ANXA2协同NF-κB的正反馈调控环路促进高糖诱导的肾小管上皮细胞焦亡

ANXA2 and NF-κB positive feedback loop promotes high glucose-induced pyroptosis in renal tubular epithelial cells

摘要

目的 细胞焦亡在糖尿病肾脏病(diabetic kidney disease，DKD)肾小管间质病变中发挥重要作用。膜联蛋白A2(Annexin A2，ANXA2)参与细胞增殖、凋亡和黏附，可能与DKD密切相关，但具体机制尚不清楚。本研究探讨ANXA2在高糖诱导的肾小管上皮细胞焦亡中的作用及分子机制，为DKD的防治提供新的靶点。 方法 将人肾小管上皮细胞系HK-2细胞随机分为正常组(5.5 mmol/L葡萄糖)、高糖组(30.0 mmol/L葡萄糖)和高渗对照组(24.5 mmol/L甘露醇+5.5 mmol/L葡萄糖)。通过转染过表达质粒和小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)调控ANXA2表达，并分别采用5-乙炔基-2-脱氧尿苷(5-ethynyl-2’-deoxyuridine，EdU)法检测细胞增殖，流式细胞术分析细胞凋亡率，以及免疫荧光观察ANXA2、p50、p65的亚细胞定位。采用蛋白质印迹法检测纤维化标志物α-平滑肌肌动蛋白(alpha-smooth muscle actin，α-SMA)、纤连蛋白(fibronectin，FN)、Ⅳ型胶原(collagen type IV，Col-IV)的表达，实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR)和蛋白质印迹法分析核转录因子(nuclear factor-κB，NF-κB)亚基p50、p65和焦亡通路因子NLR家族Pyrin域蛋白3(NLR family Pyrin domain containing 3，NLRP3)、胱天蛋白酶-1(caspase-1)、白细胞介素(interleukin，IL)-1β、IL-18的mRNA和蛋白质表达情况。采用免疫共沉淀实验分析ANXA2与p50、p65的蛋白质相互作用情况，染色质免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation，ChIP)和双荧光素酶报告基因实验探讨NF-κB与ANXA2启动子结合情况。 结果 高糖诱导能上调HK-2细胞中ANXA2的表达并促进其核转位，差异有统计学意义(P<0.01)。高糖处理后，HK-2细胞增殖率降低，细胞凋亡率升高，α-SMA、FN和Col-IV的蛋白质表达水平均升高，差异均有统计学意义(均P<0.05)；过表达ANXA2后会进一步加剧上述指标变化，差异均有统计学意义(均P<0.05)；采用siRNA干扰ANXA2表达后，可部分逆转细胞增殖率下降、凋亡率升高以及纤维化程度，差异均有统计学意义(均P<0.05)。高糖处理可激活NF-κB并上调NLRP3、caspase-1、IL-1β和IL-18的mRNA和蛋白质表达，差异均有统计学意义(均P<0.05)；过表达ANXA2会进一步增强这一效应，而干扰ANXA2表达则抑制NF-κB活化及其下游因子的表达，差异均有统计学意义(均P<0.05)。免疫共沉淀实验证实ANXA2与NF-κB亚基p65直接结合，而ChIP实验显示NF-κB亚基p65特异性结合ANXA2启动子的ChIP-2、ChIP-4、ChIP-6区域(富集倍数>1)，且以此构建对应的突变型M2、M4、M6组的荧光素酶活性较空载体对照组均升高，差异均有统计学意义(均P<0.05)，进一步证实p65正向调控ANXA2的转录。 结论 ANXA2与NF-κB形成正反馈环路，通过持续激活NLRP3炎症小体，促进焦亡相关通路活化，加剧高糖诱导的肾小管上皮细胞损伤。靶向ANXA2或阻断其与p65的相互作用有望成为延缓DKD进展的新策略。

