IGHMBP2基因突变所致常染色体隐性遗传性腓骨肌萎缩症2S型患者外周血单个核细胞来源的诱导多能干细胞的构建

Generation of induced pluripotent stem cells from peripheral blood mononuclear cells of a patient with autosomal recessive Charcot-Marie-Tooth disease type 2S caused by IGHMBP2 mutations

摘要

目的 腓骨肌萎缩症(Charcot-Marie-Tooth disease，CMT)是中国《第一批罕见病目录》中1种常见的具有高度临床和遗传异质性的周围神经单基因遗传病。免疫球蛋白μ结合蛋白2(immunoglobulin μ-binding protein 2，IGHMBP2)是一种全身广泛表达的核酸解旋酶，其基因突变可致常染色体隐性遗传性CMT 2S型(autosomal recessive CMT type 2S，AR-CMT2S)，但相关机制尚不明确。本研究旨在建立IGHMBP2基因突变(c.884A>G及c.791G>A突变)所致AR-CMT2S患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)来源的诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)，为相关分子机制研究和干细胞治疗提供新的细胞模型。 方法 收集并分析2022年9月中南大学湘雅三医院神经内科门诊收治的1例AR-CMT2S患者的资料，通过二代测序明确其携带IGHMBP2致病变异，并在征得患者知情同意后，收集其外周血20 mL，提取PBMCs。利用仙台病毒感染及重编程PBMCs以获得iPSCs，并对其进行多能性、分化能力、细胞核型鉴定及短串联重复序列分析(short tandem repeat analysis，STR)。 结果 成功获得AR-CMT2S患者来源的iPSCs，其所携带基因突变与患者临床背景一致，且可表达多能干性标志物，具备自我更新及体外分化能力，细胞核型为正常的二倍体(46，XX)。 结论 成功建立了AR-CMT2S患者来源的iPSCs，该细胞系可为AR-CMT2S的发病机制研究提供新模型，为有效治疗手段的开发提供新工具。

Abstract

Objective Charcot-Marie-Tooth disease (CMT) is a group of common monogenic peripheral neuropathies listed in the first National Rare Disease Catalog of China and is characterized by marked clinical and genetic heterogeneity. Immunoglobulin μ-binding protein 2 (IGHMBP2) is a ubiquitously expressed nucleic acid helicase, and mutations in the IGHMBP2 gene can cause autosomal recessive CMT type 2S (AR-CMT2S). However, the underlying pathogenic mechanisms remain unclear. This study aims to generate induced pluripotent stem cells (iPSCs) derived from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) of a patient with AR-CMT2S caused by IGHMBP2 mutations (c.884A>G and c.791G>A), thereby providing a novel cellular model for mechanistic studies and stem cell-based therapeutic research. Methods Clinical data of a patient with AR-CMT2S who was diagnosed in September 2022 at the Department of Neurology, Third Xiangya Hospital of Central South University, were collected and analyzed. Pathogenic variants in IGHMBP2 were confirmed by next-generation sequencing. After obtaining written informed consent, 20 mL of peripheral blood was collected, and PBMCs were isolated. PBMCs were reprogrammed into iPSCs using Sendai virus-mediated transduction. The generated iPSCs were characterized for pluripotency marker expression, self-renewal capacity, in vitro differentiation potential, karyotype integrity, and short tandem repeat (STR) profiling. Results The iPSCs derived from the AR-CMT2S patient were successfully generated. The established iPSC line retained the same IGHMBP2 mutations as those identified in the patient and expressed key pluripotency markers. The cells exhibited robust self-renewal and the ability to differentiate in vitro. Karyotype analysis demonstrated a normal diploid karyotype (46, XX). Conclusion An iPSC line derived from a patient with AR-CMT2S caused by IGHMBP2 mutations is successfully established. This patient-specific iPSC line provides a valuable cellular model for investigating the pathogenesis of AR-CMT2S and offers a novel tool for the development of effective therapeutic strategies.

