月球土壤模拟物和地球土壤在小鼠肺损伤中的作用

Effects of lunar soil simulant and Earth soil on lung injury in mice

摘要

目的 月球表面尘埃因长期受宇宙辐射及陨石撞击作用的影响，形成具有高静电吸附特性的纳米级棱角结构，这些尘埃具有吸入风险，但其对肺部的毒理机制尚不清楚。针对月球基地建设和资源开发过程中的粉尘暴露防护需求，本研究通过构建月球土壤模拟物(lunar soil simulant，LSS)急性暴露模型，并以地球土壤(Earth soil，ES；陕西黄土)为对照，旨在探究粉尘吸入对肺损伤的作用机制。 方法 将C57BL/6小鼠随机分为3组：磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)组、LSS组和ES组，每组5~7只小鼠。LSS组和ES组分别使用LSS和ES建立急性吸入模型，采用单次呛咳法进行暴露。实验过程中动态监测小鼠体重变化，持续28 d，并于暴露后第3、7、14、28天分批处死小鼠取材，采集外周血、肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)及肺组织样本。通过流式细胞术分析BALF中免疫细胞亚群的动态变化；采用HE染色评估肺组织结构及炎症程度，过碘酸-雪夫(periodic acid-Schiff，PAS)染色评估气道黏液分泌，Masson染色判断胶原沉积情况。通过实时反转录聚合酶链反应(real-time reverse transcription PCR，real-time RT-PCR)检测炎症因子(IL-1β、IL-6、TNF-α)及上皮屏障相关基因(Occludin、Cadherin-1、Zo-1)的mRNA表达水平。选取暴露后第7天的肺组织样本进行转录组学测序，并结合免疫浸润分析和功能通路富集分析，探讨LSS和ES对肺部免疫微环境的调控效应。 结果 ES组小鼠在暴露18 d后体重逐渐下降(均P<0.05)，而LSS组小鼠的体重与PBS组的差异无统计学意义。HE染色结果显示：LSS与ES均可诱发气道及血管周围的炎症细胞浸润，且炎症反应在28 d内持续存在，但随着时间延长有逐渐减轻的趋势。PAS染色提示LSS组小鼠在第3天出现明显的气道黏液分泌增加，之后逐渐恢复；ES组未见显著变化。Masson染色结果未见LSS组或ES组在28 d内出现明显的肺纤维化改变。Real-time RT-PCR结果显示：LSS和ES处理均可显著上调肺组织中IL-1β及TNF-α的表达，尤其在暴露第7天时炎症反应最为显著，同时伴随Occludin、Cadherin-1、Zo-1等上皮屏障标志基因表达下调(均P<0.05)。转录组分析结果显示：LSS与ES处理均显著激活与趋化因子相关的通路，富集到多条白细胞迁移、中性粒细胞募集等免疫相关通路。进一步验证发现LSS组肺组织中CXCL2及MMP12表达上调；ES组则以CXCL3及MMP12表达上调为主。 结论 LSS和ES均可诱导小鼠持续性肺损伤和中性粒细胞浸润，但所依赖的分子机制存在差异。与ES相比，LSS暴露还会引发短暂的嗜酸性粒细胞应答，提示LSS颗粒具有更强的免疫激活潜能和生物毒性。

