重组法连接带有相同同源臂序列的基因片段和载体片段，构建pCW57.1-hFUSWT-3×Flag-13×His质粒和pCW57.1-hFUSP525L-3×Flag-13×His质粒。以pCW57.1-hFUSWT-3×Flag-13×His的质粒为模板，进一步通过PCR扩增出带有与载体相匹配的同源臂的FUS^R514S(突变型)基因片段，构建pCW57.1-hFUSR514S-3×Flag-13×His质粒，引物序列见表1。

1.2.3 稳转细胞系的构建与验证

按照PEI说明书将带有野生型或突变型FUS基因的pCW57.1质粒和病毒包装质粒psPAX2和pMD2G转染进入人胚肾细胞株(human embryonic kidney 293T，HEK293T)细胞，收集48 h后的病毒上清液，离心并过滤去除细胞碎片，将病毒上清液感染新鲜的HEK293T细胞，孵育24 h后，用含有2 μg/mL 嘌呤霉素的DMEM进行筛选，2周后，存活下来的细胞即为将带有Flag标签的外源FUS基因整合到基因组中的细胞。建系成功之后，用1 μg/mL DOX诱导 48 h，采用细胞免疫荧光法或蛋白质印迹法验证外源性蛋白质的表达情况。

1.2.4 免疫荧光法

细胞经药物处理后，用含4%多聚甲醛的磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)于室温下处理15 min后固定细胞，用含0.05%Tween-20的PBS轻轻洗涤后，再用含0.1% Triton X-100的PBS对细胞进行透化处理，于室温下处理15 min后，用含0.05% Tween-20的PBS轻轻洗涤，然后用含1% BSA、0.05% Tween-20的PBS封闭，于室温下处理至少1 h，将一抗用含1% BSA、0.05%Tween-20的PBS稀释，于4 ℃孵育过夜。用含0.05%Tween-20的PBS轻轻洗涤后，将二抗用含1%BSA、0.05%Tween-20的PBS稀释，于室温下避光孵育至少1 h。用PBS轻轻洗涤后，用1 μg/mL Hoechst染色剂室温避光孵育5 min，用含0.05% Tween-20的PBS轻轻洗涤2次后，用去离子水轻轻洗涤，最后用封片剂封片。

为研究突变对FUS蛋白亚细胞定位的影响，在DOX诱导48 h后，采用免疫荧光法来观察野生型/突变型FUS蛋白的亚细胞定位情况。

SGs的动态变化包括形成与解聚2个阶段，FUS蛋白参与SGs的形成。为研究野生型/突变型FUS蛋白表达对SGs动力学的影响，在DOX诱导48 h后加入亚砷酸钠(工作浓度为0.5 mmol/L)处理1 h，进一步构建由亚砷酸钠诱导SGs形成的细胞模型，并进行免疫荧光实验。为了探讨野生型/突变型FUS蛋白对SGs解聚的影响，在DOX诱导野生型/突变型FUS蛋白表达48 h后，加入亚砷酸钠(工作浓度为0.5 mmol/L)处理30 min，并在撤药0、1和2 h后进行免疫荧光实验。其中，G3BP1是SGs的核心组分，在细胞应激响应中发挥重要作用，因此本研究使用G3BP1作为SGs的标志蛋白质。

1.2.5 蛋白质组分提取分析

为了研究野生型/突变型FUS蛋白在细胞中的分布和聚集状态，本研究在DOX诱导野生型/突变型FUS蛋白表达48 h后消化收集细胞，并利用0.005%洋地黄皂苷(一种温和的非离子去垢剂，其对不同亚细胞分布的蛋白质的提取效率因细胞膜脂质成分和蛋白质聚合程度的差异而有所不同)进行透化处理^[22-23]。将去垢剂溶于样品缓冲液，在冰上预冷，试剂需要现配现用。用胰酶消化细胞数分钟，待细胞脱离培养皿后，用培养基中和胰酶，轻柔吹打，使细胞悬浮在培养基中，100 g室温离心2 min后，去除上清，用PBS轻轻洗涤后，再次离心，然后在细胞沉淀中加入预冷的含有指定浓度去垢剂的样品缓冲液，轻柔吹打15次，并在冰上静置30 min以释放可溶性蛋白质，在15 min时，轻弹管底，以促进裂解。随后，12 000 g于4 ℃离心15 min，上清液为该浓度去垢剂条件下的可溶性蛋白质，沉淀为该浓度去垢剂条件下的不可溶性蛋白质。随后，分别取上清液和沉淀制备蛋白质样品，并进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)和蛋白质印迹法分析。