Abstract

Objective Pyroptosis plays a critical role in tubulointerstitial lesions of diabetic kidney disease (DKD). Annexin A2 (ANXA2) is involved in cell proliferation, apoptosis, and adhesion and may be closely related to DKD, but its specific mechanism remains unclear. This study aims to investigate the role and molecular mechanism of ANXA2 in high glucose-induced pyroptosis of renal tubular epithelial cells, providing new targets for DKD prevention and treatment. Methods Human renal tubular epithelial HK-2 cells were divided into a normal glucose group (5.5 mmol/L), a high glucose group (30.0 mmol/L), and a osmotic control group (24.5 mmol/L mannitol+5.5 mmol/L glucose). ANXA2 expression was modulated by overexpression of plasmids and small interfering RNA (siRNA). Cell proliferation was measured by 5-ethynyl-2’-deoxyuridine (EdU) assay, apoptosis by flow cytometry, and ANXA2, p50, and p65 subcellular localization by immunofluorescence. Western blotting was employed to detect α-smooth muscle actin (α-SMA), fibronectin (FN), and collagen type IV (Col-IV). Real-time fluorescence quantitative PCR (RT-qPCR) and Western blotting were used to analyze nuclear factor-κB (NF-κB) subunits p50/p65 and the pyroptosis pathway factors NLR family Pyrin domain containing 3 (NLRP3), caspase-1, inferleukin (IL)-1β, and IL-18. Protein interactions between ANXA2 and p50/p65 were examined by co-immunoprecipitation, while chromatin immunoprecipitation (ChIP) and dual-luciferase reporter assays were used to examine NF-κB binding to the ANXA2 promoter. Results High glucose upregulated ANXA2 expression and promoted its nuclear translocation (P<0.01). High glucose reduced cell proliferation, increased apoptosis, and elevated α-SMA, FN, and Col-IV expression (all P<0.05); ANXA2 overexpression aggravated these effects (all P<0.05), while ANXA2 knockdown reversed them (all P<0.05). High glucose activated NF-κB and increased NLRP3, caspase-1, L-1β, and IL-18 mRNA and protein expression (all P<0.05); ANXA2 overexpression further enhanced this, whereas knockdown suppressed NF-κB activation and downstream factors (all P<0.05). Co-immunoprecipitation confirmed ANXA2 directly binds the NF-κB subunit p65. ChIP assays revealed p65 binds specifically to ANXA2 promoter regions (ChIP-2, ChIP-4, and ChIP-6), and luciferase activity in corresponding mutant constructs (M2, M4, and M6) was significantly increased versus controls (all P<0.05), confirming positive transcriptional regulation of ANXA2 by p65. Conclusion ANXA2 and NF-κB form a positive feedback loop that sustains NLRP3 inflammasome activation, promotes pyroptosis pathway activation, and aggravates high glucose-induced renal tubular epithelial cell injury. Targeting ANXA2 or blocking its interaction with p65 may be a novel strategy to slow DKD progression.

Graphical abstract

关键词

糖尿病肾病 / 细胞焦亡 / 膜联蛋白A2 / 核转录因子κB / 正反馈环路 / NLR家族Pyrin域蛋白3

Key words

diabetic kidney disease / pyroptosis / Annexin A2 / nuclear factor κB / positive feedback loop / NLRP3

糖尿病肾病(diabetic kidney disease，DKD)作为糖尿病最为严重的微血管并发症，是导致终末期肾病(end stage renal disease，ESRD)的首要病因，已成为严重威胁人类健康的公共卫生问题^[1-2]。目前，DKD的临床治疗取得了显著进展，但其病情进展仍无法得到有效控制^[3]。既往针对DKD的研究主要集中于肾小球病变机制的探讨，而近年来研究则更关注肾小管损伤在DKD发生和发展中所发挥的作用。研究^[4-6]发现在高糖环境下，肾小管上皮细胞作为初始的损伤靶点，极易受到代谢紊乱的影响，进而诱发氧化应激和多种细胞因子过度分泌，最终导致细胞程序性死亡、间质炎症以及肾纤维化，因而减轻或防止肾小管上皮细胞损伤可能是防治DKD的重要干预策略。细胞焦亡是一种与炎症密切相关的程序性细胞死亡形式，其释放的促纤维化因子或可直接驱动肾小管间质病变，阐明其调控机制对防治DKD具有重要意义^[7-8]。