Abstract

Objective Due to prolonged exposure to cosmic radiation and meteorite impacts, lunar surface dust forms nanoscale angular particles with strong electrostatic adsorption properties. These dust particles pose potential inhalation risks, yet their pulmonary toxicological mechanisms remain unclear. Given the need for dust exposure protection in future lunar base construction and resource development, this study established an acute exposure model using lunar soil simulant (LSS) and used Earth soil (ES; Loess from Shaanxi, China) as a comparison to investigate lung injury mechanisms. Methods C57BL/6 mice were randomly assigned to 3 groups: Phosphate buffered saline (PBS), LSS, and ES, with 5 to 7 mice per group. Mice in the LSS and ES groups received a single intratracheal instillation to induce acute inhalation exposure. Body weight was monitored for 28 days. Mice were euthanized at days 3, 7, 14, and 28 post-exposure, and peripheral blood, bronchoalveolar lavage fluid (BALF), and lung tissues were collected. Immune cell subsets in BALF were analyzed using flow cytometry. Hematoxylin-eosin (HE) staining assessed lung structure and inflammation; periodic acid-Schiff (PAS) staining evaluated airway mucus secretion; Masson staining examined collagen deposition. Real-time reverse transcription PCR (real-time RT-PCR) was used to measure the mRNA expression of inflammatory cytokines (IL-1β, IL-6, and TNF-α) and epithelial barrier genes (Occludin, Cadherin-1, and Zo-1). Lung tissues at day 7 were subjected to transcriptomic sequencing, followed by immune infiltration and pathway enrichment analyses to determine immunoregulatory mechanisms. Results Body weight in the ES group progressively declined after day 18 (all P<0.05), while the LSS group showed no significant changes compared with the control group. HE staining showed both LSS and ES induced inflammatory cell infiltration around airways and vasculature, which persisted for 28 days but gradually lessened over time. PAS staining revealed marked mucus hypersecretion in the LSS group at day 3, followed by gradual recovery; no significant mucus changes were observed in the ES group. Masson staining indicated no obvious pulmonary fibrosis in either group within 28 days. Real-time RT-PCR demonstrated significant upregulation of IL-1β and TNF-α in both LSS and ES groups, peaking on day 7, accompanied by downregulation of epithelial barrier genes (Occludin, Cadherin-1, and Zo-1) (all P<0.05). Transcriptomic analysis showed that both LSS and ES activated chemokine-related pathways and enriched leukocyte migration and neutrophil recruitment pathways. Further validation revealed upregulation of CXCL2 and MMP12 in the LSS group, whereas CXCL3 and MMP12 were predominantly elevated in the ES group. Conclusion Both LSS and ES can induce sustained lung injury and neutrophil infiltration in mice, though the underlying molecular mechanisms differ. Compared with ES, exposure to LSS additionally triggers a transient eosinophilic response, suggesting that lunar dust particles possess stronger immunostimulatory potential and higher biological toxicity.

Graphical abstract

关键词

月球土壤模拟物 / 肺损伤 / 地球土壤 / 粉尘暴露 / 趋化因子

Key words

lunar soil simulant / lung injury / Earth soil / dust exposure / chemokines

随着人类深空探索计划的不断推进，建设月球基地和实现长期驻留已成为多个国家的战略目标。然而，月球表面的特殊环境对人类健康构成潜在威胁^[1]。宇航员在月球表面活动过程中不可避免地会接触到大量的月球土壤，其中粒径小于20 μm的粒子被称为月尘^[2]。这类尘埃具有独特的物理和化学性质，在月表低重力、高真空及强烈辐射环境下易携带静电，从而表现出极强的附着性^[3]。这些尘埃易附着于宇航服或装备表面，即便在返回舱内经过清除处理，仍有大量尘埃可保持悬浮状态，形成气溶胶，从而易被宇航员或地面工作人员吸入^[4]。

月尘暴露可诱发一系列健康问题，例如慢性支气管炎、结膜炎和心血管疾病等^[5-7]。宇航员完成任务返回后出现的呼吸道不适症状也引起了广泛关注^{[6, 8-9]}。此外，地面参与太空服拆卸、处理的工作人员同样面临尘埃暴露风险。有报道^[10]称部分接触月尘的人员出现了类似过敏反应的呼吸道症状，甚至发展为嗜酸性粒细胞增多症。这些现象提示月尘可能引发免疫系统的异常激活，并在一定条件下引发持续性的肺部炎症反应。

越来越多的证据支持月球土壤可对呼吸系统造成毒性作用^[11]。既往研究^[12]发现：高剂量月球土壤模拟物(lunar soil simulant，LSS)可引起小鼠肺组织的急性炎症反应，随后可发展为慢性炎症状态，最终导致肺组织纤维化。其他研究^[13-14]同样报道，在接受月尘暴露的大鼠中，肺组织出现明显的中性粒细胞浸润、肺泡隔增厚及胶原沉积等改变，提示存在炎症与纤维化过程。进一步机制研究^[14]发现，这些病理改变与活化B细胞核因子κ轻链增强子(nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells，NF-κB)信号通路介导的免疫细胞活化和分化密切相关，而氧化应激关键分子NADPH氧化酶4型(NADPH oxidase 4，NOX4)的上调可能在月尘诱导的肺纤维化过程中发挥关键作用。然而，关于月尘如何在不同阶段诱发肺部免疫失衡、屏障破坏及组织重塑，其具体机制仍未被系统阐明，相关研究存在明显空白。