Graphical abstract

关键词

IGHMBP2基因 / 腓骨肌萎缩症 / 常染色体隐性遗传性腓骨肌萎缩症2S型 / 诱导多能干细胞 / 外周血单个核细胞 / 重编程 / 细胞系

Key words

IGHMBP2 gene / Charcot-Marie-Tooth disease / autosomal recessive Charcot-Marie-Tooth disease type 2S / induced pluripotent stem cells / peripheral blood mononuclear cells / reprogramming / cell line

腓骨肌萎缩症(Charcot-Marie-Tooth disease，CMT)又称遗传性运动感觉性周围神经病，它是中国《第一批罕见病目录》中1种常见的具有高度临床和遗传异质性的周围神经单基因遗传病^[1]。其主要临床特征为慢性进行性四肢远端肌无力肌萎缩、感觉障碍、腱反射减退或消失和高弓足等骨骼畸形，全球患病率约1/2 500^[2]。2014年，Cottenie等^[3]应用二代测序及连锁分析的方法发现IGHMBP2突变可致常染色体隐性遗传性CMT 2S型(autosomal recessive CMT type 2S，AR-CMT2S)。免疫球蛋白μ结合蛋白2(immunoglobulin μ-binding protein 2，IGHMBP2)是1种全身广泛表达的核酸解旋酶，其基因突变可致蛋白质功能缺失，但该蛋白质功能缺失后通过何种核心机制导致AR-CMT2S尚不明确。AR-CMT2S的临床症状重，致残率高，目前尚无有效治疗手段。因此，亟需通过合适的细胞模型深入研究该病的发病机制并寻找特异的治疗靶点。

由于人与其他模式生物之间的物种差异性很大，患者来源的细胞模型在发病机制探索、新药筛选及干细胞治疗中均具有巨大的优势。诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)是一种通过导入特定的转录因子将终末分化的体细胞重编程、去分化得到的多能干细胞，具有定向分化为几乎所有类型体细胞的能力，是目前研究发病机制及细胞疗法最有潜力的细胞之一^[4-5]。然而，目前尚无AR-CMT2S患者来源的诱导多能干细胞-运动神经元(induced pluripotent stem cells-motor neurons，iPSCs-MNs)构建的报道。因此，本研究拟利用非整合技术构建人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)重编程平台，建立1例AR-CMT2S患者PBMCs来源的iPSCs，旨在为IGHMBP2基因突变所致CMT的研究提供更理想的细胞模型。

1 材料与方法

1.1 伦理声明

本研究已通过中南大学湘雅三医院医学伦理委员会批准(审批号：2023-S305)。健康志愿者及患者均已签署知情同意书。

1.2 临床信息收集

收集2022年9月中南大学湘雅三医院神经内科门诊收治的1例AR-CMT2S患者的资料，整理并分析其病史、体征、家族史、神经肌电图、神经肌肉病理、二代测序结果等临床信息。采用CMT神经病变第2版评分(CMT neuropathy score second version，CMTNS2)和CMT临床检查评分(CMT examination score，CMTES)^[6]对患者进行评分。二代测序结果根据美国医学遗传学与基因组学学会及分子病理学会联合共识(American College of Medical Genetics and Genomics and the Association for Molecular Pathology，ACMG/AMP)推荐的序列变异解读标准与指南^[7]进行分级及判断是否为致病突变。

1.3 病理组织染色

取患者的小段腓肠神经，经固定、冲洗、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片后，分别使用苏木精-伊红(hematoxylin and eosin，HE)染色、甲苯胺蓝染色、髓鞘碱性蛋白质(myelin basic protein，MBP)染色后在光学显微镜(购自日本奥林巴斯公司)下观察、拍片。

1.4 PBMCs的分离与冻存

采集AR-CMT2S患者和健康志愿者(对照)的外周血20 mL，采用淋巴细胞分离液提取其PBMCs，用含10%二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)的胎牛血清重悬PBMCs，-80 ℃冷冻过夜后置于液氮中长期保存。

