衣康酸通过抑制神经损伤诱导蛋白1介导的质膜破裂减轻脓毒症急性肺损伤巨噬细胞泛凋亡

Itaconic acid alleviates macrophage PANoptosis in sepsis-associated acute lung injury via inhibiting ninjurin-1-mediated plasma membrane rupture

摘要

目的 脓毒症急性肺损伤(sepsis-associated acute lung injury，S-ALI)是加强监护病房(intensive care unit，ICU)患者的重要致死原因之一，其发病机制尚未完全阐明，仍缺乏有效的治疗措施。巨噬细胞溶解性细胞死亡是S-ALI炎症级联反应的关键病理机制。其中，泛凋亡(PANoptosis)是以泛凋亡小体组装及激活为特征的新型溶解性细胞死亡方式，而神经损伤诱导蛋白1(ninjurin 1，NINJ1)作为一种新型膜成孔蛋白，在泛凋亡质膜破裂(plasma membrane rupture，PMR)中发挥关键作用。衣康酸在机体抗炎反应中发挥重要作用，但衣康酸在S-ALI巨噬细胞泛凋亡中的作用仍未阐明。本研究通过探讨衣康酸对S-ALI巨噬细胞泛凋亡的影响，旨在为治疗S-ALI提供新思路。 方法 采用6~8周龄、体重18~20 g雄性无特定病原体(specific pathogen free，SPF)级C57BL/6J小鼠为实验对象，经腹腔注射脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)建立经典S-ALI小鼠模型；采用蛋白质印迹法观察S-ALI模型小鼠肺组织泛凋亡小体相关蛋白质的表达变化，蛋白质印迹法、实时逆转录聚合酶链反应(real-time reverse transcription polymerase chain reaction，real-time RT-PCR)及糖代谢组学检测S-ALI模型小鼠肺组织内衣康酸代谢途径相关酶表达及衣康酸含量的变化。采用原代腹腔巨噬细胞(peritoneal macrophages，PMs)开展细胞水平实验；采用衣康酸衍生物4-辛基衣康酸酯(4-octyl itaconate，4-OI)预处理小鼠原代PMs，加入肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor alpha，TNF-α)和γ干扰素(interferon gamma，IFN-γ)诱导巨噬细胞泛凋亡。采用细胞计数试剂盒8(cell counting kit-8，CCK-8)评估4-OI对巨噬细胞的毒性作用；蛋白质印迹法检测泛凋亡巨噬细胞衣康酸代谢途径相关酶的表达和4-OI对泛凋亡巨噬细胞泛凋亡小体相关蛋白质表达的影响，检测S-ALI模型小鼠肺组织内及泛凋亡巨噬细胞NINJ1蛋白的表达；活细胞染料FM_4-64荧光染色检测4-OI处理对泛凋亡巨噬细胞PMR的改变，免疫荧光染色检测4-OI对泛凋亡巨噬细胞NINJ1蛋白表达及膜定位的影响；乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)试剂盒检测4-OI对培养液上清及外周血血清中LDH释放的影响；非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测S-ALI小鼠肺组织内NINJ1多聚体形成和4-OI对泛凋亡巨噬细胞NINJ1多聚体蛋白质表达的影响。 结果 S-ALI模型小鼠肺组织中泛凋亡小体[NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3，NLRP3)、Gasdermin D(GSDMD)、Z-DNA结合蛋白1(Z-DNA binding protein 1，ZBP1)、胱天蛋白酶(caspase)-1和caspase-3]相关蛋白质表达显著上调，混合系蛋白激酶样结构域蛋白(mixed lineage kinase domain-like protein，MLKL)S345磷酸化水平升高(均P<0.05)，糖代谢组学显示衣康酸含量代偿性升高；泛凋亡巨噬细胞衣康酸合成酶顺乌头酸脱羧酶1(aconitate decarboxylase 1，ACOD1)mRNA和免疫应答基因1(immunoresponsive gene 1，IRG1)蛋白质表达均显著上调(均P<0.01)。4-OI可显著抑制泛凋亡巨噬细胞泛凋亡小体相关蛋白质的表达，逆转泛凋亡巨噬细胞培养液上清LDH的释放，恢复质膜完整性。同时，4-OI可显著抑制泛凋亡巨噬细胞成孔膜蛋白NINJ1的表达及其在细胞膜上寡聚。 结论 衣康酸可能通过抑制成孔蛋白NINJ1介导的PMR减轻巨噬细胞泛凋亡，本研究结果有望为S-ALI临床治疗提供新思路。