1.2.6 蓝绿温和聚丙烯酰胺凝胶电泳

采用蓝色非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(blue native-polyacrylamide gel electrophoresis，BN-PAGE)技术检测FUS突变是否影响复合体的形成和稳定性。本研究通过DOX诱导野生型/突变型FUS蛋白表达48 h后，采用浓度为0.25%、0.5%、1%的DDM(一种非离子型表面活性剂，常用于非变性条件下研究蛋白质复合体)分别提取细胞中的蛋白质。随后用于BN-PAGE分析，样品需全程在低温环境中操作，上清液加入1/9体积的10×BN上样缓冲液，混匀后通过BN-PAGE分离蛋白质。

1.2.7 SDS-PAGE及蛋白质印迹法

若样品用于SDS-PAGE分析，则在上清液中加入 1/3体积的4×SDS上样缓冲液，沉淀用样品缓冲液稀释的4×SDS缓冲液(SDS终浓度2%)溶解，于95 ℃高温处理15 min，冷却后短暂离心，即可进行SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白质。

为探究FUS蛋白突变对线粒体的影响，本研究将野生型/突变型FUS蛋白细胞系用DOX诱导48 h后，利用SDS-PAGE和蛋白质印迹法分析线粒体外膜蛋白、呼吸链复合体相关蛋白质、线粒体质量控制蛋白质的稳态水平，观察野生型/突变型FUS蛋白对上述线粒体功能蛋白质的影响。

整合应激反应(integrated stress response，ISR)参与SGs的调节过程，且突变型FUS蛋白的积累能够激活ISR，进而导致轴突中蛋白质翻译的局部抑制。其中，真核起始因子eIF2α是翻译起始过程中的关键调控因子，其磷酸化是ISR激活的早期且关键事件。eIF2α的磷酸化通过抑制整体蛋白质合成，并选择性地促进应激反应相关基因(如ATF4)的表达，帮助细胞适应应激条件。基于此，本研究采用SDS-PAGE分析ISR的标志蛋白质，探究错误定位的突变型FUS是否会影响ISR的激活。

1.2.8 流式细胞术检测线粒体膜电势与活性氧水平

为了进一步探究ALS相关的FUS突变致病性与线粒体之间的关系，本研究检测了野生型/突变型FUS蛋白过表达对线粒体膜电势和活性氧(reactive oxygen species，ROS)水平的影响，以明确其对线粒体功能的影响。过表达野生型/突变型FUS蛋白的细胞经DOX诱导48 h后，分别采用100 nmol/L MitoTracker Red或5 μmol/L MitoSOX Red于37 ℃细胞培养箱中染色30 min；随后用胰酶消化细胞，离心收集细胞沉淀，经DPBS重悬后进行流式细胞术检测。

1.3 统计学处理

荧光图像和蛋白质印迹法定量分析均采用Fiji软件进行，其中，SGs的直径通过Fiji软件的Analyze-Analyze Particles功能进行测量计算。数据统计则使用GraphPad Prism软件完成，对于2组数据的比较，采用Student’s t检验或费舍尔精确检验(Fisher’s exact test)，而对于多组数据的比较，则采用单因素方差分析(analysis of variance，ANOVA)。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 FUS的NLS序列分析和结构预测分析

FUS蛋白NLS序列结构分析结果显示：FUS蛋白NLS序列中的常见致病突变位点包括N端PGKM疏水序列、中部富含精氨酸的α-螺旋，以及C端的PY基序(图1A)；其中，R514和P525变异位点在12个不同物种中均表现出高度保守性(图1B)。对PDB中的核输入蛋白β2(青色)与FUS(509-526，黄色)复合物的三维结构进行分析(PDB ID：5YVG)，结果显示：R514位于NLS的α-螺旋区域，并与核输入蛋白β2上的D646和S591在3.4~3.7 Å (1Å=10^-10 m)范围内形成氢键(图1C)；当R514突变为Ser时，其侧链长度缩短，无法与D646和S591形成有效的氢键，从而削弱了FUS蛋白与importin-β2之间的相互作用稳定性(图1D)；此外，P525位于NLS的C末端，被2个非极性残基W460和L419包围，并通过疏水相互作用得以稳定(图1E)；当L525突变为Leu时，氨基酸侧链环状结构消失影响了FUS与importin-β2的疏水稳定性(图1F)。综上所述，FUS蛋白NLS区域的ALS致病突变(FUS^R514S和FUS^P525L)可能影响FUS蛋白的生物学功能。