目前，细胞焦亡在DKD中的具体作用机制仍不明确。为了明确DKD发病机制以及肾小管损伤的关键调控因子，本课题组前期基于数据集GSE104954，采用加权基因共表达网络分析(weighted gene co-expression network analysis，WGCNA)筛选出一组与DKD密切相关的差异表达基因，并进一步通过数据集验证发现膜联蛋白A2(Annexin A2，ANXA2)基因在DKD组中呈显著高表达，并与肾小球滤过率(glomerular filtration rate，GFR)呈负相关^[9]。ANXA2是一种钙离子依赖性磷脂结合蛋白，广泛参与细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭和黏附等多种生物学过程。研究^[10-12]表明ANXA2在多种肿瘤的发生和发展中发挥重要作用，通过调控多条信号通路促进肿瘤细胞的增殖与侵袭。部分研究^[13-14]初步揭示了ANXA2可能与DKD密切相关。Chen等^[15]研究发现：在正常培养的肾小管上皮细胞系HK-2细胞中，ANXA2通过调控炎症信号通路关键基因的选择性剪接来参与炎症反应调控。本研究通过体外实验深入探讨ANXA2在高糖介导的肾小管上皮细胞损伤中的作用机制，分析其作为DKD潜在治疗靶点的应用前景，旨在为寻找新的DKD治疗策略提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 化学试剂

杜氏改良Eagle培养基(Dulbecco’s modified Eagle medium，DMEM；品牌Gibco，目录编号11965092)、10%胎牛血清(fetal bovine serum，FBS；品牌Gibco，目录编号10099141)、Lipofectamine®2000转染试剂(品牌Invitrogen，目录编号11668019)及TRIzol试剂(目录编号15596026)均购自美国赛默飞世尔科技公司；Procell细胞专用培养基(货号CM-0208)和HK-2细胞均购自武汉普诺赛生命科技有限公司；1%青霉素-链霉素(产品编号SV30010)购自上海碧云天生物技术有限公司；葡萄糖购自中国Wellbio公司；mRNA反转录试剂盒(货号CW2569)和实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR)试剂盒均购自康为世纪生物科技股份有限公司；细胞质、细胞核蛋白提取试剂盒(货号P1201)购自中国北京普利莱基因技术有限公司；二辛可宁酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白定量试剂盒(货号AWB0104)和蛋白质印迹法试剂盒均购自中国长沙艾碧维生物(Abiowell)科技有限公司；凋亡检测试剂盒(货号KGA1030)购自江苏凯基生物技术股份有限公司；5-乙炔基-2-脱氧尿苷(5-ethynyl-2-deoxyuridine，EdU)检测试剂盒(产品编号C10310)购自广州锐博生物技术有限公司；染色质免疫沉淀(chromatin immunoprecipitation，ChIP)试剂盒(目录编号ab500)、α-平滑肌肌动蛋白(alpha-smooth muscle actin，α-SMA)抗体(目录编号ab7817)及Ⅳ型胶原(collagen type IV，Col-IV)抗体(目录编号ab86042)购自英国Abcam公司；无内毒素质粒大量提取试剂盒(目录号DP117)购自天根生化科技(北京)有限公司；双荧光素酶检测试剂盒(货号E1910)购自美国Promega公司；ANXA2抗体(目录编号11256-1-AP)、纤连蛋白(fibronectin，FN)抗体(目录编号15613-1-AP)、p65抗体(目录编号80979-1-RR)、NLR家族Pyrin域蛋白3(NLR family Pyrin domain containing 3，NLRP3)抗体(目录编号19771-1-AP)、胱天蛋白酶-1(caspase-1，CASP-1)抗体(目录编号22915-1-AP)、白细胞介素(interleukin，IL)-1β抗体(目录编号66737-1-Ig)、IL-18抗体(目录编号10663-1-AP)、β-肌动蛋白(beta-actin，β-actin)抗体(目录编号66009-1-Ig)及正常兔IgG(目录编号B900610)均购自美国Proteintech公司p50抗体(货号13586S)购自美国Cell Signaling Technology公司；过表达ANXA2试剂(货号HG-HO0050140)、ANXA2 siRNA套装(货号HG-si0050140)及ANXA2启动子质粒(货号HG-PRO002858)均购自长沙艾碧维生物科技有限公司。