相较之下，地球土壤(Earth soil，ES)所引起的健康风险已被证实。空气污染中颗粒物的吸入是加重慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)及哮喘等呼吸系统疾病的主要因素之一^[15]。与月尘类似，地球尘埃中亦富含金属元素，并在吸入后引发呼吸道上皮屏障损伤和免疫应答。因此，地球尘埃可作为月尘毒理研究的参考材料，通过二者的对比研究有助于评估人类在地球与月球环境中因尘埃暴露所引发的健康差异。

本研究模拟月球基地建设与作业过程中尘埃暴露的实际情境，构建急性吸入暴露动物模型，评价LSS对小鼠肺部的影响，并与ES(选自陕西黄土)进行比较；通过肺组织病理观察、免疫细胞亚群分析、炎症因子表达及转录组测序等方法，旨在探究LSS吸入所引发的免疫病理反应及其潜在机制。

1 材料与方法

1.1 伦理声明

本研究已获得中南大学湘雅医院实验动物伦理委员会批准(审批号：NO.202505068)。

1.2 动物及试剂

6~8周龄C57BL/6J雌性小鼠[许可证号：SCXK(湘)2024-0019]购自湖南斯莱克实验动物技术有限公司，饲养于无特定病原级别动物屏障房内，温度为23 ℃~25 ℃，湿度为40%~60%。所有小鼠都暴露在12 h的光/暗循环中，允许自由接触水和标准实验室饲料，并定期更换垫料。

LSS(SC-080)^[16]购自加拿大SimulTek Research公司，其主要成分参考阿波罗16号月球样本^[17]；ES购自国家标准物质资源共享平台(GBW07408)，LSS和ES主要成分见表1。磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)、组织细胞固定液、苏木精-伊红(hematoxylin-eosin，HE)染液购自武汉赛维尔生物有限公司；过碘酸雪夫(periodic acid-Schiff，PAS)染色试剂盒、Masson染色试剂盒、吐温20购自中国索莱宝科技有限公司；AG RNAex Pro RNA提取试剂购自湖南艾科瑞生物工程有限公司；三氯甲烷、异丙醇、无水乙醇、二甲苯购自上海国药集团化学试剂有限公司；小鼠CD45 APC-Cy7流式抗体、Siglec-F APC流式抗体、Ly6G PE流式抗体、CD11b FITC流式抗体、CD11c PE-Cy7流式抗体、CD3ε BV421流式抗体、CD4 PE/Dazzle 594流式抗体、CD8 PerCP-Cy5.5流式抗体购自美国Biolegend公司；2×SYBR Green qPCR Master Mix购自深圳市达科为生物技术股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 分组及造模

将实验小鼠随机分为3组，即对照组(PBS组)、LSS组和ES组。根据既往研究^[18]，LSS组和ES组小鼠通过单次呛咳方式给予1 mg LSS或ES进行造模。每组进一步分为3 d、7 d、14 d和28 d 4个时间点(表2)。第1天经异氟烷吸入性麻醉后，通过气管呛咳的方式给予PBS组小鼠50 μL PBS、LSS组小鼠50 μL LSS混悬液(1 mg LSS充分研磨后溶于50 μL PBS)、ES组小鼠50 μL ES混悬液(1 mg ES充分研磨后溶于50 μL PBS)。

1.3.2 样本收集

分别于第3、7、14、28天收集小鼠样本。

经腹腔注射麻醉药，待完全麻醉后经眼球取血，收集的血标本室温静置2 h以上后，以8 000 r/min离心10 min，收集上清液储存于-80 ℃冰箱备用。

用75%乙醇消毒小鼠的颈部、胸腹部和下肢，剪开小鼠腹腔和胸腔，暴露肺部，接着剪开小鼠颈部皮肤和肌肉，充分暴露小鼠气管，经气管插入肺泡灌洗留置针，使用0.8 mL无菌PBS灌洗小鼠肺组织2次，获得小鼠肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)。