2.2 野生型和突变型FUS蛋白的表达、亚细胞定位 和复合体特性

Sanger测序结果表明本研究成功构建了野生型及突变型FUS过表达质粒(图2A、2B)。

蛋白质印迹法结果表明：FUS野生型和突变型诱导表达细胞系均可有效表达FUS蛋白，且外源FUS蛋白可轻微抑制内源FUS的表达(图2C)。

免疫荧光法结果显示：野生型的FUS蛋白主要定位于细胞核中(约占84.3%)，细胞质中仅有少量分布(约占15.7%)；而FUS突变型的FUS蛋白失去核定位，呈现出明显的细胞质定位(FUS^R514S和FUS^R525L分别占94.9%和98.6%)，且呈非均质分布的颗粒状 (图2D、2E)。

BN-PAGE实验结果显示：线粒体外膜TOM复合体在0.25%的DDM中较稳定，在0.5%的DDM中发生轻微降解，且在1%的DDM中完全解离(附图1，https//doi.org/10.57760/sciencedb.33206)；然而，FUS野生型和突变型在BN-PAGE上均形成1个位于66 kD到132 kD之间的条带，且在不同浓度的DDM处理条件下稳定存在(附图1，https//doi.org/10.57760/sciencedb. 33206)。

流式细胞术结果显示：野生型和突变型的FUS蛋白细胞线粒体的膜电势及ROS水平差异均无统计学意义(均P>0.05，图2F、2G)。SDS-PAGE结果显示：野生型和突变型FUS蛋白的表达均未对其线粒体蛋白质的稳态水平造成明显改变(均P>0.05， 图2H、2I)。

2.3 野生型和突变型FUS蛋白对SGs形成的影响

免疫荧光法结果显示：未加药处理时，细胞系中G3BP1蛋白在细胞质中均匀弥散分布；而在亚砷酸钠处理1 h后，G3BP1蛋白明显聚集成颗粒；同时，经过亚砷酸钠处理后，野生型和突变型FUS蛋白均与G3BP1共定位(图3)。

组分提取实验结果显示：在洋地黄皂苷的透化作用下，α-微管蛋白和胱天蛋白酶-3主要富集于上清液中，而β-actin、Tom20和TIA-1则主要分布于沉淀中(图4)。

免疫荧光法结果显示：将亚砷酸钠的处理时间缩短至10 min时，在表达野生型和突变型FUS蛋白的细胞系中均无SGs的形成；而当处理时间缩短至20 min和30 min时，2种细胞系的细胞质中均初步形成了SGs(图5A)；当亚砷酸钠处理20 min时，在表达野生型FUS蛋白的细胞中，SGs阳性细胞仅约占Flag阳性细胞总数的50%；相比之下，在表达FUS^R514S突变型蛋白的细胞中，SGs阳性细胞占比约为87.3%，而在表达FUS^P525L突变型FUS蛋白的细胞中，该比例高达93.7%，显著高于表达野生型FUS蛋白的细胞；当处理时间达到30 min后，野生型和突变型FUS蛋白过表达的细胞中，SGs阳性的细胞比例均超过90%(图5B)。

进一步分析不同处理时间下表达野生型和突变型FUS蛋白的细胞中SGs直径，结果显示：经亚砷酸钠处理20 min时，与表达野生型FUS蛋白的细胞相比，2种表达突变型(FUS^R514S和FUS^P525L)FUS蛋白的细胞中的SGs直径均较大(均P<0.05)，而2种表达突变型FUS蛋白的细胞形成的SGs直径差异无统计学意义(P>0.05，图5C)；经亚砷酸钠处理30 min后，与表达野生型的细胞相比，表达FUS^R514S突变型FUS蛋白的细胞中的SGs直径差异无统计学意义(P>0.05)，而表达FUS^P525L突变型FUS蛋白细胞中的SGs直径仍显著较大(P<0.05，图5C)。

