月尘模拟物经消化系统暴露的毒性研究：微生物组紊乱与多器官损伤

Toxicity of lunar dust simulant exposure via the digestive system: Microbiota dysbiosis and multi-organ injury

摘要

目的 早在阿波罗11号任务中，宇航员携带月尘(lunar dust，LD)进入返回舱后出现眼部、皮肤和上呼吸道刺激症状，这引起了人们对其潜在生物毒性的关注。然而，LD通过消化系统暴露所造成的影响尚缺乏研究。本研究旨在评估月尘模拟物(lunar dust simulant，LDS)经消化系统暴露对小鼠肠道菌群、肠道、肝、肾、肺及骨骼造成的影响。 方法 以8周龄C57BL/6J雌性小鼠为研究对象，使用LDS代替LD，选择陕西黄土代表地尘(Earth dust，ED)。将小鼠随机分成磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)组、ED组(500 mg/kg)和LDS组(500 mg/kg)，设置第7、14和28天3个暴露时长。每3 d灌胃1次，每次灌胃前称量小鼠体重。在干预结束后，采用16S核糖体RNA(ribosomal RNA，rRNA)测序技术分析小鼠粪便中肠道微生物多样性和组成；采用实时反转录聚合酶链反应(real-time reverse transcription PCR，real-time RT-PCR)检测肠道、肝、肺组织中炎症因子白细胞介素(interleukin，IL)-1β、IL-6和肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α的mRNA表达水平；采用苏木精-伊红(hematoxylin and eosin，HE)染色观察小鼠肺、肝和肠道的病理改变；采用糖原过碘酸-雪夫(periodic acid-Schiff，PAS)染色评估肠道黏膜屏障完整性，免疫组织化学染色检测黏蛋白2(mucin 2，MUC2)的表达情况；采集小鼠血液检测肝肾功能；采用微计算机断层扫描(micro-computed tomography，micro-CT)检测小鼠股骨骨量，免疫组织化学染色进行骨钙素(osteocalcin，OCN)染色来检测成骨细胞数目，抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP)染色检测破骨细胞数目；采用流式细胞术检测小鼠骨髓中免疫细胞的比例。 结果 在暴露第10天，ED组和LDS组小鼠体重增长减缓，第22天和第28天时ED组和LDS组小鼠体重均明显低于PBS组(均P<0.05)。16S rRNA测序结果显示，在暴露第7天，LDS组小鼠粪便微生物物种丰富度和多样性均高于PBS组；与PBS组和ED组相比，LDS组小鼠粪便中脱铁杆菌门、脱硫弧菌门、弯曲菌门相对丰度升高，厚壁菌门相对丰度降低，其中盲肠螺杆菌的比例升高，约氏乳杆菌和鼠乳杆菌的比例降低。结肠HE与PAS染色结果显示LDS组黏膜结构破坏和杯状细胞减少更为严重；此外，免疫组化结果显示其MUC2表达也显著下调(P<0.05)。3组小鼠的肝脏HE染色结果均未见明显病理改变，且均无明显肝肾功能损伤。ED组和LDS组肺HE染色结果显示肺血管周围炎症细胞浸润增多。Real-time RT-PCR结果显示LDS组小鼠肺组织和肠道的炎症因子表达水平相较PBS组明显升高。Micro-CT结果显示，在暴露第28天，ED组和LDS组小鼠骨量较PBS组明显减低。免疫组织化学染色结果显示，ED组和LDS组小鼠成骨细胞减少，破骨细胞增加。流式细胞术结果显示LDS暴露第7天和第28天骨髓中巨噬细胞的比例较PBS组均明显降低(均P<0.05)。 结论 LDS可引起肠道有益菌丢失和有害菌增加、肠道屏障损伤，以及肺部炎症反应、骨量丢失和骨髓免疫失衡。因此，在未来的月球任务中，应高度重视LD对健康的潜在危害；靶向补充有益菌以预防LD暴露所致的健康危害，或可成为一种具有应用前景的干预策略。