Abstract

Objective Sepsis-associated acute lung injury (S-ALI) is one of the major causes of death in intensive care unit (ICU) patients, yet its mechanisms remain incompletely understood and effective therapies are lacking. Lytic cell death of macrophages is a key driver of the inflammatory cascade in S-ALI. PANoptosis, a newly recognized form of lytic cell death characterized by PANoptosome assembly and activation, involves plasma membrane rupture (PMR) mediated by ninjurin-1 (NINJ1), a recently identified pore-forming protein. Itaconic acid is known for its anti-inflammatory effects, but its role in macrophage PANoptosis during S-ALI is unclear. This study aims to investigate the protective effect of itaconic acid on macrophage PANoptosis in S-ALI to provide new therapeutic insights. Methods Male specific-pathogen-free C57BL/6J mice (6-8 weeks, 18-20 g) received intraperitoneal lipopolysaccharide (LPS) to establish a classical S-ALI model. Western blotting was used to assess PANoptosome-related proteins and enzymes involved in the itaconic acid metabolic pathway, while real-time reverse transcription polymerase chain reaction and metabolomics quantified itaconic acid levels. Primary peritoneal macrophages (PMs) were pretreated with the itaconate derivative 4-octyl itaconate (4-OI) and then exposed to tumor necrosis factor alpha (TNF-α) plus interferon gamma (IFN-γ) to induce PANoptosis. Cell viability was evaluated by cell counting kit-8 (CCK-8) assay. Western blotting was employed to quantify enzymes of the itaconate-metabolic pathway in PANoptotic macrophages, to evaluate the impact of 4-OI on PANoptosome-associated proteins, and to determine NINJ1 abundance in lung tissues from S-ALI mice and in PANoptotic macrophages. Fluorescent dye FM_4-64 was used to visualize 4-OI-mediated changes in PMR, whereas immunofluorescence staining mapped the effect of 4-OI on both the expression level and membrane localization of NINJ1 in PANoptotic macrophages. The effect of 4-OI on lactate dehydrogenase (LDH) release in culture supernatants and peripheal blood serum was assessed using a LDH assay kit, and non-denataring polyacylamide gel electrophoresis was used to assess the expression of NINJ1 in S-ALI mouse lung tissues and the impact of 4-OI on the expression of PANoptosis-associated NINJ1 multimeric reflected protein in macropahges. Results In S-ALI mouse lungs, PANoptosome components [NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3 (NLRP3), Gasdermin D (GSDMD), Caspase-1, Z-DNA binding protein (ZBP1), and Caspase-3] and phosphorylated mixed lineage kinase domain-like protein (MLKL) S345 were significantly upregulated (all P<0.05), while metabolomics showed compensatory increases in itaconic acid and its key enzymes [aconitate decarboxylase 1 (ACOD1)/immunoresponsive gene 1 (IRG1)]. In macrophages, 4-OI obviously suppressed PANoptosome protein expression, reduced LDH release, restored plasma membrane integrity, and inhibited NINJ1 expression and oligomerization at the membrane (P<0.05). Conclusion Itaconic acid may alleviate macrophage PANoptosis in S-ALI by inhibiting NINJ1-mediated plasma membrane rupture. Targeting NINJ1 or enhancing itaconate pathways may offer a novel therapeutic strategy for S-ALI.

Graphical abstract

关键词

脓毒症急性肺损伤 / 巨噬细胞 / 泛凋亡 / 衣康酸 / 质膜破裂 / 神经损伤诱导蛋白1

Key words

sepsis-associated acute lung injury / macrophages / PANoptosis / itaconic acid / plasma membrane rupture / ninjurin-1

脓毒症急性肺损伤(sepsis-associated acute lung injury，S-ALI)是以难治性低氧血症和呼吸困难为主要特征的临床综合征，可进展为急性呼吸窘迫综合征^[1]。目前，S-ALI是导致ALI病死率最高的疾病类型，全球平均病死率高达43%^[2-3]。巨噬细胞是机体调节肺部微环境稳态的首道防线，在正常生理情况下，巨噬细胞吞噬细菌、病毒等异物后会发生凋亡而被清除^[4]；当机体处于应激过度情况时，巨噬细胞则发生以质膜破裂(plasma membrane rupture，PMR)为特征的溶解性细胞死亡，激活损伤相关分子模式(damage-associated molecular patterns，DAMPs)，诱导并放大炎症级联反应^[5]。发生S-ALI时，巨噬细胞可发生坏死性凋亡^[6]、焦亡^[7]等，提示S-ALI与巨噬细胞死亡存在复杂的相互交联作用。泛凋亡是兼具焦亡、凋亡和坏死性凋亡等关键特征的新型溶解性细胞死亡方式，其不能被任意一种细胞死亡方式单独表征^[8]。泛凋亡受感受器和分子信号的级联调控，组装形成多聚体复合物——泛凋亡小体(PANoptosome)，最终导致细胞发生PMR而死亡^[9]。多项研究发现：肠道上皮细胞持续发生泛凋亡可加重溃疡性结肠炎^[10]；抑制库普弗细胞(位于肝脏中的特殊巨噬细胞)泛凋亡可减轻脏器系统激活综合征模型小鼠的炎症反应及多器官损伤程度^[11]；阻断巨噬细胞泛凋亡小体复合物的组装，可保护小鼠免于急性肾损伤及其导致的死亡^[12]。上述研究结果提示深入开展肺内巨噬细胞泛凋亡机制及靶向药物的研究对S-ALI的治疗至关重要。