1.2 仪器

直热式二氧化碳培养箱(型号DH-160I)购自上海三腾仪器有限公司；光学显微镜购自(型号BA210T)麦克奥迪(Motic)实业集团有限公司；荧光定量RCP仪(型号PikoReal96)购自美国Thermo Scientific公司；蛋白质印迹成像系统(型号ChemiScope6100)购自上海勤翔科学仪器有限公司；化学发光检测仪购自(型号GloMax 20/20)美国Promega公司。

1.3 方法

1.3.1 细胞株的培养

人肾小管上皮细胞系HK-2细胞(购自武汉普诺赛生命科技有限公司，货号CL-0109)和人胚肾细胞系293T细胞[购自长沙艾碧维生物科技公司，货号HG-NC002]分别以Procell细胞专用培养基、DMEM为载体，在添加10%热灭活FBS、1%青霉素(100 U/mL)以及1%链霉素(100 U/mL)后，置于37 ℃、5% CO₂的培养箱中培养；每2~3 d更换1次培养液，当细胞融合度为80%~90%时，使用0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA)溶液进行传代或冷冻保存。参考既往研究^[16-17]分组方法将HK-2细胞随机分为3组，即正常组(5.5 mmol/L葡萄糖)、高糖组(30.0 mmol/L葡萄糖)和高渗对照组 (24.5 mmol/L甘露醇+5.5 mmol/L葡萄糖)。各组细胞均处理48 h用于后续实验干预。

1.3.2 过表达质粒转染HK-2细胞

选取生长状态良好的HK-2细胞进行转染，当细胞在6孔板中培养24 h且细胞融合度为60%~70%时，使用Lipofectamine^®2000转染试剂将过表达ANXA2的质粒导入细胞中，操作步骤严格按照试剂说明书执行。同时设置空白质粒对照组(HG+pcDNA3.1)。采用蛋白质印迹法检测转染效率。

1.3.3 SiRNA转染HK-2细胞

分组：将正常组中处于对数生长期的HK-2细胞随机分为对照组(Control组)、无序对照组(siRNA-ANXA2-NC组)以及siRNA-ANXA2-靶点1组(siRNA-ANXA2-1组)、靶点2组(siRNA-ANXA2-2组)、靶点3组(siRNA-ANXA2-3组)，靶点组分别转染针对ANXA2不同靶点的siRNA，而siRNA-ANXA2-NC组转染无序对照siRNA。将20 μmol/L的siRNA母液以5 μL siRNA+95 μL无血清培养基的配比进行稀释得到 1 μmol/L的siRNA溶液，与Lipofectamine^®2000转染试剂充分混匀后，于室温下静置5~10 min；将混合液均匀加入到6孔板的培养液中，以达到所需的终浓度200 nmol/L，并将HK-2细胞在37 ℃下培养6 h后更换新鲜的完全培养液。阴性对照组的siRNA转染步骤与实验组相同，ANXA2 siRNA序列见表1。采用蛋白质印迹法检测转染效率。

1.3.4 EdU实验检测细胞增殖情况

分组：将HK-2细胞分为正常组、高糖组、高渗对照组、高糖+ANXA2过表达组[HG+ANXA2(+)组]、HC+pcDNA3.1组(空载体对照)、高糖+siANXA2组(HG+siANXA2组)和高糖+siRNA阴性对照组(HG+siNC组)。使用EdU试剂盒检测细胞增殖情况，操作步骤严格按照试剂盒说明书执行，并在荧光显微镜下观察EdU阳性细胞分布情况，计算细胞增殖率。细胞增殖率= (EdU阳性细胞数/总细胞数)×100%。

