基于机器学习的细胞死亡特征模型精准预测黑色素瘤预后及治疗响应

Machine learning-based programmed cell death signature model for precise prediction of prognosis and treatment response in melanoma

摘要

目的 黑色素瘤的发生、转移及耐药性对患者预后构成重大挑战，目前尚缺乏能够准确预测患者结局并指导治疗的预测模型。本研究旨在基于程序性细胞死亡(programmed cell death，PCD)机制开发黑色素瘤预后和药物敏感性的预测模型。 方法 从基因集富集分析(gene set enrichment analysis，GSEA)、京都基因和基因组数据库(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)、相关综述及已发表研究中收集并整合19种PCD模式相关基因，建立全面的PCD特征基因集。获取癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas，TCGA)-皮肤黑色素瘤(skin cutaneous melanoma，SKCM)队列的转录组与临床数据，并纳入3个未经治疗的基因表达综合(Gene Expression Omnibus，GEO)数据集(GSE65904、GSE19234、GSE100797)作为外部验证队列；同时收集免疫治疗队列PRJEB23709、GSE136961与GSE215222用于验证其对免疫治疗的预测价值。单细胞转录组数据(GSE115978、GSE215120)采用Seurat进行质量控制、标准化、降维聚类与细胞注释，空间转录组数据来源于10×Genomics，并结合Cottrazm进行空间分区与SpaCET解卷积；细胞通信采用CellChat评估分泌信号、细胞外基质(extracellular matrix，ECM)-受体互作及细胞接触等通信模式。基于TCGA训练集，采用包含10种算法及101种组合的机器学习策略构建PCD相关预后特征，并以多队列平均一致性指数(C-index)筛选最优模型；进一步结合差异分析、GSEA、CIBERSORT与基于表达估计恶性肿瘤组织的基质细胞和免疫细胞(Estimation of STromal and Immune cells in MAlignant Tumor tissues using Expression data，ESTIMATE)评估免疫浸润，计算T细胞受体(T-cell receptor，TCR)克隆多样性、细胞溶解活性与T细胞效应基因表达谱，并探索PCD评分(PCD score，PCDS)与药物敏感性的关联。 结果 19种PCD通路在正常皮肤与SKCM间的活性显著不同，提示PCD异常参与黑色素瘤进展；突变分析显示肌巨蛋白(titin，TTN)和黏蛋白16(mucin 16，MUC16)突变频率最高。经共线性控制与相关性筛选获得314个候选基因，在101种模型组合中，StepCox(backward)+Ridge表现最佳(4个队列平均C-index=0.677)。基于该模型构建的PCDS可稳定分层预后，高PCDS组在TCGA及3个外部验证队列中生存显著更差，且在校正年龄、性别、分期、Breslow厚度、Clark分级和溃疡等因素后仍为独立预后指标。免疫分析表明，高PCDS与免疫抑制相关：免疫评分降低，CD8⁺ T细胞、活化记忆CD4⁺ T细胞、浆细胞、M1型巨噬细胞均减少而M2型巨噬细胞增加；PCDS与免疫检查点分子、TCR Shannon指数、细胞溶解活性评分(cytolytic activity score，CYT)及T细胞效应基因表达谱(T-cell effector gene expression profile，T-GEP)均呈显著负相关，并在免疫荒漠型中最高。空间转录组与单细胞结果提示PCDS存在空间/细胞异质性：边界区PCDS更低且与巨噬细胞比例呈负相关；髓系细胞总体PCDS最低，巨噬细胞与T/自然杀伤(natural killer，NK)细胞通信最强，免疫治疗后巨噬细胞富集并增强人类白细胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)-A/B/C-CD8a相关互作。临床应用上，PCDS在与既往100个预后特征比较中表现更稳健，并可补充“热-冷肿瘤”分型，在“热肿瘤”中仍能识别高风险患者。免疫治疗队列验证显示PCDS与疗效获益呈负相关，高PCDS更可能无应答且预后更差；药物分析提示PCDS与多种药物敏感性相关，可用于潜在治疗分层。 结论 PCDS是一个跨队列稳健的黑色素瘤预后与免疫治疗获益预测工具，反映免疫微环境抑制程度及髓系/巨噬细胞相关免疫调控特征，并为个体化风险分层与潜在用药选择提供依据。深入解析PCD在肿瘤免疫微环境中的调控机制，可为黑色素瘤患者个性化治疗决策提供重要理论基础。