免疫细胞糖代谢重编程是探索免疫反应机制的重要研究方向，该过程可引发多种代谢中间产物积累^[13]。研究^[14-15]证实糖代谢中间产物(如琥珀酸、柠檬酸等)积累在免疫反应和炎症调节过程中发挥关键作用。衣康酸是三羧酸循环中间代谢产物之一，是由免疫应答基因1(immunoresponsive gene 1，IRG1)编码的顺乌头酸脱羧酶1(aconitate decarboxylase 1，ACOD1)以顺乌头酸为底物脱羧转化而形成^[16]。既往研究表明：线粒体内衣康酸可抑制琥珀酸脱氢酶的活性，减轻炎症反应^[17]；衣康酸通过核因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2)通路抑制巨噬细胞铁死亡以减轻肺部炎症反应^[18]；衣康酸可抑制肠上皮细胞焦亡，缓解急性结肠炎临床症状^[19]。上述研究结果提示调控衣康酸代谢可抑制细胞死亡，控制炎症级联反应程度；但目前有关衣康酸作用于巨噬细胞泛凋亡以减轻S-ALI的相关研究仍较少，其机制值得深入探索。

成孔蛋白介导的PMR意味着巨噬细胞泛凋亡处于终末阶段，该过程释放乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)、高迁移率族蛋白B1(high mobility group box-1，HMGB1)、热激蛋白90等多种DAMPs，进一步激活并放大炎症级联反应^[20]。研究^[21]表明中和血清关键致病DAMPs(如HMGB1)可阻断巨噬细胞焦亡进程，减轻脓毒症诱导的组织损伤，提示靶向抑制泛凋亡巨噬细胞PMR具有重要意义。既往研究^[22-23]认为PMR是由成孔蛋白家族Gasdermin D(GSDMD)和混合连接激酶结构域样蛋白(mixed lineage kinase domain-like protein，MLKL)介导的渗透压变化引发的被动破裂，而新近研究^[24]则表明GSDMD^-/-及MLKL^-/-无法完全阻断巨噬细胞泛凋亡，可能存在其他成孔蛋白参与泛凋亡PMR过程。神经损伤诱导蛋白1(ninjurin 1，NINJ1)是一种在进化上高度保守、含两次跨膜区的膜成孔蛋白；它最早被鉴定为黏附分子，在神经损伤后再生过程中发挥作用^[25]。目前，衣康酸是否可靶向抑制泛凋亡巨噬细胞NINJ1介导的PMR尚缺乏深入研究。本研究采用腹腔注射脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)构建S-ALI模型，使用衣康酸衍生物4-辛基衣康酸酯(4-octyl itaconate，4-OI)干预肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor alpha，TNF-α)和γ干扰素(interferon gamma，IFN-γ)诱导的泛凋亡巨噬细胞，探索衣康酸作为保护因子靶向巨噬细胞泛凋亡以减轻S-ALI的作用机制，以期为临床S-ALI的治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1 伦理声明

实验有关的动物操作均符合动物实验“3 R原则”。细胞水平的实验采用小鼠原代腹腔巨噬细胞(peritoneal macrophages，PMs)以及小鼠骨髓来源巨噬细胞(bone marrow derived macrophages，BMDMs)。本研究动物实验已获得中南大学湘雅基础医学院伦理委员会批准(审批号：2023-KT107)。

1.2 实验动物

本研究采用6~8周龄、体重18~20 g的雄性无特定病原体(specific pathogen free，SPF)级C57BL/6J小鼠为实验对象，小鼠购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，饲养在符合动物饲养标准的中南大学动物学部[实验单位使用许可证编号：SYXK(湘)2020-0019；许可证号：SYXK(湘)2021-0002]。