1.3.5 流式细胞术检测细胞凋亡

采用Annexin V与碘化丙啶(propidine iodide，PI)双重染色方法检测细胞凋亡水平。收集细胞，加入Annexin V和PI染色液进行处理，操作流程严格按照说明书执行，并使用流式细胞仪检测各组HK-2细胞总凋亡率。Annexin V⁺/PI⁻代表早期凋亡细胞，分布于流式细胞术分析中的右下象限(lower right，LR)，其占所有检测细胞的比例即为早期凋亡细胞比例(LR%)；Annexin V⁺/PI⁺代表晚期凋亡及坏死细胞，分布于流式细胞术分析中的右上象限(upper right，UR)，其占所有检测细胞的比例即为晚期凋亡及坏死细胞比例(UR%)；总凋亡率(%)=LR%＋UR%。

1.3.6 RT-qPCR实验

使用TRIzol试剂提取细胞总RNA，并依据mRNA反转录试剂盒说明书进行反转录反应，将合成的cDNA用于RT-qPCR实验，引物序列见表2。所有操作严格按照试剂盒说明书执行，采用qPCR测定目标基因的mRNA表达水平。

1.3.7 蛋白质印迹实验

提取细胞总蛋白质、细胞质和细胞核蛋白质，使用BCA蛋白质定量试剂盒测定蛋白质浓度。根据目的蛋白质的丰度，调整蛋白质样品浓度，进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)分离，随后完成转膜、封闭并加入一抗(ANXA2、Col-IV、p50、NLRP3、caspase-1均为1꞉1 000；IL-1β、IL-18均为1꞉5 000；FN、p65均为1꞉10 000；α-SMA为0.341 µg/mL)；使用含吐温20的Tris缓冲盐溶液(Tris-buffered saline with Tween 20，TBST)洗涤，添加二抗并使用增强型化学发光(enhanced chemiluminescence，ECL)显色系统检测蛋白质条带。通过光密度分析计算目的蛋白质与β-actin的比值，据此定量目的蛋白质的表达水平。

1.3.8 免疫荧光分析

将HK-2细胞接种于培养皿中的盖玻片上，待细胞生长至单层后，取出盖玻片并使用PBS清洗3次，3 min/次；使用4%多聚甲醛溶液固定细胞30 min，而后用PBS清洗3次，5 min/次。细胞通透化处理时，使用0.3% Triton X-100溶液在37 ℃下孵育细胞30 min，加入5%牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)溶液在37 ℃下封闭1 h；加入目的基因一抗，于4 ℃过夜，并与荧光二抗在室温下孵育90 min。使用 4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(4’,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)染色细胞核，最终以甘油封片并在荧光显微镜下观察。

1.3.9 免疫共沉淀

HK-2细胞经PBS清洗后，使用免疫沉淀(immunoprecipitation，IP)裂解液在冰上裂解30 min，于4 ℃下以12 000 r/min离心收集上清液，分为全蛋白质组(Input)、IgG对照组(加入正常兔IgG)以及IP组(加入抗p50或p65抗体)，于4 ℃下旋转孵育过夜后与预处理蛋白A/G免疫磁珠偶联2 h；洗涤沉淀并煮沸变性，经SDS-PAGE电泳、转膜、5%脱脂奶粉封闭，加一抗(p50为1꞉1 000，ANXA2、p65均为1꞉5 000)于4 ℃过夜，加二抗于室温孵育后ECL显影。

1.3.10 ChIP实验

ChIP实验前，使用JASPAR软件预测ANXA2启动子区域的6个特异性DNA结合位点，设计特异性引物(表3)。将HK-2细胞在室温下使用由缓冲液A、PBS和1.1%甲醛组成的混合溶液处理10 min，随后加入甘氨酸终止反应。处理后的细胞经离心后依次在缓冲液B、缓冲液C和缓冲液D中重悬并进行超声处理，再次离心后经过IP和解交联，提取纯化的DNA。通过qPCR检测目标DNA的富集程度，计算富集倍数。