2.4 野生型和突变型FUS蛋白对SGs解聚的影响

免疫荧光法结果(图6)显示：经亚砷酸钠处理 30 min后，野生型和突变型FUS蛋白均已参与形成SGs；撤药1 h后，在表达野生型和突变型FUS蛋白的细胞中，部分SGs开始解聚，且在Flag阳性细胞中，含SGs的细胞比例均约为65%，野生型和突变型间差异均无统计学意义(均P>0.05)；撤药2 h后，在表达野生型和突变型FUS蛋白的细胞中的SGs完全解聚。

2.5 野生型和突变型FUS蛋白对ISR的影响

蛋白质印迹法结果(图7)显示：在FUS^R514S和FUS^P525L的表达量略低于FUS^WT的前提条件下，过表达FUS^R514S显著提高了eIF2α的磷酸化水平，而过表达FUS^P525L则未表现出这种效果；亚砷酸钠处理后，eIF2α磷酸化水平在所有组中均显著升高；尽管在亚砷酸钠处理后，过表达野生型或突变型FUS蛋白的细胞中，eIF2α的磷酸化水平差异无统计学意义，但其下游因子ATF4在FUS^R514S过表达组中的蛋白质水平较FUS^WT和FUS^P525L略有升高。

3 讨 论

ALS相关的FUS蛋白NLS序列中的致病突变(包括R514S、P525L等)在12个不同物种中高度保守，提示这些突变可能显著影响NLS序列的功能。由于核输入蛋白β2通过与NLS结合介导FUS的核输入^[11]，本研究对PDB中的核输入蛋白β2与FUS复合物的三维结构进行了相互作用分析，结果表明：FUS^R514S突变导致FUS蛋白侧链长度缩短，无法与核输入蛋白 β2的Asp646和Ser591形成有效氢键，从而削弱了二者之间的相互作用稳定性。而FUS^P525L突变则破坏了Pro525与非极性残基Trp460和Leu419之间的疏水相互作用，进而影响FUS蛋白与核输入蛋白β2的结合稳定性。基于这些发现，本研究构建了可诱导表达野生型及突变型FUS融合蛋白的稳定细胞系。并在细胞水平上展开了一系列功能实验，以探索突变导致疾病的分子机制。

蛋白质印迹法实验结果显示，外源性FUS的表达对内源性FUS的表达有轻微抑制作用。这可能是由于FUS通过与其信使RNA的第7号外显子结合来调节自身表达水平，而突变可能干扰了这一机制^[24]。细胞免疫荧光法结果进一步表明，野生型FUS蛋白主要定位于细胞核，细胞质中仅有少量分布；而R514S和P525L突变型FUS则被错误定位于细胞质，并呈现非均匀的颗粒状分布。本研究发现的R514S和P525L突变导致FUS核定位功能受损、细胞质异常聚集的表型，与既往研究^[25-26]证实的“FUS细胞质错误定位是ALS发病的关键病理特征且与病程严重程度相关”形成呼应，进而为这两种突变的ALS致病性提供了直接的细胞水平证据。

FUS蛋白的细胞质错误定位可能使其更易参与SGs的组装。进一步的研究发现，FUS的NLS致病突变确实会影响SGs的动力学性质。亚砷酸钠诱导的SGs形成实验^[27]显示，野生型和突变型FUS均与G3BP1共定位并参与SGs的形成(G3BP1是SGs的核心组分，因此本研究使用G3BP1作为SGs的标志蛋白质)。然而，突变型比野生型FUS蛋白更快地参与SGs的形成，并形成直径更大的颗粒，尤其是P525L突变型。

免疫荧光法结果显示G3BP1主要分布于细胞质，而在0.005%洋地黄皂苷透化提取实验中，其在上清液和沉淀中均有显著分布，提示G3BP1在细胞质中的聚合状态与α-微管蛋白、胱天蛋白酶-3等细胞质蛋白质存在明显差异。在未用亚砷酸钠处理时，野生型FUS蛋白主要富集于沉淀，表明其主要定位于细胞核或与核相关的结构中，上清液中的含量相对较少。然而，当亚砷酸钠诱导SGs形成后，野生型FUS蛋白水平在上清液中显著升高，这与图3所示的应激条件下FUS蛋白从核向细胞质迁移的现象一致。相比之下，对于FUS的突变型，FUS^R514S在未处理亚砷酸钠时，其在上清液中的水平已显著高于野生型，而FUS^P525L在上清液中的水平虽然与野生型的差异无统计学意义，但也呈现出上升的趋势。这进一步支持了野生型和突变型FUS蛋白不同的亚细胞定位模式，即突变型FUS蛋白在细胞质中预先形成聚集的小颗粒。此外，与FUS^P525L相比，FUS^R514S更易于被0.005%的洋地黄皂苷提取，尽管其差异无统计学意义，但表明2种突变型FUS在细胞质中的分布和聚集状态存在差异，这可能是它们致病机制不同的原因之一。