剪断小鼠左肾动脉后，使用3 mL PBS经右心室灌流小鼠肺组织，分离小鼠左肺组织，在组织固定液中保存，小鼠右肺组织置于冰上或储存于-80 ℃冰箱备用。

1.3.3 BALF的流式细胞术检测

取1.3.2中收集的BALF，离心收集细胞。经裂解红细胞、CD16/CD32封闭10 min后，加入混合抗体，避光孵育45 min后，加入PBS清洗并重悬细胞，避光置于冰上，准备上机检测。

1.3.4 HE染色

小鼠组织置于多聚甲醛溶液中进行固定后，脱水、石蜡包埋、切片。石蜡切片经烤片、脱蜡、水化等步骤后，用苏木精染色，再用伊红进行复染，最后用中性树胶封片，置于白光显微镜下观察，并使用扫描仪扫描记录。

1.3.5 PAS染色

石蜡切片经烤片、脱蜡、水化等步骤后，再经氧化剂氧化、Schiff染液染色、苏木精染液染核等，最后用中性树胶封片，置于白光显微镜下观察，并使用扫描仪扫描记录。

1.3.6 Masson染色

石蜡切片经烤片、脱蜡、水化等步骤后，再经铁苏木精染色液染色、丽春红品红染色、磷钼酸溶液清洗、苯胺蓝染色等，最后用中性树胶封片，置于白光显微镜下观察，并使用扫描仪扫描记录。

1.3.7 肺组织转录组学

测序委托华大基因公司对收集的肺组织进行mRNA转录组学测序，经RNA提取与质控、文库构建与质检，通过华大基因测序平台，利用双末端测序完成转录组测序。对比参考基因组，对基因表达水平进行定量。最后对差异基因表达进行基因本体论(Gene Ontology，GO)和京都基因和基因组数据库(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)等富集分析。使用Cibersoft包进行免疫浸润分析。

1.3.8 组织RNA提取及实时反转录聚合酶链反应

进一步检测各组小鼠肺组织中炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α以及上皮屏障相关分子Occludin、Cadherin-1和Zo-1的mRNA表达水平，以评估炎症反应及肺上皮屏障的损伤情况。取收集的肺组织加入TRIzol及研磨珠研磨后，经三氯甲烷、异丙醇萃取后，涡旋混匀，使用多功能酶标仪检测RNA浓度。选取1 μg RNA的总量进行逆转录，使用表3引物按照实时反转录聚合酶链反应(real-time reverse transcription PCR，real-time RT-PCR)试剂盒说明书对DNA进行扩增，以GAPDH作为内参基因进行标准化处理，采用2^-ΔΔCt方法计算基因相对表达量。

1.4 统计学处理

采用GraphPad Prism 9软件进行数据分析。数据以均数±标准误表示，采用非配对双尾t检验进行2组间比较，采用单因素方差分析(one-way ANOVA)进行多组间均数比较，若差异具有统计学意义，则进一步采用Tukey检验进行组间样本两两分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 单次LSS和ES呛咳后小鼠体重的变化

进行单次呛咳造模后，对LSS组和ES组小鼠体重进行动态监测，每3 d测量1次，持续至第28天(图1A)。ES组小鼠的体重在18 d后呈现明显的下降趋势，与同时间点的PBS组小鼠相比差异均有统计学意义(均P<0.05)；而LSS组的小鼠体重与PBS组相比差异无统计学意义(均P>0.05，图1B)。

2.2 单次LSS和ES暴露诱导小鼠肺组织炎症反应

HE染色(图2A、2B)结果显示：PBS组小鼠肺组织结构完整，气道及血管周围无明显炎症细胞浸润，肺泡腔清晰，未见明显渗出；而LSS组与ES组小鼠均表现出气道及血管周围的炎症细胞浸润。肺泡腔亦可见渗出物，其中第3天最为明显，至第28天时渗出程度有所减轻。这提示炎症逐渐缓解。PAS染色(图2C)结果显示：LSS组小鼠在第3天出现明显的气道黏液分泌增加，而在第7、14及28天无明显黏液分泌。这提示该效应为短暂现象。ES组在各观察时间点均无气道黏液分泌。Masson染色(图2D)显示LSS组和ES组小鼠在28 d内肺组织中均无明显的胶原沉积。这提示未发生显著纤维化改变。上述结果表明单次LSS和ES处理均可诱导小鼠肺组织发生急性炎症反应，并在一定时间内持续存在。随着时间的推移，炎症程度减轻。