Abstract

Objective The occurrence, metastasis, and drug resistance of melanoma pose major challenges to patient prognosis, and predictive models capable of accurately forecasting patient outcomes and guiding treatment are still lacking. This study aims to develop predictive models for melanoma prognosis and drug sensitivity based on mechanisms of programmed cell death (PCD). Methods Genes related to 19 PCD patterns were collected and integrated from gene set enrichment analysis (GSEA), the Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG), relevant reviews, and published studies to establish a comprehensive PCD signature gene set. Transcriptomic and clinical data from The Cancer Genome Atlas (TCGA) skin cutaneous melanoma (SKCM) cohort were obtained, and 3 untreated Gene Expression Omnibus (GEO) datasets (GSE65904, GSE19234, and GSE100797) were included as external validation cohorts. In addition, immunotherapy cohorts PRJEB23709, GSE136961, and GSE215222 were collected to validate the predictive value for immunotherapy. Single-cell transcriptomic data (GSE115978 and GSE215120) were processed using Seurat for quality control, normalization, dimensionality reduction, clustering, and cell annotation; spatial transcriptomic data were obtained from 10× Genomics and combined with Cottrazm for spatial partitioning and SpaCET deconvolution. Cell-cell communication was evaluated using CellChat to assess secreted signaling, extracellular matrix (ECM)-receptor interactions, and cell contact-mediated communication patterns. Based on the TCGA training set, a machine learning strategy comprising 10 algorithms and 101 combinations was used to construct PCD-related prognostic signatures, and the optimal model was selected using the average concordance index (C-index) across multiple cohorts. Differential analysis, GSEA, CIBERSORT, and Estimation of STromal and Immune cells in MAlignant Tumor tissues using Expression data (ESTIMATE) were further applied to evaluate immune infiltration, calculate T-cell receptor (TCR) clonal diversity, cytolytic activity, and T-cell effector gene expression profiles, and to explore the association between the PCD score (PCDS) and drug sensitivity. Results The activities of the 19 PCD pathways differed significantly between normal skin and SKCM, suggesting that dysregulation is involved in melanoma progression. Mutation analysis showed that titin (TTN) and mucin 16 (MUC16) had the highest mutation frequencies. After controlling for collinearity and correlation screening, 314 candidate genes were obtained. Among the 101 model combinations, StepCox (backward)+Ridge performed best (average C-index across 4 cohorts=0.677). The PCDS constructed based on this model stably stratified prognosis: The high-PCDS group showed significantly worse survival in TCGA and 3 external validation cohorts and remained an independent prognostic indicator after adjustment for age, sex, stage, Breslow thickness, Clark level, and ulceration. Immune analyses indicated that high PCDS was associated with immunosuppression: Immune scores were reduced; CD8⁺ T cells, activated memory CD4⁺ T cells, plasma cells, and M1 macrophages were decreased, whereas M2 macrophages were increased. PCDS was significantly negatively correlated with immune checkpoint molecules, TCR Shannon index, cytolytic activity score (CYT), and T-cell effector gene expression profile (T-GEP), and was highest in the immune-desert subtype. Spatial transcriptomic and single-cell results suggested spatial and cellular heterogeneity of PCDS: PCDS was lower at boundary regions and negatively correlated with macrophage proportions; myeloid cells had the lowest overall PCDS, macrophages exhibited the strongest communication with T/natural killer (NK) cells, and after immunotherapy, macrophages were enriched with enhanced human leukocyte antigen (HLA)-A/B/C-CD8a-related interactions. In clinical applications, PCDS demonstrated greater robustness compared with 100 previously reported prognostic signatures and complemented hot-cold tumor classification by identifying high-risk patients even among “hot tumors”. Validation in immunotherapy cohorts showed that PCDS was negatively associated with therapeutic benefit; high PCDS was more likely to be associated with non-response and poorer prognosis. Drug analyses suggested that PCDS was associated with sensitivity to multiple drugs and could be used for potential treatment stratification. Conclusion PCDS is a cross-cohort robust tool for predicting melanoma prognosis and immunotherapy benefit, reflecting the degree of immunosuppression in the tumor immune microenvironment and myeloid/macrophage-related immunoregulatory features, and provides a basis for individualized risk stratification and potential drug selection. This study provides an in-depth elucidation of the regulatory mechanisms of PCD in the tumor immune microenvironment and offers an important theoretical foundation for personalized treatment decision-making in melanoma patients.

Graphical abstract

关键词

黑色素瘤 / 程序性细胞死亡 / 机器学习 / 免疫治疗 / 肿瘤免疫微环境

Key words

melanoma / programmed cell death / machine learning / immunotherapy / tumor immune microenvironment