尽管本研究在生化水平观察到了野生型和突变型FUS蛋白提取效率的差异，但在免疫荧光法中却未发现其在SGs形成上存在明显区别。这提示在本研究中野生型和突变型FUS蛋白在SGs形成过程中的差异需要在更短的时间尺度上才能显现。因此，本研究缩短了亚砷酸钠的处理时间，并进行了时间梯度的摸索。综合细胞亚定位结果，本研究认为突变型FUS在应激条件下具有细胞质位置优势和聚集性状优势，使其更快地参与SGs的形成，并形成更大的颗粒(特别是P525L)。

此外，亚砷酸钠撤药实验显示，野生型和突变型FUS对SGs的解聚影响有限。考虑到ALS患者神经细胞可能长期处于慢性应激状态，短期刺激 不足以使致病突变FUS促使SGs完成“液-固相转变”，从而形成纤维聚集体。SGs的液态特性也不直接决定其解聚率，这可能是由于其不同的组成及FUS及其突变型与SGs成分的相互作用^[28]。

除SGs动力学改变外，突变型FUS对ISR的调控差异可能进一步造成细胞稳态的不同。与野生型及FUS^P525L突变相比，FUS^R514S突变的细胞在未受外界压力刺激的情况下，磷酸化eIF2α与总eIF2α的比值显著升高，表明FUS^R514S突变可能在基础条件下激活了ISR。ISR是一种细胞应激反应机制，通过磷酸化eIF2α抑制蛋白质翻译，从而减少能量消耗并促进细胞适应应激条件。ISR在中枢神经系统疾病中的作用具有双重性。一方面，短暂的ISR激活能够通过降低能量消耗并增加应激相关分子的表达来促进细胞存活；另一方面，强烈且持续的ISR激活则可能导致细胞死亡，因为这种情况下细胞内大量蛋白质合成的缺失会严重影响细胞的正常功能^[29]。在本研究中，FUS突变引发的ISR激活究竟是保护因素还是致病因素仍有待进一步研究阐明。本研究推测，R514S突变引发的ISR激活可能在FUS相关疾病的发展中起到关键作用，但其具体机制仍需进一步研究。

综上所述，本研究推测FUS^R514S和FUS^P525L突变可能通过影响NLS序列的关键表位，干扰FUS与核输入蛋白β2的结合，阻碍其核运输，导致FUS蛋白在细胞质中错误定位和异常聚集。这一过程可能在ALS的发病机制中起关键作用。在应激条件下，突变型FUS蛋白可能快速参与SGs的形成，影响其动力学特性，形成更大的SGs(特别是P525L)，这可能与携带该突变的患者生存期更短和模型动物神经元丢失更严重的表型相关^{[27, 30]}。此外，FUS^R514S突变可能通过激活ISR影响细胞稳态，这可能与FUS^R514S和FUS^P525L突变不同的表型及临床表现有关。已有研究^[30-31]表明：FUS^P525L突变会导致FUS蛋白在细胞质中异常聚集，并形成不溶性聚集体，这种聚集对神经元具有显著的毒性作用，进而导致严重的神经元丢失。FUS^R514S突变也在多个研究^[32-33]中被认定为ALS的致病突变，然而关于其具体致病机制的研究相对较少。从发病年龄、疾病进展及生存期等多个方面看，FUS^P525L突变所导致的疾病往往比FUS^R514S突变更严重^{[21, 25]}，提示不同FUS突变的致病机制可能存在异质性。本研究的结果支持这种假设，但不同FUS突变致病机制的异同及其与临床表型的关联仍需要进一步深入研究。

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湖南省自然科学基金(2022JJ30914)

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