1.5 PBMCs的重编程

复苏冷冻保存的PBMCs，根据CytoTune 2.0仙台病毒重编程试剂盒(购自美国Thermo Fisher Scientific公司)的说明书计算并加入感染细胞所需的病毒量(1×10⁶ CIU/mL）。所加入的人类Kruppel样因子4-八聚体结合转录因子3/4-SRY框转录因子2(human Kruppel-like factor 4-octamer-binding transcription factor 3/4-SRY-box transcription factor 2，hKOS)、人类细胞性髓细胞瘤病致癌基因(human cellular myelocytomatosis oncogene，hc-Myc)、人类Kruppel样因子4(human Kruppel-like factor 4，hKlf4)病毒的感染复数(multiplicity of infection，MOI)比例为5꞉5꞉3，3种病毒的滴度分别为1.1×10⁸、8.1×10⁷、9.3×10⁷ CIU/mL。在常温下孵育过夜后，弃去含病毒的培养液，更换为PBMCs完全培养基。培养2 d后，将细胞按1 000、2 000、4 000、5 000个/cm²共4个梯度密度接种于饲养细胞包被的细胞培养皿中共培养。第3至6天，更换为新鲜的StemPro-34完全培养基，并隔天进行半量换液，减少对脆弱贴壁细胞的扰动。第7天，半量换液Essential 8培养基，让细胞平缓适应新培养环境；从第8天起，每天全量换液Essential 8培养基，以满足iPSCs克隆快速生长的代谢需求。10 d左右形成独立的、大小不一的克隆，挑选单克隆接种至Matrigel(购自美国Corning公司)预处理后的24孔板或48孔板，用mTeSR1(购自加拿大STEMCELL Technologies公司)继续培养，每24 h换液1次。随后可进行iPSCs的传代或冻存。

1.6 iPSCs的培养与传代

采用mTeSR1(购自加拿大STEMCELL Technologies公司)培养对照及AR-CMT2S患者的iPSCs，当细胞融合度达80%时，使用TrypLe Express(购自美国Gibco公司)按照1꞉4~1꞉6的比例进行细胞的消化和传代。传代时，使用加入Y-27632二盐酸盐(购自英国Tocris Bioscience公司)的培养基促进iPSCs贴壁生长，使其形成覆盖培养容器表面的单细胞层。在37 ℃、5% CO₂、饱和湿度的条件下进行培养，每日换液。

1.7 iPSCs的鉴定

1.7.1 一代测序

常规方法提取对照及AR-CMT2S患者iPSCs的基因组DNA(genomic DNA，gDNA)，送深圳华大基因科技有限公司进行一代测序，Seqman软件查看测序结果并验证AR-CMT2S患者来源的iPSCs是否携带突变位点。

1.7.2 免疫荧光

细胞培养2~3 d后，用4%多聚甲醛固定细胞15 min，0.3%Triton X-100破膜15 min，再用3%牛血清白蛋白溶液(bovine serum albumin，BSA；购自美国Sigma公司)于室温下封闭１ h。加入稀释后的一抗，包括Nanog同源框蛋白(nanog homeobox protein，Nanog)(稀释比1꞉400；购自美国Cell Signaling Technology公司，货号：4903S)、八聚体结合转录因子4(octamer-binding transcription factor 4，Oct-4)(稀释比1꞉1 000；购自美国BD公司，货号：561555)、肿瘤排斥抗原1-60(tumor rejection antigen 1-60，TRA-1-60)(稀释比1꞉2 000；购自美国Cell Signaling Technology公司，货号：4746)，４ ℃孵育过夜。次日，室温孵育二抗546 donkey anti-Rabbit IgG(稀释比1꞉1 000；购自美国Invitrogen公司，货号：A10040)1 h后，使用4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(4’,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)染细胞核，封片并于蔡司显微镜(购自德国蔡司公司)下观察、拍片。

1.7.3 流式细胞术

采用流式细胞术检测iPSCs的多能性标志物的表达情况。按照说明书推荐剂量，将TRA-1-60、阶段特异性胚胎抗原-4(stage-specific embryonic antigen-4，SSEA-4)、Oct-4、Nanog(均购自美国BD Pharmingen公司，货号分别为560128、560850、560186、561300)使用含1% BSA的杜氏磷酸盐缓冲液(Dulbecco’s phosphate-buffered saline，DPBS)稀释，并加入5% Fc受体阻断剂以减少非特异性结合。将稀释好的TRA-1-60和SSEA-4分别加入未经固定和破膜处理的细胞沉淀中，Oct-4及Nanog加入经过固定破膜处理的细胞沉淀中，均避光常温孵育30 min，清洗后加入DPBS制成细胞悬液。相应的同型对照抗体(均购自美国BD Pharmingen公司，货号分别为559926、560806、559320)，按相同条件分别染色作为阴性对照。样品在避光条件下室温孵育30 min，洗涤后重悬于DPBS中，采用流式细胞仪(购自美国BD Biosciences公司)进行检测和分析。