黑色素瘤是一种具有高度侵袭性的恶性皮肤肿瘤，其发病率在全球范围内持续上升，已成为临床治疗中最具挑战性的恶性肿瘤之一^[1-2]。尽管过去10年中，靶向治疗(如BRAF抑制剂)和免疫检查点抑制剂(immune checkpoint inhibitor，ICI)[如抗程序性死亡受体1(programmed death-1，PD-1)/程序性死亡受体配体1(programmed death-ligand 1，PD-L1)抗体]的应用显著改善了患者的预后，但治疗耐药及整体应答率不足仍然是亟须解决的临床难题^[3-4]。免疫治疗仍面临多项挑战：第一，部分患者对免疫治疗原发耐药；第二，部分初始应答的患者最终会出现获得性耐药；第三，免疫治疗相关不良事件可影响患者生活质量甚至威胁生命^[5]。识别免疫治疗疗效的预测生物标志物、克服耐药机制及管理不良事件成为当前的研究热点。特别是对于转移性黑色素瘤患者来说，预后尤其令人担忧。由于肿瘤高度异质性和复杂的分子机制，其治疗效果受到严重限制，患者5年生存率持续偏低^[6-7]。因此，深入探究黑色素瘤的生物学特性及治疗反应机制，预测靶向治疗和免疫治疗疗效的潜在生物标志物，对开发创新治疗策略和改善患者结局具有重要的临床意义。

程序性细胞死亡(programmed cell death，PCD)是一个受高度调控的过程，在肿瘤的发生、发展和治疗中起关键作用^[8-9]。近年研究^[10-15]已经鉴定出多达19种细胞死亡模式，包括经典的凋亡、焦亡、铁死亡、自噬依赖性细胞死亡、程序性坏死、铜死亡、多腺苷二磷酸核糖聚合酶[poly (adenosine diphosphate-ribose) polymerase inhibitor，PARP]-1依赖性细胞死亡等。这些细胞死亡模式通过多种分子机制和信号通路发挥作用，共同构成复杂的调控网络^[16]。同时，靶向细胞死亡通路以增强免疫治疗效果的研究是当前热点。研究^[17]表明，B细胞淋巴瘤2(B cell lymphoma 2，Bcl-2)抑制剂(如维奈妥拉)可增强PD-1抑制剂在黑色素瘤中的疗效，其机制涉及增强T细胞介导的肿瘤细胞凋亡。同样，铁死亡诱导剂[如Erastin、RSL3等]与ICI联合使用可显著增强抗肿瘤效果，这与铁死亡诱导的强免疫原性有关。研究^[18]表明，铁死亡促进肿瘤细胞释放免疫原性信号，增强CD8⁺ T细胞的活化，促进干扰素(interferon，IFN)-γ的产生，从而提高ICI的疗效，甚至能使对单一免疫治疗不敏感的肿瘤产生显著应答。

作为最经典的PCD形式，凋亡在组织发育、免疫应答调控和清除受损细胞中起至关重要的作用^[19-20]。其主要通过内源性和外源性2条途径启动，涉及胱天蛋白酶(caspase)级联反应和线粒体功能调控等关键过程^[21-22]。在黑色素瘤中，凋亡通路的失调与治疗耐药密切相关^[23]。这表明靶向这些通路可能为克服治疗耐药提供新策略。铁死亡是一种以铁依赖性脂质过氧化为特征的细胞死亡形式，在癌症治疗中表现出显著潜力^[24]。铁死亡与ICI的疗效密切相关，使其成为预测免疫治疗应答的重要生物标志物^[25]。其关键调控因子，如谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase 4，GPX4)和系统xc，为开发新型治疗策略提供了潜在靶点^[26]。自噬依赖性细胞死亡在肿瘤进展中具有双重作用，既可促进肿瘤细胞存活，也可诱导细胞死亡^[27]。在黑色素瘤中，自噬水平的改变与BRAF抑制剂疗效密切相关，调控自噬过程可能增强现有治疗方案的效果^[28]。此外，自噬还参与调控肿瘤微环境和免疫反应，从而影响免疫治疗结局^[29]。其他形式的细胞死亡，如焦亡、胞内吞噬和双硫死亡，在黑色素瘤的发生和发展中也具有重要作用^[30]。焦亡作为一种促炎性PCD形式，通过释放损伤相关分子模式(damage-associated molecular patterns，DAMPs)和细胞因子影响肿瘤免疫微环境^[31]。程序性坏死通过免疫治疗诱导的抗肿瘤免疫反应发挥作用，其激活可能增强此类治疗效果^[32]。

不同细胞死亡通路之间存在着复杂的交互网络，这种相互作用在肿瘤治疗中具有重要的协同效应。Liu等^[33]的研究揭示了铁死亡与自噬之间存在密切的相互调控关系，即多种类型的自噬均参与了铁死亡的调控；其中，铁蛋白自噬通过核受体辅激活因子4(nuclear receptor coactivator 4，NCOA4)介导的铁蛋白降解过程，将储存的铁释放到细胞不稳定铁池中，直接促进铁死亡；同时，线粒体自噬也在铁死亡中发挥关键作用，过度的线粒体自噬不仅导致大量活性氧(reactive oxygen species，ROS)的产生，还能从线粒体铁硫簇中释放铁离子，这种双重作用既造成线粒体功能障碍，又加剧细胞的氧化应激状态，最终促进铁死亡。Karki等^[34]提出的泛凋亡(PANoptosis)概念阐明了细胞死亡通路之间的协同调控机制；在这一过程中，caspase-8蛋白作为关键的分子开关，能够精确调控细胞凋亡、坏死性凋亡和焦亡这3种不同形式的细胞死亡之间的动态转换。这一发现为理解细胞死亡通路的整体调控网络提供了新的视角。