1.3 主要试剂与仪器

RPMI-1640基础培养基(货号：12633012)和小牛血清(货号：16010159)均购自美国Gibco公司；硫代乙醇酸钠(thioglycolate，TGA；货号：T0632)和LPS(货号：916374)均购自美国Sigma-Aldrich公司；TNF-α(货号：1189)和IFN-γ(货号：5438)均购自中国SinoBiological公司；4-OI(货号：T4580)购自上海陶术生物科技有限公司；NINJ1多肽抑制剂NINJ1_26-37(货号：128017)购自中国吉尔生化(上海)有限公司；二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白质浓度测定试剂盒(货号：P0009)、RIPA裂解液(货号：P0013B)、细胞计数试剂盒8(cell counting kit-8，CCK-8)试剂盒(货号：C0037)以及非变性非还原性蛋白质上样缓冲液(5×)(货号：P0016N)均购自上海碧云天生物技术股份有限公司；聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜(货号：IPVH00010)购自美国Millipore公司；蛋白质印迹法使用的一抗Z-DNA结合蛋白1(Z-DNA binding protein，ZBP1)(货号：60968)、NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3，NLRP3)(货号：15101)和凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associated specklike protein containing CARD，ASC)抗体(货号：67824)均购自美国Cell Signaling Technology公司；IRG1(货号：ab222411)、胱天蛋白酶-3(caspase-3)(货号：ab184787)、胱天蛋白酶-1(caspase-1)(货号：ab179515)、混合系蛋白激酶样结构域样蛋白(mixed lineage kinase domain-like protein，MLKL)磷酸化S345(货号：Ab196436)和受体结合丝氨酸苏氨酸激酶3(receptor interacting serine-threonine kinase 3，RIPK3)磷酸化S232抗体(货号：Ab195117)均购自美国Abcam公司，GSDMD(货号：sc-393581)和NINJ1(货号：sc-13629)均购自美国Santa Cruz Biotechnology公司；Caspase-8(货号：13423-1-AP)购自武汉三鹰生物技术有限公司；FM_4-64质膜染料(目录号：HY-103466)购自美国MedChemexpress生物科技公司；LDH测定试剂盒(货号：A020-2-2)购自南京建成生物工程研究所有限公司；非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(non-denaturing polyacrylamide gel electrophoresis，Native-PAGE)快速制备试剂盒(货号：C631101-0100)和10×Tris-甘氨酸非变性电泳缓冲液(货号：C506035-0500)均购自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.4 方法

1.4.1 动物实验分组

将实验小鼠按照随机数字表法分为Control组、S-ALI组、NINJ1_26-37+S-ALI组。Control组经小鼠腹腔注射与LPS同等体积的生理盐水(200 μL)。S-ALI组经小鼠腹腔注射LPS(10 mg/kg)，构建S-ALI模型。NINJ1_26-37+S-ALI组经小鼠尾静脉注射NINJ1多肽抑制剂NINJ1_26-37(0.1 mg/kg)预处理1 h，后经腹腔注射LPS(10 mg/kg)。给药12 h后，处死小鼠并取材。

1.4.2 细胞培养与分组

根据既往研究^[26]方法分离原代小鼠PMs。C57BL/6J小鼠经腹腔注射3 mL TGA；3 d后分离腹腔灌洗液，待红细胞裂解后采用磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)清洗，采用RPMI-1640培养基加入10%热灭活的小牛血清培养巨噬细胞，并将其移入24孔板中(每孔含0.5×10⁶个细胞)，放入37 ℃细胞培养箱中培养；待细胞黏附1.5~2.0 h后，用温热的PBS洗去未贴壁细胞，对贴壁细胞进行培养以用于后续实验。

BMDMs提取：麻醉小鼠，以脱臼法处死小鼠后取其小腿关节，剔除足关节、皮肤与肌肉，将小腿骨置于含75%乙醇的培养皿中浸泡5 min；PBS洗去骨表面乙醇，分离股骨与胫骨，剪断骨两端，吸取高糖杜氏改良Eagle培养基(Dulbecco’s modified Eagle medium，DMEM)，对准骨断端吹洗骨髓，反复吹洗3次，直至腿骨内无明显红色；使用5 mL移液枪轻柔吹打含骨髓细胞的培养基，分散细胞团块，将悬液经70 μm细胞滤器滤去杂质，而后转移至15 mL离心管中，以1 500 r/min离心5 min后弃去上清液，进行红细胞裂解后再次弃去上清液；使用复合培养基[高糖DMEM+10%胎牛血清+1%双抗+100 ng/mL巨噬细胞集落刺激因子1(macrophage colony-stimulating factor 1，M-CSF1)]重悬细胞并沉淀，将其移入24孔板中；培养第3天进行半量换液，第5天进行全量换液，第7天收获细胞用于后续实验。