1.7.4 染色体核型分析

取上述成功建系的iPSCs进行培养，细胞生长至对数期，加入100 μg/mL的秋水仙素40 μL处理 60 min，使细胞分裂停止在中期相。加入TrypLe Express对细胞进行消化后收集细胞沉淀，加入37 ℃预热的0.075 mol/L的KCl低渗溶液，吹打均匀，37 ℃孵育20 min，使iPSCs解体。重复加入卡诺氏固定液(冰醋酸꞉甲醇=1꞉3)对细胞进行多次固定后，取少量固定细胞悬液，从距载玻片约30 cm处滴片。滴片后将载玻片置于75 ℃恒温箱中烘烤3 h以固定染色体。加入吉姆萨染液，染色8 min。选取20个分裂良好的中期相细胞进行染色体G显带分析。

1.7.5 三胚层分化

拟胚体(embryoid bodies，EBs)的形成采用商品化培养基Gibco^TM Embryoid Body Formation Medium(购自美国Thermo Fisher Scientific公司)，iPSCs扩增至80%时，加入iPSCs消化液进行消化后加入3~5倍体积的培养基终止消化；以300 g的转速离心5 min，加入iPSCs培养基和Y27632，重悬细胞。将重悬后的iPSCs转移至超低吸附6孔板中培养24 h，之后更换不含Y27632的新鲜EBs形成培养基，每天进行半换液。7 d后，吸出EBs，在离心管中轻柔吹打去除表面死细胞，静置后弃上清。将EBs转移至经过基质胶铺板的24孔板中继续培养，每天更换含20%胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)的分化培养基进行自发分化，此过程持续14~21 d。整个分化期间不使用其他特异性分化诱导剂。第21天，固定细胞并使用各胚层的特异性抗体进行荧光染色，所用抗体包括内胚层的SRY框转录因子17(SRY-box transcription factor 17，SOX17)(稀释比1꞉3 200；购自美国Cell Signaling Technology公司，货号：81778)和叉头框蛋白A2 (forkhead box A2，FOXA2) (稀释比1꞉400；购自美国Cell Signaling Technology公司，货号：8168)，中胚层的短尾蛋白(Brachyury) (稀释比1꞉1 600；购自美国Cell Signaling Technology公司，货号：81694)和α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA) (稀释比1꞉400；购自美国Cell Signaling Technology公司，货号：19245)，以及外胚层的配对盒蛋白6(paired box protein 6，Pax6) (稀释比1꞉350；购自美国Cell Signaling Technology公司，货号：60433)和β-III-微管蛋白(β-III-tubulin)(稀释比1꞉400；购自美国Cell Signaling Technology公司，货号：5568)。使用ImageJ软件计算各胚层标志物阳性的细胞占总细胞的百分比。

1.7.6 短串联重复序列分析

采用短串联重复序列分析(short tandem repeat analysis，STR)对细胞的来源进行鉴定。采用常规方法提取患者及对照的PBMCs和iPSCs的gDNA，采用人类STRtyper-28G扩增荧光检测试剂盒结合多重扩增荧光法对gDNA进行扩增，使用Thermo Fisher 3500基因分析仪(购自美国Thermo Fisher Scientific公司)对PCR产物进行毛细管电泳分离，采用GeneMapper v.5.0软件(美国应用生物系统公司)进行数据分析。

1.7.7 反转录聚合酶链反应

采用反转录聚合酶链式反应(reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR)检测仙台病毒的清除情况。使用TRIzol^TM试剂(购自美国Invitrogen公司)从iPSCs(第20代)中提取总RNA，并使用SuperScript^TM III反转录酶(购自美国Invitrogen公司)合成互补DNA(complementary DNA，cDNA)。PCR循环程序如下：95 ℃ 3 min预变性；95 ℃ 15 s、60 ℃ 15 s、72 ℃ 15 s，共35个循环；72 ℃ 5 min彻底延伸。获得的PCR产物通过1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，Bio-Rad显像仪(购自美国Bio-Rad Laboratories公司)观察，阳性对照为重编程第2天的PBMCs的cDNA。所使用的引物序列见表1。