Abstract

Objective As early as the Apollo 11 mission, astronauts experienced ocular, skin, and upper airway irritation after lunar dust (LD) was brought into the return cabin, drawing attention to its potential biological toxicity. However, the biological effects of LD exposure through the digestive system remain poorly understood. This study aimed to evaluate the impact of digestive exposure to lunar dust simulant (LDS) on gut microbiota and on the intestine, liver, kidney, lung, and bone in mice. Methods Eight-week-old female C57BL/6J mice were used. LDS was used as a substitute for lunar dust, and Shaanxi loess was used as Earth dust (ED). Mice were randomly divided into a phosphate buffered saline (PBS) group, an ED group (500 mg/kg), and a LDS group (500 mg/kg), with assessments at days 7, 14, and 28. Mice were gavaged once every 3 days, with body weight recorded before each gavage. At sacrifice, fecal samples were analyzed by 16S ribosomal RNA (rRNA) sequencing; inflammatory cytokine expression [interleukin (IL)-1β, IL-6, and tumor necrosis factor alpha (TNF-α)] in intestinal, liver, and lung tissues was measured by real-time reverse transcription PCR (real-time RT-PCR); hematoxylin and eosin (HE) staining was performed on lung, liver, and intestinal tissues; Periodic acid-Schiff (PAS) staining was used to assess the integrity of the intestinal mucus barrier, and immunohistochemical staining was performed to evaluate the expression of mucin-2 (MUC2). Serum biochemical tests assessed hepatic and renal function. Femoral bone mass was analyzed by micro-computed tomography (micro-CT); osteoblasts and osteoclasts were assessed by osteocalcin (OCN) and tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) staining. Bone marrow immune cell subsets were analyzed by flow cytometry. Results At day 10, weight gain was slowed in ED and LDS groups. At days 22 and 28, body weight in both ED and LDS groups was significantly lower than controls (both P<0.05). LDS exposure increased microbial species richness and diversity at day 7. Compared with the PBS and ED groups, mice in the LDS group showed increased relative abundance of Deferribacterota, Desulfobacterota, and Campylobacterota, and decreased Firmicutes, with increased Helicobacter typhlonius and reduced Lactobacillus johnsonii and Lactobacillusmurinus. HE and PAS staining of the colon showed that mucosal structural disruption and goblet cell loss were more severe in the LDS group. In addition, immunohistochemistry revealed a significant downregulation of MUC2 expression in this group (P<0.05). No obvious pathological alterations were observed in liver HE staining among the 3 groups, and none of the groups exhibited notable hepatic or renal dysfunction. HE staining of the lungs in the ED and LDS groups showed increased perivascular inflammatory cell infiltration (both P<0.05). Conclusion LDS exposure via the digestive route induces gut dysbiosis, intestinal barrier disruption, pulmonary inflammation, bone loss, and bone marrow immune imbalance. These findings indicate that LD exposure poses potential health risks during future lunar missions. Targeted restoration of beneficial gut microbiota may represent a promising strategy to mitigate LD-related health hazards.

Graphical abstract

关键词

探月工程 / 月尘模拟物 / 肠道菌群 / 肠道屏障 / 骨质疏松 / 肺炎

Key words

lunar exploration / lunar dust simulant / gut microbiota / intestinal barrier / osteoporosis / pneumonia

导 读

月球作为距离地球最近的天然天体，以其特殊的空间位置和战略资源储备在宇宙探索中占据关键地位。然而，月球的极端环境不容忽视，几乎整个月球表面均覆盖着由岩石碎屑、矿物粉末、角砾及熔融玻璃等组成的月尘^[1-2]。与月尘不同，地尘(Earth dust，ED)由风化、降水和生物作用等地球过程塑造而成，富含有机质与黏结矿物，粒径较大，表面圆润且吸湿，静电效应低，并因地球大气层的保护而免受太阳粒子和陨石的撞击；而月尘的形成源于陨石小天体撞击的机械破碎作用，并经历太阳风粒子植入、宇宙射线轰击及昼夜剧烈温差导致的热胀冷缩等过程的持续改造^[3]。这一演化机制使其具备尖锐棱角、强静电吸附性及高化学活性等特性^[4]。月尘的静电吸附性使其能附着在航天服表面，带入舱内会重新形成气溶胶^[5]。因此，无论是对月工程开采还是基地建设，月尘暴露的防控都是一大挑战。