2.3 LSS和ES处理引起小鼠气道炎症细胞增多

流式细胞术结果见图3A。与PBS组相比，LSS组和ES组小鼠的BALF中总细胞数在第3、7、14天均升高，但差异均无统计学意义(均P<0.05)，在第28天均显著升高(均P<0.05，图3B)。LSS组中性粒细胞数量在各时间点基本维持稳定，而ES组在第28天出现异常升高(图3C)。这提示ES处理具有更长时间的炎症细胞持续积聚趋势。值得注意的是，LSS组在第3天出现BALF中嗜酸性粒细胞数量的显著升高，随后迅速下降，而ES组嗜酸性粒细胞的升高程度与LSS组比较明显较低(图3D)。BALF中肺泡巨噬细胞在各组间各时间点的差异均无统计学意义(图3E)。在T细胞方面，与PBS组相比，2组干预均可引起BALF中CD4⁺ T细胞和CD8⁺ T细胞数量在第3、7天的显著上升(均P<0.05)；LSS组的CD4⁺ T细胞和 CD8⁺ T细胞数量在第7天达到峰值，随后逐渐下降；ES组的T细胞数量在第3天达到高峰，之后亦呈下降趋势(图3F、3G)。

细胞组成比例分析显示：LSS组小鼠在第3天以嗜酸性粒细胞为主要炎症细胞，之后中性粒细胞和肺泡巨噬细胞比例逐渐增加；而ES组在第3天时以淋巴细胞和肺泡巨噬细胞为主，随时间推移中性粒细胞逐渐成为主要细胞类型(图3H)。

2.4 LSS和ES增加肺组织炎症因子的表达并损害 上皮屏障

与PBS组比较，ES组小鼠肺组织中TNF-α表达在暴露后第3天率先出现显著上调，而LSS组的炎症反应则稍晚，IL-1β和TNF-α的表达在第7天显著升高，且明显高于ES组；此趋势持续到第14天，且LSS组的IL-1β表达依旧高于ES组(均P<0.05，图4A~4C)。上皮屏障分子方面，与PBS组比较，LSS组和ES组在第7天时Occludin和Cadherin-1表达均明显降低，ES组的Zo-1表达亦同步下调(均P<0.05)；至第14天和第28天，部分上皮屏障分子的表达呈现恢复趋势(图4D~4F)。

2.5 LSS和ES处理改变小鼠肺组织免疫微环境

对第7天的小鼠肺组织样本进行了转录组学测序分析，主成分分析(principal component analysis，PCA)显示，各组样本之间重复性良好，组间具有明显的分离趋势，提示LSS组与ES组在转录水平上均与PBS组存在显著差异(图5A)。差异表达分析结果显示，LSS组相比PBS组共检测到1 988个上调基因和1 859个下调基因(图5B)；ES组中则检测到929个上调基因和836个下调基因(图5C)。在LSS组中，SAA3、CXCL5、CCL20 等与炎症及趋化相关的基因显著上调，而NPPA、HAMP、BPIFA1等基因显著下调(图5E)。在ES组中，CXCL5、ITLN1、CCL20等基因上调显著，而RETN、PCK1、NPPA等基因下调明显(图5F)。免疫细胞浸润分析进一步揭示，LSS组肺组织中M1型巨噬细胞比例显著升高，提示其在LSS诱导的炎症反应中可能发挥作用；而在ES组中，未成熟树突状细胞的比例显著升高，表明其可能在ES相关免疫应答中具有重要意义。此外，其他多种免疫细胞亚群在LSS和ES处理后亦表现出与PBS组不同的分布特征(图5D)，提示2种土壤类型可能通过不同免疫通路调节肺组织的炎症反应和免疫微环境。