然而，这些细胞死亡形式与黑色素瘤免疫治疗反应的综合关系及其预后价值尚未完全阐明^[35]，特别是多个细胞死亡通路的协同作用及其对ICI疗效的影响机制^[36-37]。深入了解这些细胞死亡通路之间的相互作用及其调控网络，对于开发新型治疗策略和优化现有治疗方案至关重要。

本研究旨在开发针对黑色素瘤的PCD相关的预后特征模型，并从多维度(包括Bulk转录组、单细胞转录组和空间转录组)全面表征PCD相关特征，为黑色素瘤的个性化治疗决策提供指导，并为预测其免疫治疗反应提供潜在的生物标志物。

1 资料与方法

1.1 PCD相关基因列表的收集

从多个权威科学来源[包括基因集富集分析(gene set enrichment analysis，GSEA)、京都基因和基因组数据库(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)、相关综述和已发表研究数据]收集19种不同PCD相关基因，构建全面的PCD特征基因集。基于此，采用单样本基因集富集分析对正常皮肤组织和癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas，TCGA)-皮肤黑色素瘤(skin cutaneous melanoma，SKCM)肿瘤样本中的19种细胞死亡通路进行定量评估。

1.2 数据收集与预处理

从TCGA数据门户(https://portal.gdc.cancer.gov/)^[38]获取SKCM样本的信使RNA(messenger RNA，mRNA)表达谱和临床数据。

从基因表达综合(Gene Expression Omnibus，GEO)数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)获取3个独立的未经治疗的SKCM数据集(GSE65904、GSE19234和GSE100797)作为验证队列。

为评估PCD评分(PCD score，PCDS)在ICI治疗中的预测价值，本研究对3个独立免疫治疗队列进行整合分析。队列包括：接受抗PD-1单药治疗或PD-1联合细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4，CTLA-4)治疗的黑色素瘤队列(PRJEB23709)^[39]、接受PD-1抗体治疗的非小细胞肺癌队列(GSE136961)^[40]及接受抗PD-1/PD-L1治疗的晚期非小细胞肺癌队列(GSE135222)^[41]。分别计算各队列的PCDS，并评估其与免疫治疗疗效/预后结局的关联，随后对3个队列的分析结果进行综合评估，以检验PCDS预测性能在不同癌种与不同ICI治疗方案中的一致性与稳健性。

从GEO数据库获取单细胞转录组数据集(GSE115978和GSE215120)。其中，GSE115978数据集包含31个样本，并提供了免疫治疗前后的样本数据；GSE215120数据集包含11个样本。使用Seurat v4软件包^[42]分析黑色素瘤样本数据。数据处理流程包括质量控制、数据预处理、标准化和聚类分析。在质量控制和预处理后，GSE115978数据保留了6 612个细胞，GSE215120数据保留了65 603个细胞。选取前2 000个高变基因(highly variable genes，HVGs)进行主成分分析(principal component analysis，PCA)。采用统一流形近似与投影(uniform manifold approximation and projection，UMAP)进行降维可视化以展示细胞类型注释结果。随后，使用survival包计算PCDS。空间转录组数据来源于10×Genomics官方网站。

1.3 黑色素瘤单细胞转录组的细胞-细胞相互作用分析

采用R包CellChat(4.1.2版本)解析黑色素瘤细胞与其他细胞类型之间的相互作用网络^[43]。分析过程中保持软件包的默认参数设置。重点关注3种主要的细胞通信模式：分泌信号、细胞外基质(extracellular matrix，ECM)-受体相互作用和细胞-细胞接触依赖性信号。

1.4 黑色素瘤空间转录组分析

为进一步探索PCDS在肿瘤微环境中的空间分布特征及其与免疫细胞的关系，本研究整合空间转录组学和单细胞测序数据进行多维分析。使用R包Cottrazm进行空间转录组数据预处理和区域识别，区分恶性区域(Mal)、边界区域(Bdy)和非恶性区域(nMal)^[44]。使用R包SpaCET进行解卷积分析，以识别空间共定位的主要细胞亚群并分析其分布相关性^[45]。

1.5 药物响应数据

从药物敏感性基因组学(Genomics of Drug Sensitivity in Cancer，GDSC)数据库(http://www.cancerrxgene.org/downloads)和癌细胞系治疗反应门户(Cancer Therapeutics Response Portal，CTRP)数据库(https://portals.broadinstitute.org/ctrp.v2.1/)下载癌细胞系的采用曲线下面积(area under the curve，AUC)作为评价指标和基因表达矩阵^[46-47]。