尽管已有研究表明月尘呼吸系统暴露能够引起肺炎^[6-8]和肺纤维化^[9]，将细胞直接暴露于月尘能造成DNA、线粒体和溶酶体的损伤^[10-11]，但尚缺乏对月尘消化系统暴露的研究。月尘难以避免会进入与外界直接相通的消化道，这很可能对健康产生危害。

皮肤、肠道、呼吸道和泌尿生殖道均有大量的微生物定植，而肠道是定植最密集和最广泛的器官。许多研究已证实肠道菌群能调节多器官稳态，嗜黏蛋白阿克曼菌(Akkermansia muciniphila)能够维持骨代谢平衡^[12]，动物乳杆菌(Lactobacillus animalis)能够通过释放胞外囊泡保护股骨头^[13]，约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)能抑制溃疡性结肠炎和直肠癌的发生^[14-15]。肠道菌群稳态是维持肠道屏障功能的关键，而肠道屏障的完整性不仅对维持肠道健康至关重要，还与多器官疾病的发展紧密相关，例如鼠李糖乳杆菌HL-200(Lactobacillus rhamnosus HL-200)能够维持肠道屏障功能以改善肥胖和糖尿病模型小鼠的代谢^[16]。丁酸梭菌(Clostridium butyricum)能通过改善肠道黏膜通透性来缓解炎症性抑郁症^[17]。月尘的消化系统暴露很有可能改变肠道菌群组成，并破坏肠道屏障功能，造成多脏器的炎症和损伤。本项研究采用月尘模拟物(lunar dust simulant，LDS)，通过灌胃模拟消化系统暴露，结合16S核糖体RNA(ribosomal RNA，rRNA)测序、流式细胞术和病理组织学等方法评估LDS消化系统暴露对小鼠肠道菌群、肠道、肝、肾、肺和骨骼产生的影响，以期为月球工程活动引发的月尘暴露风险防控提供一定的实验依据。

1 材料与方法

1.1 伦理声明

本研究所有动物实验操作遵循相关伦理规范并已获得中南大学湘雅医院实验动物伦理委员会批准[审批号：动物伦审(202505068)]。

1.2 材料

1.2.1 动物

8周龄雌性无特定病原体(specific pathogen free，SPF)级C57BL/6J小鼠购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司[许可证号：SCXK(湘)2021-0002]，体重为16~18 g，饲养于温度(22±2) ℃、湿度40%~60%的SPF级环境中。

1.2.2 ED和LDS

ED(GBW07408土壤成分分析标准物质)购自中国计量科学研究院，采样地区为陕西省洛川县，样品性质为黄土高原土壤，原样晾干、去除杂物，经球磨、粗筛后，使用高铝瓷球磨机球磨1~ 2 h，过20目尼龙筛后混匀，于105 ℃烘24 h，再用球磨机细碎至粒径小于0.075 μm占99%以上。分装、密封后置于25 ℃环境中避光保存。

LDS(SimulTek Research SC-080)购自加拿大SimulTek公司，主要成分参考阿波罗16号月球样本，与真实月球高地风化层具有相似的矿物组成、化学成分、颗粒粒度、机械强度、孔隙度和密度等物理特性，但不具有纳米铁、活性自由基、太阳风辐射改造和表面风化等特性。未压缩体积为1.27 g/cm²，粒径范围为<0.04~1 000 μm(中位粒径为51 μm)；休止角(10 g样本)为47.0°，休止角(250 g样本)为39.5°，黏聚力为0.311 kPa，内摩擦角为31.49°。矿物组成(质量分数)：斜长岩为74.4%，富玻璃玄武岩为24.7%，钛铁矿为0.4%，辉石为0.3%，橄榄石为0.2%。