1.3.11 双荧光素酶检测

在前述ChIP实验的基础上，将野生型和不同突变型的ANXA2启动子报告质粒插入载体，分别与空载(negative control，NC)或p65共转染至细胞中。实验分为8组，即NC+野生型ANXA2启动子组、p65+野生型ANXA2启动子组、NC+突变型M2(ANXA2 promoter-mutation 2，ANXA2p-M2)启动子组、p65+ANXA2p-M2启动子组、NC+突变型M4(ANXA2 promoter-mutation 4，ANXA2p-M4)启动子组、p65+ANXA2p-M4启动子组、NC+突变型M6(ANXA2 promoter-mutation 6，ANXA2p-M6)启动子组、p65+ANXA2p-M6启动子组。

将50×被动裂解缓冲液(passive lysis buffer，PLB)与1×磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)混合，制备1×PLB细胞裂解液；将荧光素酶底物溶解于10 mL荧光素酶测定缓冲液II(luciferase assay reagent II，LAR II)中，得到LAR II检测液；将293T细胞接种于24孔板并转染相应质粒，吸去培养基，使用1×PBS洗涤细胞2次，每孔加入300 µL的1×PLB，于室温下振荡15 min以裂解细胞；将裂解液转移至新的艾本德(Eppendorf)管中，混合20 µL细胞裂解液与100 µL的LAR II溶液，使用化学发光检测仪测定发光强度；加入100 µL Stop&Glo检测液终止萤火虫荧光素酶信号，并激活海肾荧光素酶信号，测定海肾荧光强度。

1.4 统计学处理

采用GraphPad Prism 9.5.1软件进行数据分析。计量资料以均数±标准差表示，多组间两两比较采用独立样本t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 <bold><italic>ANXA2</italic></bold>在高糖处理<bold>HK-2</bold>细胞中的表达情况

采用RT-qPCR和蛋白质印迹法检测正常组 (5.5 mmol/L葡萄糖)、高糖组(30.0 mmol/L葡萄糖)和高渗对照组(24.5 mmol/L甘露醇+5.5 mmol/L葡萄糖)细胞ANXA2 mRNA和ANXA2蛋白的相对表达水平，结果显示：与正常组相比，高糖组HK-2细胞ANXA2 mRNA、ANXA2蛋白的表达水平均升高(P<0.01或 P<0.001)；高渗对照组ANXA2 mRNA、ANXA2蛋白的表达水平与正常组比较差异均无统计学意义(均P>0.05；图1A、1B)。免疫荧光试验结果显示：与正常组相比，高糖组HK-2细胞ANXA2的核易位显著增强(图1C)。

2.2 <bold><italic>ANXA2</italic></bold>过表达质粒和<bold>siRNA</bold>转染结果

蛋白质印迹法结果(图2A)显示：与高糖组相比，转染ANXA2过表达质粒细胞ANXA2蛋白表达水平增高(P<0.05)。

SiRNA转染结果(图2B)显示：与control组相比，siRNA-ANXA2-1组ANXA2蛋白表达水平降低(P<0.001)，因而选择siRNA-ANXA2-1组进行后续siRNA干扰实验。

2.3 <bold><italic>ANXA2</italic></bold>在高糖处理<bold>HK-2</bold>细胞损伤中的作用

采用EdU试剂盒检测细胞增殖率，流式细胞术分析细胞凋亡率，结果(图3)显示：与正常组相比，高糖组HK-2细胞增殖率降低，细胞凋亡率升高(均 P<0.05)；过表达ANXA2后，与高糖组相比，HG+ANXA2(+)组HK-2细胞增殖率降低，细胞凋亡率升高(均P<0.05)；采用siRNA干扰ANXA2表达后，与高糖组相比，HG+siANXA2组细胞增殖率升高，细胞凋亡率降低(均P<0.01)。

采用蛋白质印迹法检测各组HK-2细胞α-SMA、FN、Col-IV的蛋白质表达水平，结果(图4)显示：与正常组相比，高糖组细胞α-SMA、FN和Col-IV的蛋白质表达水平均升高(均P<0.001)；过表达ANXA2后，与高糖组相比，HG+ANXA2(+)组细胞α-SMA、FN和Col-IV的蛋白质表达水平均升高(均P<0.05)；采用siRNA干扰ANXA2表达后，与高糖组相比，HG+siANXA2组细胞α-SMA、FN和Col-IV的蛋白表达水平均降低(P<0.05或P<0.01)。