为明确4-OI对巨噬细胞泛凋亡的影响，本实验将细胞分为Control组、4-OI组、TNF-α+IFN-γ组、 4-OI+TNF-α+IFN-γ组。采用4-OI(100 μmol/L)预处理 1 h，而后采用TNF-α(25 ng/mL)和IFN-γ(50 ng/mL)诱导巨噬细胞泛凋亡36 h^[27]，再进行基因或蛋白质水平的检测。

1.4.3 细胞活力试验

参照上述方法建立细胞模型，成功诱导后弃去原有培养基，向96孔板中加入含10% CCK-8检测液的完全培养基，孵育0.5~4.0 h。采用多功能酶标仪(杭州米欧仪器有限公司，型号DEL-100)检测细胞活力[450 nm处的吸光度(density，D)值]，1次/h，直至Control组D值达到0.8~1.0时停止检测，整理数据并绘图。

1.4.4 蛋白质印迹实验

动物水平的操作：麻醉小鼠后分离右下肺肺组织进行蛋白质提取，充分裂解组织后，采用BCA法对小鼠肺组织蛋白质进行定量、煮沸变性；经10%凝胶电泳、转膜、5%脱脂牛奶封闭等操作后，加一抗于4 ℃下孵育过夜，加二抗于室温下孵育1 h；按照体积比1꞉1配制增强型化学发光(enhanced chemiluminescence，ECL)显影液，滴加适量发光液覆盖条带后置于凝胶成像仪器中，使用Bio-Rad显影，曝光后保存图像并采用ImageJ软件分析灰度值。

细胞水平的操作：细胞造模诱导成功后，弃去原有培养基，用PBS洗涤2次，按照RIPA缓冲液꞉苯甲基磺酰氟(phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF)꞉磷酸酶抑制剂混合物(phosphatase inhibitor coktail)的比例为100꞉1꞉1配制裂解液，而后加入24孔板中 (70 μL/孔)，充分裂解后煮沸变性，后续操作同上。

1.4.5 实时逆转录聚合酶链反应实验

细胞模型诱导成功后，弃去原有培养基，以PBS洗涤2次；应用TRIzol法提取RNA，测量RNA的 D₂₆₀/D₂₈₀比值(1.9~2.0)，评估RNA的纯度。采用cDNA合成试剂盒将mRNA逆转录为单链cDNA，并按1꞉20的倍数稀释，使用PCR扩增试剂盒进行体系配置，PCR仪进行扩增，经过变性、退火和延伸，得到相应数据后进行分析，评估基因表达的差异。本研究使用引物均为鼠源，ACOD1正向引物序列为5'-GCTATTGCTGTTTCCCACGC-3'，反向引物序列为5'-TTTGTTTCCTTGGAGGCCCA-3'；α-tubuli正向引物序列为5'-TTCCAGCCTTCCTTCTTG-3'，反向引物序列为5'-GGAGCCAGAGCAGTAATC-3'。

1.4.6 免疫荧光试验和PMR染色

细胞经4%多聚甲醛溶液固定15 min，以PBS洗涤3次；0.1% Triton X-100透化8 min，PBS洗涤3次；1% BSA封闭1 h，加一抗于4 ℃下孵育过夜，PBS+0.1%Tween-20洗涤3次；加二抗于室温下避光孵育1 h，用抗淬灭剂封片后，采用激光共聚焦显微镜观察并拍摄。采用FM_4-64质膜染料直接进行活细胞染色30 min，染色结束后采用激光共聚焦显微镜观察并拍摄。

1.4.7 LDH活性测定实验

细胞造模成功后，收集细胞后取上清培养液，按1꞉50比例进行稀释，参考LDH测定试剂盒说明书进行后续实验操作，采用多功能酶标仪检测450 nm处的D值，整理数据并绘图。

1.4.8 Native-PAGE实验

细胞模型成功诱导后，按照非变性RIPA缓冲液꞉PMSF的比例为100꞉1配制所需裂解液，而后加入培养细胞的12孔板中(50 μL/孔)，采用细胞刮刮取样本置于冰上充分裂解，进一步吸取裂解液转入EP管，在4 ℃下以4 000 r/min离心5 min，加入1×非变性非还原性蛋白质上样缓冲液用于后续实验；经过6%非变性凝胶电泳、转膜、5%脱脂牛奶封闭等操作后，加一抗于4 ℃下孵育过夜，加二抗于室温下孵育1 h；按照体积比1꞉1配制ECL显影液，滴加适量发光液覆盖条带后置于凝胶成像仪器中，使用Bio-Rad显影，曝光后保存图像。