ED和LDS的主要成分见表1。

1.2.3 主要试剂和仪器

叔戊醇购自上海易恩化学技术有限公司；兔抗小鼠骨钙素(osteocalcin，OCN)抗体、抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP)染色试剂盒、4%多聚甲醛、辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)标记的山羊抗兔二抗、苏木精染液、伊红染液、磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)粉末、柠檬酸钠粉末、脱钙液、焦碳酸二乙酯(diethyl pyrocarbonate，DEPC)水均购自武汉赛维尔生物科技有限公司；二氨基联苯胺(diaminobenzidine，DAB)显色液购自北京中杉金桥生物技术有限公司；甲基绿染色液、糖原过碘酸-雪夫染色(periodic acid-Schiff，PAS)染色试剂盒、曲拉通(Triton)X-100均购自北京索莱宝科技有限公司；兔抗小鼠黏蛋白2(mucin 2，MUC2)购自武汉三鹰生物技术有限公司；CD16/CD32封闭抗体、别藻蓝蛋白(allophycocyanin，APC)/Cyanine7标记的抗CD45抗体、藻红蛋白(P-phycoerythrin，PE)/多甲藻素-叶绿素-蛋白质复合物-Cy5.5串联染料(peridinin-chlorophyll-protein complex-cyanine dye，PerCP-Cy5.5)标记的抗小鼠Ly-6C抗体、异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)标记的抗小鼠CD11b抗体、藻红蛋白/Cyanine7标记的抗小鼠Ly-6G抗体(Ly6G-PE-Cy7)及AF647标记的抗小鼠F4/80抗体均购自美国BioLegend公司；牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)购自北京赛澳美细胞技术有限公司；通用性抗体稀释液购自苏州新赛美生物科技有限公司；甲醇、二甲苯和中性树胶均购自国药集团化学试剂有限公司；无水乙醇购自天津市恒兴化学试剂制造有限公司；三溴乙醇、异丙醇均购自上海麦克林生化科技股份有限公司；粪便基因组DNA提取试剂盒购自北京天根生化科技有限公司。

实时反转录聚合酶链反应(real-time reverse transcription PCR，real-time RT-PCR)仪为美国Thermo Fisher Scientific公司产品；流式细胞仪为美国Becton Dickinson公司产品；微计算机断层扫描(micro-computed tomography，micro-CT)为瑞士SCANCO Medical公司VivaCT 80；电泳仪器为北京博美富鑫科技有限公司产品。

1.3 方法

1.3.1 消化系统暴露

将小鼠适应性饲养1周后随机分为对照组(PBS组)、ED组、LDS组。将ED和LDS分别溶于无菌PBS，每次灌胃前称量小鼠体重，ED组和LDS组小鼠按照500 mg/kg的剂量灌胃，PBS组灌入等量无菌PBS，每3 d灌胃1次，分别于第7、14、28天终止，详见图1。

1.3.2 动物取材

腹腔注射2.5%三溴乙醇(100 μL/10 g)麻醉小鼠后，经眼眶取血并处死小鼠，取小鼠肺、肝、肠道，一半经液氮速冻后保存于-80 ℃冰箱，用于提取RNA；另一半固定于4%多聚甲醛，48 h后进行脱水、石蜡包埋和切片。取骨组织固定48 h后进行micro-CT扫描，经脱钙液脱钙7 d后进行脱水、石蜡包埋和切片。