2.4 <bold><italic>ANXA2</italic></bold>通过核转录因子<bold>κB</bold>调控高糖诱导的<bold>HK-2</bold>细胞焦亡相关通路

采用蛋白质印迹法检测各组核转录因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)亚基p50和p65在细胞质及细胞核中的表达水平，结果(图5A、5B)显示：与正常组相比，高糖组细胞质和细胞核中p50和p65的蛋白质表达水平均升高(P<0.01或P<0.001)；过表达ANXA2后，与高糖组相比，HG+ANXA2(+)组细胞质和细胞核中p50和p65的蛋白质表达水平均升高(P<0.05或P<0.001)；采用siRNA干扰ANXA2表达后，与高糖组相比，HG+siANXA2组细胞质和细胞核中p50和p65的蛋白质表达水平均下降(P<0.05或P<0.01)。免疫荧光分析结果(图5C)显示：正常条件下，p50和p65主要聚集在细胞质中且呈低表达；经高糖处理后，细胞质中p50和p65表达上调，并部分迁移至细胞核内；在HG+ANXA2(+)组和HG+siANXA2组中，p50和p65的核定位进一步增强或部分减弱。

为了探讨ANXA2是否通过NF-κB调控细胞焦亡相关通路，采用RT-qPCR和蛋白质印迹法检测每组HK-2细胞中NF-κB的下游靶标蛋白表达，结果(图6)显示：与正常组相比，高糖组中NLRP3、caspase-1、IL-1β和IL-18的mRNA表达水平均升高，而NLRP3、前caspase-1、caspase-1 p20、IL-1β和IL-18的蛋白质表达水平也均升高(均P<0.05)；过表达ANXA2后，与高糖组相比，HG+ANXA2(+)组上述因子的mRNA和蛋白质表达水平均升高(均P<0.05)；采用siRNA干扰ANXA2表达后，与高糖组相比，HG+siANXA2组上述因子的mRNA和蛋白质表达水平均下降(均 P<0.05)。

2.5 <bold>NF-κB</bold>亚基<bold>p65</bold>与<bold><italic>ANXA2</italic></bold>存在蛋白质相互作用并正向调控其转录活性

为解析ANXA2与NF-κB亚基的相互作用机制，先通过免疫共沉淀进行验证：分别以p50、p65抗体为诱饵蛋白进行免疫共沉淀，再采用蛋白质印迹法检测ANXA2表达，结果显示ANXA2与p65存在特异性相互作用(图7A)。在此基础上探讨p65对ANXA2的转录调控作用，采用ChIP-qPCR分析ANXA2启动子6个DNA区域(ChIP-1至ChIP-6)的结果显示：ANXA2启动子ChIP-2、ChIP-4和ChIP-6区域存在显著富集(富集倍数>1)；ChIP-1、ChIP-3和ChIP-5区域未检测到显著富集(富集倍数≤1)(图7B)。值得注意的是，NF-κB亚基p50在所有检测区域均未检测到显著富集。为进一步验证p65对上述结合区域的转录调控功能，分别针对ChIP-2、ChIP-4和ChIP-6区域构建对应的突变型荧光素酶报告载体(M2、M4、M6)。转染p65表达载体后，突变型M2、M4、M6组的荧光素酶活性较空载对照组均升高(P<0.05或P<0.01)(图7C)。