1.5 统计学处理

采用GraphPad Prism软件进行数据分析和绘图，定量数据以均数±标准差表示，两组数据比较采用Student’s t检验，多组数据比较采用单因素方差分析(analysis of variance，ANOVA)。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 <bold>S-ALI</bold>模型小鼠肺组织内泛凋亡小体相关组分的蛋白质表达

蛋白质印迹法结果显示：S-ALI模型小鼠肺组织内泛凋亡小体相关组分NLRP3、GSDMD、Caspase-1、ZBP1和Caspase-3蛋白表达上调，MLKL磷酸化水平升高，与Control组比较，差异均有统计学意义(均P<0.05，图1)。

2.2 <bold>TNF-α</bold>和<bold>IFN-γ</bold>诱导巨噬细胞泛凋亡模型的构建

采用TNF-α和IFN-γ双刺激诱导经典泛凋亡细胞模型，结果显示：巨噬细胞泛凋亡小体相关组分NLRP3、GSDMD、Caspase-1、Caspase-3、Caspase-8和ASC蛋白表达上调，MLKL和RIPK3磷酸化水平升高，与Control组比较，差异均有统计学意义(均P<0.05，图2A~2I)；激光共聚焦显微镜观察到巨噬细胞泛凋亡小体感受器ZBP1、适配器ASC和效应器RIPK3存在共定位(图2J)，提示巨噬细胞泛凋亡小体形成；TNF-α+IFN-γ诱导可加剧巨噬细胞PMR程度，增加培养液上清中LDH释放量，与Control组比较，差异有统计学意义(P<0.001，图2K、2L)。上述结果表明本研究成功构建了巨噬细胞泛凋亡模型。

2.3 <bold>S-ALI</bold>模型小鼠肺组织及泛凋亡巨噬细胞衣康酸代谢变化

S-ALI模型小鼠肺内衣康酸生成酶ACOD1 mRNA和IRG1蛋白表达上调，与Control组比较，差异均有统计学意义(均P<0.01，图3A~3C)；糖代谢组学结果发现S-ALI模型小鼠肺组织糖代谢中间产物衣康酸含量显著增加(图3D)；基于细胞水平的观察发现泛凋亡巨噬细胞ACOD1 mRNA和IRG1蛋白表达上调，与Control组比较，差异均有统计学意义(均P<0.01，图3E~3G)。

2.4 <bold>4-OI</bold>对泛凋亡巨噬细胞泛凋亡小体组分蛋白质 表达的影响

125 μmol/L 4-OI能降低细胞活力，与0 μmol/L 4-OI组比较，差异有统计学意义(P<0.001，图4A)，100 μmol/L 4-OI可降低泛凋亡巨噬细胞泛凋亡小体组分的蛋白质表达(图4B)，因此后续实验采用 100 μmol/L药物浓度预处理，观察其对巨噬细胞泛凋亡小体组分的表达影响。结果显示4-OI预处理可抑制泛凋亡巨噬细胞泛凋亡小体组分NLRP3、GSDMD、Caspase-3和Cleaved-caspase-3蛋白表达，降低MLKL和RIPK3磷酸化水平，与未加4-OI预处理的TNF-α+IFN-γ组比较，差异均有统计学意义(均P<0.05，图4C~4I)。

2.5 <bold>4-OI</bold>对泛凋亡巨噬细胞质膜完整性的影响

激光共聚焦显微镜观察结果显示4-OI可显著抑制泛凋亡巨噬细胞PMR(图5)。

2.6 <bold>4-OI</bold>对泛凋亡巨噬细胞培养液上清中<bold>LDH</bold>释放的影响

LDH活性测定实验结果显示：4-OI可抑制泛凋亡巨噬细胞上清LDH释放，与未加4-OI预处理的TNF-α+IFN-γ组比较，差异有统计学意义(均P<0.01，图6)。

2.7 <bold>S-ALI</bold>泛凋亡巨噬细胞<bold>NINJ1</bold>蛋白表达变化

基于单细胞测序数据库GSE223793分析发现，感染所致急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)患者外周血中NINJ1在巨噬细胞中呈高表达，且表达丰度远高于经典成孔蛋白GSDMD和MLKL(图7A、7B)。进一步检测S-ALI模型小鼠肺组织内NINJ1蛋白表达及泛凋亡巨噬细胞NINIJ1蛋白表达，结果显示S-ALI模型小鼠肺组织内及泛凋亡巨噬细胞NINJ1单体蛋白质表达上调，与Control组比较，差异均有统计学意义(均P<0.01，图7C~7F)；肺组织内NINJ1发生寡聚化(图7G)；而采用NINJ1抑制性多肽NINJ1_26-37可减少S-ALI模型小鼠外周血LDH释放(P<0.01，图7H)。