1.6 基于机器学习的整合特征生成

为构建高准确性、高稳定性的PCDS，本研究采用系统的机器学习建模策略。该策略整合10种机器学习算法及其101种组合，包括随机生存森林(random survival forest，RSF)、弹性网络(elastic net，Enet)、最小绝对收缩与选择算子(least absolute shrinkage and selection operator，LASSO)、岭回归、逐步Cox回归、CoxBoost、偏最小二乘Cox回归(partial least squares Cox regression，plsRcox)、监督主成分分析(supervised principal components，SuperPC)、梯度提升机(gradient boosting machine，GBM)和生存支持向量机(survival support vector machine，survival-SVM)。模型构建过程主要包括以下步骤：首先，为减少特征共线性对模型的影响，使用caret包的findLinearCombos函数消除共线特征，并通过相关性分析选择相关系数低于0.7的特征进行后续建模；其次，以TCGA-SKCM为训练集，3个独立数据集(GSE65904、GSE19234和GSE100797)进行外部验证；最后，通过计算各模型在所有验证数据集中的Harrell的一致性指数(C-index)，选择平均 C-index最高的模型作为最优模型。

1.7 TCGA-SKCM队列的差异分析和GSEA

基于PCDS的中位数将TCGA-SKCM样本分为高PCDS组和低PCDS组。比较TCGA-SKCM队列中2组之间的差异表达基因。使用clusterProfiler软件包对显著特征(P<0.05)进行GSEA^[48]。

1.8 免疫相关指标计算

基于标准化基因表达数据，使用CIBERSORT工具估算22种浸润免疫细胞类型的相对比例。采用基于表达估计恶性肿瘤组织的基质细胞和免疫细胞(Estimation of STromal and Immune cells in MAlignant Tumor tissues using Expression data，ESTIMATE)算法评估免疫浸润状态。T细胞受体(T-cell receptor，TCR)克隆性丰度值参考Thorsson等^[49]的研究。细胞溶解活性评分(cytolytic activity score，CYT)基于颗粒酶A(granzyme A，GZMA)和穿孔素1(perforin 1，PRF1)的表达水平进行计算。基于Bagaev等^[50]提出的肿瘤免疫微环境分类标准，将黑色素瘤样本分为4种免疫表型。为将PCDS与现有分类系统进行比较，特别关注了临床实践中广泛使用的“热-冷肿瘤”分类系统。基于Wang等^[51]的研究，整合相关特征基因集。

1.9 统计学处理

采用Wilcoxon秩和检验比较组间差异。使用survminer包分析PCDS与预后的关联。通过Kaplan-Meier曲线进行生存分析，采用对数秩检验确定显著性。构建多变量Cox回归模型评估PCDS的独立预后价值，纳入年龄、性别和肿瘤分期等临床特征作为协变量。使用Spearman相关性分析评估PCDS与免疫预后指标和药物敏感性(AUC值)之间的关联，相关系数≥|0.2|且错误发现率(false discovery rate，FDR)<0.05为具有显著性。所有统计检验均为双尾检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 黑色素瘤中的表达特征及突变

差异比较分析结果显示，正常组织和肿瘤样本之间具有不同的细胞死亡模式，细胞死亡机制的改变在黑色素瘤的发生和发展中发挥关键的调控作用(图1A)。突变分析结果显示，在所有PCD相关基因中，肌巨蛋白(titin，TTN)和黏蛋白16(mucin 16，MUC16)基因的突变频率较高，分别在72%和66%的样本中检测到突变；其他8个高频突变基因的突变率为27%~50%(图1B)。

2.2 PCD相关的黑色素瘤预后模型的构建

对比正常皮肤组织和黑色素瘤样本，成功识别出13种差异表达的PCD通路(图2A)。通过相关性基因分析最终筛选出314个具有独特预测价值的基因用于后续建模(图2B)。

比较101种不同的机器学习模型组合的C-index发现，StepCox[backward]+Ridge混合模型表现出优越的预测性能，在4个独立数据集中平均C-index达到0.677，展现出优秀的预测准确性和稳定性。基于此结果，选择结合这2种算法进行最终的特征选择和模型构建(附图1，https://10.57760/sciencedb.xbyxb. 00192)。

TCGA-SKCM和其他3个独立的GEO验证队列(GSE19234、GSE65904和GSE100797)的生存分析结果显示，在所有4个队列中，高风险组和低风险组之间均存在显著的生存差异(均P<0.05，图2C~2F)。

多变量Cox回归分析发现，基于PCDS的预测模型作为预后指标独立于传统临床预后因素(包括年龄、性别、疾病分期、Breslow厚度、Clark分级和溃疡状态；图2G)。