1.3.3 Micro-CT分析

去除小鼠股骨周围软组织后置于4%多聚甲醛中固定48 h。使用SCANCO Medical vivaCT80进行扫描，设置电压55 kV，电流145 µA，分辨率为每像素11.4 μm。分别使用NRecon、CTAn和CTVol v2.2进行图片重建、数据分析和图像三维重构。股骨选取骨骺生长板以上0.45 ~0.90 mm区域，分析松质骨骨体积分数(trabecular bone volume per tissue volume，Tb.BV/TV)、骨小梁厚度(trabecular thickness，Tb.Th)、骨小梁数目(trabecular number，Tb.N)和骨小梁间距(trabecular separation，Tb.Sp)。

1.3.4 苏木精-伊红染色

将石蜡切片放入65 ℃烤箱中烘烤2 h后进行脱蜡复水，石蜡切片浸入二甲苯3缸，每缸30 min；无水乙醇2缸，每缸5 min；梯度乙醇4缸，每缸5 min；PBS 3缸，每缸5 min。苏木精染色4 min，水洗3次，分化3 s，水洗3次，返蓝5 s，水洗3次，75%乙醇 4 min，85%乙醇4 min，95%乙醇4 min，伊红染色 3 min；无水乙醇3缸，每缸4 min；待切片风干后，用中性树胶封片。

1.3.5 免疫组织化学染色

将脱蜡水化后的切片放入95 ℃柠檬酸溶液，低火修复10 min后室温下自然放凉；PBS洗3遍后破膜液(0.3% Triton X-100)破膜15 min；3%过氧化氢室温封闭25 min；10% BSA室温封闭1 h，加入一抗(MUC2，1꞉600；OCN，1꞉200)，于4 ℃孵育过夜；次日将切片复温后，加入二抗，在室温下孵育1 h。DAB显色后苏木精复染，自然风干后中性树胶封片。使用图像分析软件Image-Pro Plus对免疫组织化学染色图片进行定量分析。

1.3.6 PAS染色

结肠组织石蜡切片经常规脱蜡水化后，滴加氧化剂氧化5 min；自来水冲洗5 min，纯水漂洗2次；避光条件下滴加Schiff染液孵育30 min，自来水冲洗10 min；苏木精染核2 min，自来水冲洗3次，分化液处理5 s后冲洗，返蓝液处理5 s并冲洗；依次经70%、80%、90%乙醇梯度脱水(各4 min)，晾干后中性树脂封片。染色结果经白光显微镜观察并扫描记录。

1.3.7 Real-time RT-PCR

取出冻存的组织置于冰上融化，用眼科剪修剪组织至豌豆粒大小后放入1.5 mL EP管中，加入2颗3 mm研磨珠和1 mL TRIzol后，用组织研磨仪进行研磨(4 ℃、70 Hz、180 s)；研磨结束后加入200 μL三氯甲烷，振荡混匀，于4 ℃下12 000 r/min离心15 min。取400 μL上层水相转入新离心管中，加入400 μL异丙醇，振荡混匀，室温静置10 min后于4 ℃下12 000 r/min离心15 min，底部白色沉淀即为RNA。用DEPC水配制的75%乙醇清洗RNA沉淀并离心2次，室温晾干后用40 μL的DEPC水溶解RNA沉淀，采用酶标仪检测RNA浓度、纯度。按照反转录试剂盒说明书操作制备互补DNA(complementary DNA，cDNA)，取1 000 ng RNA加入反转录反应体系进行反转录。反应结束后，加入80 μL无酶水稀释cDNA。按照反转录PCR(reverse transcription PCR，RT-PCR)试剂的说明书配置反应体系，所用引物序列见表2，使用2^-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达水平。

1.3.8 TRAP染色

组织石蜡切片经常规脱蜡水化后，按TRAP染色试剂盒说明书配制TRAP染液：取50 μL副品红溶液与50 μL亚硝酸钠溶液在洁净离心管中混匀，得到六偶氮副品红溶液；向100 μL六偶氮副品红溶液中加入100 μL AS-BI磷酸盐底物溶液，吹吸数次充分混匀；加入1.8 mL反应缓冲液混合液中充分混匀，经0.45 μm过滤器过滤得到TRAP工作液；组织上滴加染液，于37 ℃孵育15 min；自来水冲洗3次，甲基绿染核4 min后冲洗，晾干后中性树脂封片。染色结果经白光显微镜观察并扫描记录。