2.8 <bold>4-OI</bold>对泛凋亡巨噬细胞成孔蛋白<bold>NINJ1</bold>蛋白表达及膜定位的影响

激光共聚焦显微镜观察结果显示4-OI可抑制泛凋亡巨噬细胞NINJ1蛋白表达及膜定位(图8)。

2.9 <bold>4-OI</bold>对泛凋亡巨噬细胞<bold>NINJ1</bold>多聚体蛋白质表达的影响

Native-PAGE实验结果显示4-OI可抑制泛凋亡巨噬细胞NINJ1多聚体蛋白质的形成(图9)。

3 讨 论

脓毒症会引起急危重症患者器官功能障碍和不良预后，肺是最早且最易受累的靶器官，约45%脓毒症患者可并发ALI^[28]；而早期炎症级联反应是启动和加速S-ALI的关键病理过程^[29]。本研究发现：S-ALI模型小鼠巨噬细胞可发生泛凋亡；采用衣康酸衍生物4-OI可减轻巨噬细胞泛凋亡程度；PMR是泛凋亡的末期事件，可释放DAMPs加重炎症级联反应；4-OI可逆转泛凋亡巨噬细胞PMR及LDH释放；介导大分子DAMPs释放的新型成孔蛋白NINJ1在S-ALI模型小鼠泛凋亡巨噬细胞PMR时发挥关键作用；4-OI可抑制NINJ1介导的泛凋亡巨噬细胞PMR时大分子DAMPs释放。上述结果提示巨噬细胞泛凋亡可作为治疗S-ALI炎症反应的有效靶点，衣康酸可作为靶向药物减轻S-ALI。

近年来巨噬细胞溶解性细胞死亡加速放大炎症级联反应备受关注。研究^[30-32]表明巨噬细胞后凋亡时期、焦亡、坏死性凋亡及铁死亡等均能诱发PMR，释放DAMPs，触发并放大炎症级联反应。当盲肠结扎穿孔术(cecum ligation and puncture，CLP)致小鼠脓毒症时，巨噬细胞可发生铁死亡并加剧多器官功能损伤程度^[33]；抑制坏死性凋亡可减少巨噬细胞等免疫细胞募集，减轻脓毒症多器官功能损伤^[6]；外源性DAMPs刺激引起肺泡巨噬细胞焦亡可导致S-ALI^[31]。上述研究提示脓毒症所致多器官功能受损时巨噬细胞溶解性死亡可能存在相互交联的复杂模式，而单一的死亡方式并不能完全解释巨噬细胞溶解性死亡加速炎症级联反应进程的机制。本研究观察到S-ALI时肺内细胞发生新型细胞死亡方式——泛凋亡。泛凋亡小体的组装和激活是泛凋亡发生的关键环节之一^[34]，本研究也发现S-ALI模型小鼠肺组织泛凋亡小体组分蛋白质表达上调。研究^[35]表明受刺激的多形核白细胞释放DAMPs外泌体可加剧放大炎症反应。本研究结果显示泛凋亡巨噬细胞发生PMR且上清液中LDH释放增加，提示靶向S-ALI肺内巨噬细胞泛凋亡所致的PMR释放DAMPs的过程是治疗脓毒症肺损伤的关键环节。

近年来糖代谢重编程在炎症中的作用备受关注，该过程表现为细胞能量供应从以氧化磷酸化供能为主转化为糖酵解为主，涉及代谢相关酶、代谢途径和代谢产物等变化，可快速生成能量，并为合成生物大分子提供前体。其中的糖代谢中间代谢产物可作为重要信号分子，参与调节炎症等病理过程^[36]。一般情况下，发生糖代谢重编程时三羧酸循环(Krebs循环)受到抑制，而本研究结果显示S-ALI模型小鼠肺组织内衣康酸含量增高，且S-ALI模型小鼠肺组织内及泛凋亡巨噬细胞衣康酸合成途径中关键酶ACOD1 mRNA和IRG1蛋白表达显著上调，提示S-ALI泛凋亡巨噬细胞可发生糖代谢重编程中间代谢产物衣康酸堆积。本研究进一步采用衣康酸衍生物4-OI代替衣康酸进行处理^[37]，发现4-OI可抑制泛凋亡巨噬细胞泛凋亡小体组分NLRP3、GSDMD、Caspase-3和Cleaved-caspase-3的蛋白质表达，降低RIPK3和MLKL磷酸化水平；同时，4-OI也可抑制泛凋亡巨噬细胞PMR和上清LDH含量增加，提示衣康酸通过抑制泛凋亡小体形成及末期PMR，进而抑制巨噬细胞发生泛凋亡。相关研究^[38]表明创伤性脑损伤引起脑内巨噬细胞-小胶质细胞促炎激活后，细胞内IRG1表达上调，而衣康酸含量则有所下降。本研究结果与其不完全一致。但该研究显示4-OI处理可抑制小胶质细胞促炎激活，本研究的4-OI抗炎效应结果与其相一致。分析原因可能是细菌所致脓毒症早期多器官炎症为重症炎症，体内衣康酸发生代偿性增加。研究表明脓毒症早期阶段IRG1表达及衣康酸含量明显升高^[39]；经LPS诱导的小鼠也可产生大量衣康酸，提示衣康酸是抵抗LPS刺激的重要机制之一^{[16, 40]}。上述研究提示衣康酸可作为抗炎物质治疗急慢性炎症疾病。