2.3 PCDS和肿瘤免疫微环境特征关联分析

功能富集分析结果显示，同种异体排斥、凝血、补体、干扰素α应答、干扰素γ应答、白细胞介素(interleukin，IL)-6-JAK-STAT3信号通路和炎症反应7个免疫相关通路在低PCDS组显著富集；其标准化富集分数(normalized enrichment score，NES)为负值(图3A)。

ESTIMATE算法评估免疫浸润状态结果显示，与低PCDS组比较，高PCDS组的免疫评分显著降低 (P<0.001，图3B)。CIBERSORT解卷积算法对免疫细胞亚群进行定量分析的结果表明，与低PCDS组比较，高PCDS组中多个效应免疫细胞亚群(包括浆细胞、CD8⁺ T细胞、活化记忆CD4⁺ T细胞和M1型巨噬细胞)的比例显著降低；免疫抑制性M2型巨噬细胞的比例显著升高(均P<0.05，图3C)。

免疫相关指标分析显示，PCDS与大多数激活性免疫检查点分子之间存在显著负相关(图3D)。高PCDS组具有显著降低的TCR Shannon指数(P<0.001，图3E)，表明T细胞受体多样性受限。此外，PCDS与CYT(P<0.001，R²=-0.53；图3F)和T细胞效应基因表达谱(T-cell effector gene expression profile，T-GEP；P<0.001，R²=-0.55；图3G)均呈显著负相关。PCDS在免疫荒漠微环境中达到最高水平(图3H)。

2.4 PCDS空间转录组学和单细胞水平免疫调节机制分析

将PCDS映射到空间转录组数据上，通过Cottrazm分析，将黑色素瘤组织分为肿瘤区域、边界区域和正常区域(图4A)，结果显示，边界区域的PCDS显著低于其他区域(P<0.001，图4B、4C)。进一步的空间转录组解卷积分析揭示了PCDS与巨噬细胞空间分布之间存在显著的互斥性。在边界区域，PCDS与巨噬细胞比例表现出显著的负相关(r=-0.45，P<0.001)，图4D、4E)。

基于经典细胞标志物，将2个独立的单细胞测序数据集的细胞群体分类为T/自然杀伤(natural killer，NK)细胞、黑色素瘤细胞、B细胞、髓系细胞、成纤维细胞和内皮细胞。2个数据集均显示髓系细胞表现出最低的PCDS。对髓系细胞进行更精细的聚类注释(图4F)，发现巨噬细胞的PCDS最低(图4G)，与空间转录组观察高度一致，进一步支持巨噬细胞在PCDS相关的肿瘤免疫微环境中的关键作用。细胞-细胞相互作用分析结果显示，髓系细胞群体中的巨噬细胞与T/NK细胞表现出最强的相互作用强度(图4H)。在GSE115978免疫治疗单细胞数据集中，基于比值比(odds ratio，OR)指标观察到免疫治疗后巨噬细胞显著富集(图4I)。配体-受体对分析显示，与治疗前组相比，治疗后组中巨噬细胞表达的人类白细胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)-A、HLA-B、HLA-C与T/NK细胞表达的CD8a之间的相互作用概率显著升高(图4J)。

2.5 PCD相关的黑色素瘤预后模型的性能评估和临床应用潜力分析

该模型纳入了100个与各种生物学过程相关的特征，涵盖了免疫治疗反应、免疫浸润和糖酵解等关键通路。该模型在所有4个数据集中均展现出较好的C-index(附图2，https://10.57760/sciencedb.xbyxb.00192)。

对SKCM队列的单因素Cox分析，识别出显著的预后因素，并将其整合到列线图预测模型中(图5A)。校准曲线的验证显示，列线图具有高预测准确性，与实际预后表现出强一致性(图5B)。

整合“热-冷肿瘤”相关特征基因，包括12个“热肿瘤”相关基因{C-X-C基序趋化因子(C-X-C motif chemokine，CXCL)9、CXCL10、CXCL11、趋化因子CXC亚家族受体(CXC subfamily chemokine receptor，CXCR)3、CD3、CD4、CD8a、CD8b、CD274、程序细胞死亡1基因(programmed cell death 1，PDCD1)、CXCR4和CC趋化因子配体[chemokine (C-C motif) ligand，CCL]5}和3个“冷肿瘤”相关基因(CXCL1、CXCL2和CCL20)，将PCDS与“热-冷肿瘤”分类结合进行患者分层时发现，无论肿瘤被分类为“热”还是“冷”，高PCDS组均一致表现出较差的生存预后(图5C)。即使在传统预后良好的“热肿瘤”中，PCDS仍能识别出高风险患者群体(图5D)。