2 结 果

2.1 临床表现及遗传诊断

患者25岁，因“双手肌肉萎缩11年余，双下肢乏力8年余”就诊。其临床表现及遗传诊断结果(图1)表明，其远端肢体轻度至中度萎缩，中度至重度无力，包括足部背屈受损(肌力2/5级)和跖屈受损(肌力4/5级)，远端上肢肌力4/5级，感觉正常，腱反射消失，跨步步态和足内翻。神经电生理检查结果发现，患者下肢远端发生显著的周围神经病变，伴有轴突变性。CMTNS2评分为8，CMTES评分为6。腓肠神经甲苯胺蓝染色示：神经束内有髓神经纤维减少，重度髓鞘减少，伴轴索变性、髓球形成。二代测序结果提示携带IGHMBP2基因复合杂合突变，包括c.884A>G(p.D295G，母源)和c.791G>A(p.R264H，父源)，其中c.884A>G为国际上首次报道的新突变。根据ACMG/AMP分级，以上2种突变均为可能致病突变。

2.2 iPSCs的构建

AR-CMT2S患者来源的PBMCs经仙台病毒感染6 d后，细胞团间有明显边界，形态完整，贴壁生长，呈现铺路石状。病毒感染11 d后，细胞核质比较高，细胞核仁明显，排列紧密，出现轮廓清晰的克隆样细胞团(图2)。挑选多个克隆样细胞团进行传代，建立AR-CMT2S患者来源的iPSCs细胞系。

2.3 iPSCs的鉴定

一代测序结果(图3A)表明，本研究所构建的AR-CMT2S-iPSCs与AR-CMT2S患者携带相同的IGHMBP2突变位点，即c.884A>G和c.791G>A。核型及多能性鉴定结果(图3B)显示，本研究所构建的AR-CMT2S-iPSCs的细胞核型为正常的二倍体(46，XX)，未见染色体数目或结构异常，表明该构建体系能够获得与患者PBMCs一致的细胞核型。

免疫荧光染色的鉴定结果(图3C)显示，本研究所构建的AR-CMT2S-iPSCs可表达多能性标志物Oct-4、Nanog、TRA-1-60。流式细胞术检测结果(图3D)显示，Oct-4、Nanog、TRA-1-60及SSEA-4阳性的细胞比例分别为90.42%、92.92%、96.71%、96.51%。

EBs的诱导分化及免疫荧光染色结果(图3E)发现，内胚层标志物SOX17和FOXA2，中胚层标志物Brachyury和α-SMA，以及外胚层标志物Pax6和β- III-tubulin在分化后的3个胚层中均可被检出，表明本研究所构建的AR-CMT2S-iPSCs具有三胚层分化的潜能。SOX17、FOXA2、Brachyury、α-SMA、Pax6及β-III-Tubulin阳性细胞占总细胞的百分比分别为93.5%、98.3%、99.1%、92.6%、95.4%及94.3%。

STR分析证实了iPSCs来源于原始患者，未检测到三等位基因或四等位基因，未检测到其他细胞系污染。具体位点信息见附图1(https://doi.org/10. 57760/sciencedb.36653)。

RT-PCR及琼脂糖凝胶电泳(图3F)结果提示对照及患者的iPSCs(20代)携带的仙台病毒已被彻底清除。

3 讨 论

IGHMBP2突变所致的AR-CMT2S是常染色体隐性遗传CMT中的常见类型，绝大部分发病年龄小于2岁，主要表现为四肢远端进行性肌无力及肌萎缩，远端感觉减退，腱反射减弱或消失，高弓足等(CMTNS为8~24)^[8-10]。AR-CMT2S的临床症状重，进展较快，致残率高，目前尚无有效治疗手段。因此，亟需深入研究该病的发病机制，寻找特异有效的治疗靶点。为解决上述问题，需建立一种能准确反映AR-CMT2S的生物学特性和疾病过程、且能尽量避免物种差异的细胞工具。来源于患者的iPSCs可分化为几乎所有类型的细胞且没有物种差异，在研究人类特有疾病和复杂疾病，以及避免个体差异等方面具有独特优势；此外，在iPSCs的基础上构建的三维类器官模型还能模拟体内微环境及细胞间相互作用^[5]。