既往研究^[22]认为溶解性细胞死亡时PMR是由成孔蛋白介导的渗透压变化引起的被动过程，GSDMD和MLKL是公认的成孔蛋白。但相关研究^[24]报道GSDMD^-/-及MLKL^-/-无法完全阻断巨噬细胞泛凋亡，且GSDMD和MLKL所形成的质膜孔道只可释放直 径<21 nm的小分子DAMPs^[41]，提示存在其他未明确的机制介导S-ALI时巨噬细胞HMGB1等大分子DAMPs释放。本研究采用单细胞测序数据分析感染所致ARDS患者外周血免疫细胞成孔蛋白表达谱，观察到巨噬细胞中新型成孔蛋白NINJ1的表达显著增加，且表达丰度远高于GSDMD和MLKL。2021年Nature首次报道巨噬细胞焦亡时NINJ1作为成孔蛋白介导溶解性细胞死亡PMR，即NINJ1单体发生寡聚化并自主切割细胞膜形成直径>500 nm的孔道，释放大分子DAMPs，刷新了PMR是由GSDMD等成孔蛋白诱导的渗透压变化导致被动破裂的理论^[42]。本研究显示S-ALI模型小鼠肺组织NINJ1蛋白呈高表达。NINJ1在正常细胞中主要以单体形式存在，而在应激时表达增加，经寡聚化形成多聚体，主动切割细胞膜导致PMR^[43]。本研究表明，4-OI可抑制泛凋亡巨噬细胞NINJ1在细胞膜上聚集形成多聚体，进而抑制泛凋亡巨噬细胞释放LDH，提示4-OI通过抑制NINJ1介导的PMR抑制巨噬细胞泛凋亡。目前，衣康酸调控NINJ1蛋白单体表达及多聚体形成的具体机制仍需进一步探索。研究^[44]显示p53可靶向NINJ1，加重全身性炎症反应并促进肿瘤发生；TNF-α处理内皮细胞激活NF-κB信号通路可导致NINJ1表达增加^[45]。笔者所在课题组前期研究^[46]使用UCSC基因组浏览器和JASPAR数据库的数据预测了NINJ1的上游调节因子，结果显示脾焦点形成病毒前病毒整合癌基因(spleen focus forming virus proviral integration oncogene，Spi1)和激活转录因子家族与NINJ1调节具有较强相关性。目前有关NINIJ1寡聚机制的相关研究仍较少，有研究^[24]显示敲除caspase-8(泛凋亡小体组分蛋白质之一)可抑制泛凋亡巨噬细胞NINJ1寡聚。本研究推测4-OI通过调控上游靶点抑制泛凋亡小体形成，进而减少NINJ1表达/寡聚。

本研究仍存在一定局限性：1)研究^{[18, 47]}证明衣康酸可减轻S-ALI模型小鼠肺部炎症，本研究未进一步从整体水平评价4-OI对S-ALI的疗效；2)在体外水平使用PMs代替肺泡巨噬细胞进行研究，未基于原代肺泡巨噬细胞进一步验证结论；3)泛凋亡巨噬细胞衣康酸合成途径中关键酶ACOD1 mRNA和IRG1蛋白表达显著上调，未通过代谢组学等方法检测泛凋亡巨噬细胞衣康酸水平变化；4)应进一步采用转录组学及蛋白质修饰组学分析4-OI对泛凋亡巨噬细胞基因及蛋白质修饰的影响，明确衣康酸调控巨噬细胞泛凋亡的具体分子机制。

综上所述，巨噬细胞泛凋亡是S-ALI炎症级联反应放大的关键新机制，衣康酸可抑制NINJ1寡聚介导的PMR而阻断巨噬细胞泛凋亡进程，减少大分子DAMPs释放，有望为S-ALI临床治疗提供新思路。

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基金资助

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湖南省卫生健康委员会科研计划项目(B202303028704)

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