2.6 LSS和ES处理增加中性粒细胞相关趋化因子表达

KEGG通路富集分析显示：与PBS组相比，LSS组和ES组均在前10的富集通路中包含“趋化因子信号通路”(Chemokine signaling pathway)，提示该通路在2种土壤模拟物诱导的肺损伤中均可能发挥关键作用(图6A、6D)。进一步结合GO结果发现：LSS组和ES组中均富集到多条与细胞迁移相关的通路，特别是与白细胞迁移、中性粒细胞迁移密切相关的功能通路(图6B、6E)。前述BALF细胞流式术的结果提示在暴露后第7天，小鼠气道中中性粒细胞逐渐成为主导炎症的细胞群体。进一步分析转录组中排名前15的差异基因，发现多种与中性粒细胞募集密切相关的趋化因子基因显著上调，包括CXCR1、CXCL2、CXCL3、CXCL5、CD177及MMP12。基于此，对上述6个基因的表达水平进行了定量验证，验证结果显示：与PBS组比较，LSS处理显著诱导小鼠肺组织中CXCL2和MMP12表达上调(均P<0.05，图6C)；而ES处理则显著上调了CXCL3和MMP12的表达(均P<0.05，图6F)。

3 讨 论

月球土壤(粒径<1 mm)和月尘(粒径<20 μm)是由陨石撞击月球表面所形成^[19]，在低重力环境下容易滞留在呼吸道，损伤肺组织。为了评估其对健康的影响，本研究以ES为对照进行比较。本研究结果研究发现，ES暴露导致小鼠体重在第18天后显著下降，而LSS组无明显变化。但小鼠单次吸入LSS或者ES均诱导小鼠肺组织急性炎症反应，表现为炎症细胞浸润和BALF中炎症细胞的增多，第3天最显著，至第28天逐渐缓解。LSS组早期嗜酸性粒细胞急剧升高，伴短暂气道黏液分泌，随后转为中性粒细胞主导的炎症；ES组以淋巴细胞和巨噬细胞为主，后期中性粒细胞持续增多。此外，LSS和ES处理均可在短期内损伤肺上皮屏障的结构，随后呈现一定的自发修复趋势。转录组学分析显示LSS和ES暴露可上调多个趋化因子信号通路，促进中性粒细胞相关趋化因子的表达，但其分子组合不同，LSS组以CXCL2增多为主，而ES组则以CXCL3增多为主。本研究揭示了LSS单次大量暴露所致肺损伤的免疫机制，并与ES暴露所致肺损伤进行了对比，为月球探索健康风险评估及防护提供科学依据，有助于制订针对性预防策略。

既往研究^[19]发现，LSS是不溶于水的颗粒，可通过细胞-颗粒相互作用导致急性细胞损伤。本研究通过多次研磨月壤制备混悬液，避免小鼠呛咳造模时发生大颗粒堵塞大气道导致的肺组织损伤，同时保留月壤多样的粒径分布，以更真实地模拟可吸入月壤的成分特性。研究结果显示显著的组织炎症反应，表明月壤的物理毒性与化学毒性可能是主要的致病因素。

本研究发现单次短时间暴露于LSS不会对小鼠体重产生明显影响。但值得注意的是，单次暴露于ES的小鼠的体重在第18天后出现显著的下降趋势。这一差异可能与LSS和ES的粒径差异及组成成分不同有关。粉尘粒径是影响其毒性作用大小的重要因素之一。本研究所采用的ES标准品的粒径99%以上为0.075 μm，而LSS粒径范围为0.04~1 000 μm，因此在相同质量下，ES沉积到肺深部的有效剂量可能高于LSS，从而表现出更强的毒性。

在第3天，LSS组小鼠BALF中嗜酸性粒细胞比例升高，提示短期暴露内可能诱发类似过敏反应或者T2炎症。这与阿波罗部分宇航员报告的短暂性过敏症状(打喷嚏、眼睛发红、喉咙发痒和鼻窦充血)相一致^[8]。既往研究^[20]也表明，月尘可直接激活嗜酸性粒细胞系，但在本研究中，嗜酸性粒细胞比例在第7~28天逐渐降低，这可能是由于体内存在的其他免疫细胞减轻了嗜酸性粒细胞群的反应有关^[20]，也可能与致敏物质的逐步清除相关。在ES暴露的小鼠中未观察到显著的嗜酸性粒细胞数量增多，与LSS暴露引发的早期嗜酸性粒细胞数量急剧升高形成对比。这一差异可能源于LSS和ES的成分差异。LSS含有较高质量分数的Al₂O₃、CaO、FeO、Na₂O和TiO₂。其中，TiO₂在已有研究中显示出诱导急性嗜酸性粒细胞炎症的潜力，例如在兔模型中引发显著的肺部嗜酸性粒细胞炎症^[21]，并通过激活PI3K/Akt通路增强人嗜酸性粒细胞对内皮细胞的黏附^[22]。这些证据提示TiO₂可能是LSS暴露后嗜酸性粒细胞数量短期升高的主要驱动因素。然而，考虑到种属差异及LSS中TiO₂含量较低，其具体作用机制及与其他成分的协同效应仍需进一步实验验证。