2.6 PCDS在癌症免疫治疗中的预测价值和验证

在PRJEB23709和GSE135222队列中，发现PCDS水平与免疫治疗效果之间存在显著的负相关；在PRJEB23709队列中，免疫治疗获益者显示出较低的PCDS(P=0.004，图6A)，随后的χ²分析证实高PCDS组中免疫治疗无反应者的比例显著较高(P<0.001，图6C)。在GSE135222队列中，观察到免疫治疗获益者的PCDS水平较低(P=0.016，图6B)。虽然该队列的χ²分析未达到统计学意义(P>0.05，图6D)，但仍表现出与PRJEB23709队列一致的趋势。特别值得注意的是，在这3个免疫治疗队列中的生存分析一致表明，PCDS具有显著的预后区分能力，这与先前观察到的高PCDS组中的免疫抑制性微环境高度一致(图6E~6J)。

2.7 基于PCDS的药物响应预测研究

在CTRP数据库中，识别出41种与PCDS显著相关的药物，包括4种FDA批准药物、13种临床使用药物、23种探针和其他化合物，这些药物共同靶向57个基因(附图3，https://10.57760/sciencedb.xbyxb. 00192)。23种药物的AUC值与PCDS呈相关，Aurora激酶抑制剂barasertib与PCDS呈显著的正相关(P<0.05，r²=0.36，图7A)。

在GDSC数据库中，识别出40种在高低PCDS之间显示显著差异敏感性的药物。这些药物涵盖多种作用机制，包括激酶抑制剂(如Afatinib，图7B)、DNA损伤修复相关药物(如Olaparib，图7C)和信号通路调节剂(如CHIR-99021，图7D)。

3 讨 论

本研究为构建具有临床应用价值的预后模型，首先分析了黑色素瘤与正常皮肤组织在PCD通路上的差异表达模式，并筛选出具有显著差异的PCD相关特征。在此基础上，应用机器学习算法开发了PCD相关的黑色素瘤预后模型。在模型构建过程中，特别注重降低多重共线性，以确保模型的稳健性和可靠性。验证结果表明，基于PCD特征的预后模型在SKCM训练队列和独立验证队列中均表现出优秀且一致的预测性能。这种跨队列的稳定性进一步证实了模型的可靠性和普适性。值得注意的是，通过对单细胞和空间转录组数据的深入分析，揭示了巨噬细胞在SKCM肿瘤微环境中的核心作用。单细胞转录组研究发现，在免疫治疗后，巨噬细胞主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)-I信号通路显著增强对T细胞的抗原呈递能力，为理解免疫治疗机制提供了新见解。

大多数PCD相关基因可能参与各种生物学功能或具有潜在的预后价值。其中，ULK1被发现通过与IRF1的相互作用显著增强IFN-γ诱导的免疫抑制基因表达。临床数据分析^[52]表明，高ULK1表达与黑色素瘤患者的不良预后密切相关；重要的是，靶向抑制ULK1可以与抗PD-1免疫治疗协同作用，有效抑制黑色素瘤生长。在信号通路水平上，PIK3R2通过激活PI3K/AKT/NF-κB信号级联反应促进黑色素瘤细胞增殖、侵袭和上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)。研究^[53]表明，PIK3R2表达水平与肿瘤分期显著相关，突显其作为潜在治疗靶点的价值。此外，VANGL1被证明通过与miR-150-5p的竞争性结合调节黑色素瘤进展。具体而言，VANGL1不仅促进黑色素瘤细胞增殖、迁移和侵袭，还在TGF-β诱导的EMT中发挥中心调控作用。临床样本分析^[54]显示，VANGL1在黑色素瘤组织中普遍过表达，表明其有作为治疗靶点的潜力。值得注意的是，NOTCH3在黑色素瘤进展中表现出独特的调控机制。NOTCH3主要通过调节黑色素瘤干细胞样(mesenchymal stem-like cells，MSLC)表型可塑性和重塑血管微环境来促进肿瘤进展。高NOTCH3表达与增强的致瘤性和血管生成呈正相关，为开发Notch通路靶向治疗策略提供了重要依据^[55]。

本研究通过整合空间和单细胞转录组分析揭示了一个引人注目的现象：PCDS与巨噬细胞分布表现出显著的空间互斥性。进一步的细胞-细胞相互作用分析发现，巨噬细胞主要通过MHC-I信号通路中的HLA-A分子与T细胞相互作用，这种相互作用在免疫治疗后显著增强。这一发现为理解肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophages，TAMs)在抗肿瘤免疫反应中的作用提供了新视角。PCD在调节巨噬细胞-T细胞相互作用中发挥中心作用。具体而言，当肿瘤细胞发生免疫原性细胞死亡(immunogenic cell death，ICD)时，它们释放DAMPs，包括HMGB1和ATP，这些分子能有效激活巨噬细胞并增强其抗原呈递功能^[56]。同时，凋亡细胞表面暴露的“吃我”信号(如磷脂酰丝氨酸)可被巨噬细胞特异性识别，促进其吞噬功能并通过HLA-A分子增强抗原呈递能力^[57-58]。