3 讨 论

细胞焦亡的特征表现为细胞肿胀直至质膜破裂，导致胞内促炎物质大量释放，进而激活强烈的炎症反应。Zhou等^[18]研究发现NLRP3炎症小体的组装和caspase-1的激活是驱动细胞焦亡的核心步骤。另有研究^[19-20]发现NF-κB是DKD的关键炎症刺激因子，当NF-κB抑制因子α(NF-κB inhibitor alpha，IκBα)被免疫蛋白酶降解时，可促使NF-κB与其亚基p50、p65结合形成的异二聚体活化以及核易位，并在细胞核中与靶基因的特定启动子序列结合。研究^[21-22]表明：NF-κB可上调DKD中NLRP3表达，继而活化其下游效应因子，诱导焦亡通路激活；NF-κB抑制剂可减轻高糖诱导的细胞焦亡激活程度；NF-κB并不能直接介导质膜孔道形成，但可为炎症小体的组装提供分子基础。本研究结果证实，高糖干预可激活HK-2细胞NF-κB信号通路，并显著上调NLRP3、caspase-1、IL-1β和IL-18等焦亡相关炎症因子的mRNA表达水平。

本研究采用高糖干预HK-2细胞48 h后，ANXA2 mRNA和ANXA2蛋白表达水平均显著升高；过表达ANXA2可显著增强NF-κB亚基p50和p65在细胞质和细胞核中的表达并促进其核转位，具有抑制细胞活力、促进细胞凋亡及纤维化的作用，可进一步上调高糖诱导的焦亡相关通路因子的表达水平；抑制ANXA2表达则能有效逆转上述损伤效应。这提示ANXA2参与调控NF-κB通路的激活，上调NLRP3表达及促进caspase-1活化，可促进高糖诱导的HK-2细胞焦亡通路激活。本研究通过免疫共沉淀实验进一步证实ANXA2与p65亚基存在特异性相互作用。既往研究认为ANXA2与NF-κB通路密切相关：在肝细胞癌中，转胶蛋白2(transgelin 2，TAGLN2)通过靶向ANXA2调节NF-κB信号通路促进肿瘤的增殖和侵袭^[23]；创伤弧菌感染细胞外金属蛋白酶通过调控ANXA2，激活活性氧(reactive oxygen species，ROS)介导的NF-κB途径以诱导IL-1β表达^[24]；三结构域蛋白33介导的ANXA2泛素化可显著增强其与NF-κB亚基p50和p65的相互作用^[25]。本研究推测，ANXA2通过增强NF-κB活性激活NLRP3炎症小体依赖性细胞焦亡通路，这可能是高糖诱导肾小管上皮细胞损伤的关键机制之一。

本研究ChIP和荧光素酶报告基因实验结果证明：NF-κB亚基p65可直接结合ANXA2基因启动子并增强其转录活性，提示NF-κB对ANXA2具有正向转录调控作用。既往研究^[26]表明：脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)/Toll样受体4(Toll-like receptor 4，TLR4)通路可通过其下游转录因子NF-κB p65与c-Jun原癌基因(Jun proto-oncogene，c-Jun)直接结合ANXA2启动子，介导肝损伤过程。上述结果提示：ANXA2不仅参与激活NF-κB信号通路，而且活化的NF-κB还能正向调控ANXA2表达，二者形成正反馈环路，持续增强NLRP3炎症小体活性，促进caspase-1激活以及IL-1β、IL-18产生，加速细胞焦亡通路激活和加剧肾小管损伤。值得注意的是，ANXA2促进细胞焦亡的作用机制可能并不完全依赖于该环路，潜在的非依赖性NF-κB途径仍有待深入探究。

本研究仍存在一些不足：1)ANXA2/NF-κB环路在高糖环境下的初始触发机制仍有待阐明；2)细胞焦亡过程中各种信号分子的时序性变化及动态调控网络需进一步解析；3)该环路在体内复杂微环境中的作用仍需动物模型和临床样本加以验证。后续研究将围绕上述问题深入探索，更完整地揭示ANXA2在DKD发生和发展中的作用及分子机制。

综上所述，本研究发现ANXA2与NF-κB通过正反馈调控环路持续激活NLRP3炎症小体及其下游焦亡效应分子，最终加剧高糖诱导的肾小管上皮细胞损伤。ANXA2与NF-κB存在双向调控关系，这为理解DKD炎症级联反应提供了新视角，也提示靶向ANXA2或阻断其与NF-κB亚基p65的相互作用可能成为延缓DKD进展的潜在策略。

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基金资助

湖南省自然科学基金(2021JJ70149)

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