LSS组和ES组小鼠BALF中中性粒细胞比例随时间显著递增，表明LSS及ES所致肺损伤呈渐进性发展，中性粒细胞被募集到肺部并在肺部累积需要时间，这也与既往研究^{[12-13, 23]}结果一致。月壤中富含纳米级金属成分(如Ti等)，可以通过持续产生活性氧，刺激中性粒细胞过度激活并释放蛋白酶^[24]，破坏肺上皮屏障，这与本研究中LSS组小鼠上皮屏障相关基因(Occludin、Zo-1和Cadherin-1)早期下调的现象相符。因此，笔者推测月壤颗粒在肺组织内持续存在可以刺激肺上皮细胞释放趋化因子以募集中性粒细胞^[25]。未清除的颗粒可以被巨噬细胞反复吸收，导致慢性炎症级联反应^[6]。值得注意的是，LSS及ES刺激后，肺部中性粒细胞浸润程度远超巨噬细胞清除能力，提示其可能是肺部炎症持续恶化的核心效应细胞^{[6, 26]}。

本研究中，肺组织内IL-1β和TNF-α的表达在第3~14天渐进性升高，且LSS组显著高于ES组。这一差异可能与LSS颗粒有更尖锐的棱角和独特的粒径分布有关，其不规则形状可能加剧气道和肺组织的机械刺激，进而诱发更强烈的炎症反应。然而第28天时，2组小鼠肺组织炎症因子表达均出现下降，提示LSS和ES暴露所致的急性炎症随时间逐渐缓解。有研究^[12]报道，予以同样剂量的LSS单次干预的小鼠在7~90 d的观察窗内，其肺组织病变由急性炎症反应转变为慢性炎症反应。尽管本研究的Masson染色未显示明显胶原沉积，但这一阴性结果可能源于观察时间不足，需延长观察时间进行验证。

为了进一步探究月壤对肺组织损伤的作用机制，本研究对肺组织进行了转录组学测序。KEGG分析显示，月壤与地壤组均显著富集趋化因子信号通路及中性粒细胞功能通路。关键基因验证表明CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL5和CD177在暴露中后期持续高表达，MMP12呈长期上调趋势。其中CXCL1^[27]、CXCL2^[28]、CXCL3^[29]、CXCL5^[30]均是趋化因子，可介导中性粒细胞募集入肺；CD177是一种通常在中性粒细胞上表达的细胞表面蛋白^[31]，可以通过激活介导的整合素和化学感受器来调节人中性粒细胞的迁移^[31]。而MMP12，又称巨噬细胞弹性蛋白酶，可以通过对内皮细胞的持续损伤促进纤维化的进程^[32]，提示LSS及ES暴露可能存在迟发性肺纤维化风险。

本研究尚存在一定的局限性。第一，由于真实月球土壤样本的稀缺性，使用LSS进行替代研究。然而，LSS在表面反应性、化学组成、颗粒特性及生物学效应等方面与真实月球土壤存在差异，可能无法完全反映真实月球土壤的毒理特性，尤其是在长期暴露和慢性健康效应评估中。第二，实验在地球重力环境下进行，而月球低重力环境可能影响颗粒在肺部的沉积行为，进一步限制了结果对月球实际情境的适用性。未来研究需结合真实月球土壤样本，并模拟月球环境条件，以更准确地评估其毒性及健康风险。

综上，本研究结果表明LSS可损伤肺组织上皮屏障，促进炎症因子和趋化因子表达，募集中性粒细胞进入肺组织从而导致肺损伤。

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基金资助

湖南省科技厅湖湘青年英才项目(2023RC3075┫。This work was supported the Science and Technology Innovation Program of Hunan Province)

湖南省科技厅湖湘青年英才项目(China ┣2023RC3075)

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