作为专业的抗原呈递细胞，巨噬细胞的MHC-I表达水平与其抗肿瘤免疫反应能力密切相关。TAMs可以通过多种机制影响肿瘤微环境，其中抗原呈递功能尤为关键^[59]。在肿瘤微环境中，巨噬细胞可分化为2个主要亚型：促肿瘤的M2型和抗肿瘤的M1型^[60]。值得注意的是，ICI治疗可以促进巨噬细胞向M1型极化，增强其抗原呈递能力，继而激活细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocytes，CTL)介导的抗肿瘤免疫反应^[61]。这些发现不仅支持了先前的发现，还进一步揭示了PCD、巨噬细胞空间分布及其与T细胞相互作用之间的复杂关联。这种关联在免疫治疗后变得更加突出，表现为增强的HLA-A介导的巨噬细胞-T细胞相互作用，为理解肿瘤免疫治疗机制提供了新的见解。

PCDS在多个免疫治疗队列中对免疫治疗预后表现出一定的预测能力，表明PCDS作为基于PCD特征的预后预测模型，在免疫治疗预后评估方面也具有一定的临床转化潜力。但是其预测效能存在一定局限性，特别是在长期预后(6个月以上)预测方面表现欠佳。这种局限性可能源于以下几个方面：首先，收集的免疫治疗队列在患者的人群特征、疾病分期、基线状态及具体治疗方案等方面存在一定程度的差异，这些外在因素可能影响了模型在不同数据集下的泛化能力；其次，部分外部验证队列的样本量相对较小，限制了统计效力和预测准确性的充分评估；此外，免疫治疗的疗效受到多种复杂临床因素的影响，包括患者的基线免疫状态、肿瘤微环境特征、合并用药情况、治疗依从性及个体遗传背景等，而当前模型主要基于转录组学特征构建，未能完全整合这些重要的临床变量。

本研究揭示了PCDS在指导黑色素瘤个性化治疗中的重要价值。通过整合CTRP和GDSC大型药物筛选数据库，系统性地识别了与PCDS显著相关的治疗药物，为基于PCD特征的精准治疗提供了重要依据。例如Aurora激酶抑制剂barasertib在高PCDS的患者中表现出更高的敏感性，这一发现具有重要的临床意义。Aurora激酶在细胞分裂过程中发挥关键作用，其异常激活与多种恶性肿瘤的发生和发展密切相关^[62]。先前研究^[63]已证实barasertib能有效诱导黑色素瘤细胞凋亡和坏死，并在与白蛋白结合型紫杉醇联合使用时表现出协同效应，因此在转移性黑色素瘤治疗中显示出良好前景。Barasertib诱导的细胞死亡机制与PCDS模型中的PCD通路存在密切关联，这可能解释了为什么高PCDS的患者对该药物表现出更高的敏感性。临床研究^[63]显示，barasertib单药治疗或与化疗药物联合使用在转移性黑色素瘤患者中表现出良好的抗肿瘤活性和可接受的安全性。这些药物敏感性分析结果不仅验证了PCDS模型的生物学意义，而且为黑色素瘤的精准治疗提供了新的策略。

尽管本研究为PCD相关特征的临床意义提供了重要见解，但仍具有一定的局限性。首先，研究主要依赖于回顾性数据分析，突显了未来需要验证发现的临床相关性。其次，考虑到SKCM的异质性及其多样的组织学表型，需要更深入的机制研究和全面的临床研究来阐明PCD相关基因在不同SKCM亚型中的作用。正如Muroya等^[64]指出，当前AI在肿瘤学应用中面临着研究质量问题、数据标准化不足及模型可解释性有待提高等挑战。PCDS模型虽然在多个独立队列中表现出良好的预测性能，但仍需要在更大规模的真实世界数据中进行验证，并需要进一步提高模型的可解释性和透明度。此外，PCDS模型的临床决策价值缺乏来自III期随机对照试验的验证。因此，迫切需要高质量、长期随访、大样本多中心随机对照试验来进一步验证验证这一发现。总之，本研究的结果表明PCDS作为SKCM患者的有效预后指标显示出良好前景。然而，为提高发现的可靠性和临床适用性，未来的研究需要克服上述局限性。

综上所述，本研究建立了PCD相关的黑色素瘤预后模型，并通过包括Bulk、单细胞转录组和空间转录组在内的多维分析对PCD相关特征进行了全面表征。研究特别阐明了巨噬细胞在PCD调控下，通过增强MHC-I介导的对T细胞的抗原呈递，在协调免疫治疗后动态变化中起核心作用。最终，发现PCDS为一个与黑色素瘤免疫反应和药物敏感性显著相关的稳健预后指标，从而为个体化治疗决策提供新的指导，并为免疫治疗反应预测引入潜在的生物标志物。

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基金资助

国家自然科学基金(U22A20329┫。This work was supported by the National Natural Science Foundation of China ┣U22A20329)

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