目前，在CMT的众多亚型中，CMT1A、CMT1B、CMT2A2、CMT2D、CMT2H、CMT2EE、CMT2Z、CMT1X、CMTX6、CMT4B3等亚型的iPSCs已被成功构建^[11-20]。不同CMT亚型的发病机制不一，如脱髓鞘型CMT的致病基因主要通过调控髓鞘结构蛋白形成、转录、细胞骨架、线粒体功能、细胞内吞作用、膜通道运输等环节影响施旺细胞的髓鞘形成或导致其障碍而致病^[21]；而轴索型CMT的致病基因主要通过调控转录翻译、内质网应激、线粒体功能、信号转导、细胞骨架及轴突运输等环节影响神经元胞体或轴突的功能而致病^[22]。IGHMBP2是一种广泛表达于全身各组织器官的DNA/RNA解旋酶，其基因突变通过何种机制特异性影响周围神经的轴突功能而不影响其他脏器功能，以及不同突变所致不同临床表型的机制均尚不明确，且IGHMBP2突变所致的AR-CMT2S目前尚无有效治疗方法^[23]。因此，特异性的疾病模型可能对治疗方案的研究至关重要。目前，国际上尚无来源于AR-CMT2S患者的iPSCs构建的报道。本研究利用仙台病毒感染1例AR-CMT2S患者的PBMCs，成功将其重编程为iPSCs，通过PCR及一代测序证实该iPSCs携带与患者相同的突变。通过该方法获得的AR-CMT2S-iPSCs具有与患者一致的临床背景，为发病机制的研究及特异治疗靶点的寻找提供了良好的体外平台，也为未来的基因治疗提供了基础。

IGHMBP2突变还可致脊肌萎缩症合并I型呼吸窘迫(spinal muscular atrophy with respiratory distress type 1，SMARD1)，其临床特征为脊髓α-运动神经元变性所致的进行性远端肌无力和肌萎缩，以及膈肌瘫痪所致的呼吸窘迫(感觉不受累)，患儿常需长期携带呼吸机，并在3~5岁死亡^[24]。Simone等^[25]在2014年构建了SMARD1的iPSCs，并证明来自iPSCs的神经干细胞(neural stem cells，NSCs)在SMARD1中具有治疗潜力。SMARD1和AR-CMT2S均由IGHMBP2基因突变所致，但二者表型截然不同，SMARD1有呼吸窘迫而无感觉异常(主要影响脊髓运动神经元)，而AR-CMT2S无呼吸功能受累但有感觉异常(主要影响周围神经轴突)。目前这2种疾病的发病机制均尚不明确。研究^{[24, 26]}发现IGHMBP2突变所致表型的不同及严重程度与其突变位置、残留蛋白量及酶生物学活性的保留程度有关，但突变位点是否影响IGHMBP2蛋白在周围神经中的定位或与其他分子的相互作用目前尚不明确。以上研究结果主要基于常规的工具细胞、转基因小鼠、果蝇等，而不同的物种其生物学特性可能不同。因此，构建SMARD1和AR-CMT2S患者来源的iPSCs，以及将其分化为运动神经元或感觉神经元甚至类器官模型，对此类IGHMBP2突变相关疾病的发病机制研究及新药开发有重要意义。

本研究成功构建了国际上首例AR-CMT2S患者来源的iPSCs，但也具有一定的局限性。首先，AR-CMT2S是一种罕见病，病例和细胞资源匮乏且珍贵，构建iPSCs费用昂贵，本研究仅从1例患者的PBMCs构建了iPSCs，无法排除罕见变异或合并突变的干扰导致的偏差，未来可能需要构建更多不同突变体的细胞用于功能及药物研究。其次，AR-CMT2S也是一种遗传性周围神经病，受累的靶器官为运动神经元及感觉神经元，但本研究暂未再进行运动神经元及感觉神经元的分化。最后，本研究未进行后续的分化和功能验证，也未对iPSC长期传代的细胞核型稳定性进行检测。

综上所述，本研究首次构建了AR-CMT2S患者来源的iPSCs，可为AR-CMT2S的发病机制探索、药物筛选及新药开发提供新的模型选择。未来笔者将构建更多的AR-CMT2S患者来源的iPSCs，并将其诱导分化为成熟的运动神经元、感觉神经元或三维类器官模型，通过更丰富的细胞系对该疾病进行深入的功能分析，探讨该疾病的发病机制及潜在的治疗方法。

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基金资助

湖南省自然科学基金(2024JJ5521)

湖南省卫生健康委卫生科研课题(W20243214┫。This work was supported by the Natural Science Foundation of Hunan Province ┣2024JJ5521)

the Health Research Project of Hunan Provincial Health Commission(W20243214)

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