1.3.9 流式细胞术

取小鼠左侧胫骨，以无菌PBS冲洗骨髓腔获得细胞悬液，于4 ℃下5 000 r/min离心5 min后弃去上清液；加入500 μL红细胞裂解液混匀，静置5 min后同条件离心清洗。CD16/CD32抗体封闭20 min后，细胞悬液中加入髓系细胞分型混合抗体(CD45-APC-Cy7/Ly6C-PerCP-Cy5.5/CD11b-FITC/Ly6G-PE-Cy7/F4/80-AF647)，避光孵育45 min。PBS清洗后以含1% BSA的PBS 200 μL重悬，冰上避光待检。

1.3.10 16S rRNA测序

取小鼠粪便1~2粒放入1.5 mL离心管中，经液氮速冻后转移至-80 ℃保存，委托北京百迈客生物科技有限公司进行16S rRNA测序。使用TGuide S96磁珠法粪便基因组DNA提取试剂盒提取DNA，使用微生物群落多样性引物(表3)对目标区域进行扩增，构建文库后采用Illumina Novaseq 6000平台进行测序，原始数据经Trimmomatic过滤、Cutadapt去引物、USEARCH拼接并去除嵌合体，获得高质量序列；并进行操作分类单元(operational taxonomic units，OTU)聚类分析，扩增子序列变体(amplicon sequence variants，ASV)分析，计算Chao1、Ace、Shannon-Wiener、Simpson及系统发育多样性等Alpha多样性指数，进行主成分分析(principal component analysis，PCA)、主坐标分析(principal coordinate analysis，PCoA)及环境因子与样本组成相关性分析(redundancy analysis/canonical correspondence analysis，RDA/CCA)。

1.4 统计学处理

使用GraphPad Prism 10.6.0软件进行统计分析及绘图。数据均以均数±标准差表示。在进行参数检验前，通过鲁棒回归和异常值检测(robust regression and outlier removal，ROUT)方法对异常值进行检验，Q值设定为1%，确定为异常值的数据不纳入后续的统计分析。多组间的单变量比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)。对于涉及2个自变量(如不同处理在多个时间点的比较)的分析则采用双因素方差分析(two-way ANOVA)。若方差分析结果具有统计学意义，则进一步采用Tukey多重比较检验进行所有组间的两两比较。所有统计检验均为双尾检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 小鼠ED、LDS暴露后体重减轻

在ED、LDS暴露的第10天，ED组和LDS组小鼠的体重增长减缓，第16天时ED组体重明显低于PBS组(P<0.05)，第22天和第28天时ED组和LDS组体重均明显低于PBS组(均P<0.05，图2)。

2.2 ED、LDS暴露改变肠道微生物多样性和组成

16S rRNA测序结果显示：消化系统暴露于ED或LDS 7 d就能引起小鼠肠道微生物组成的改变。韦恩图(图3A)显示：PBS组、ED组与LDS组存在一定数量的共同核心微生物群，同时各自具有特有微生物群，其中LDS组特有微生物群数量较多。在α多样性方面，PD_whole_tree(图3B)、Simpson(图3C)和Shannon(图3D)指数的评估结果显示：LDS组α多样性有增加的趋势；LDS组的PD_whole_tree指数较PBS组显著升高(33.319±3.262 vs 23.291±2.434，P<0.05；图3B)；LDS组小鼠粪便微生物的Simpson和Shannon指数(分别为0.938±0.011和5.377±0.229)均高于PBS组(分别为0.904±0.014和4.858±0.246)和ED组(0.925±0.006和4.976±0.148)，但差异均无统计学意义(均P>0.05)。

PCoA分析结果显示：PBS组、ED组与LDS组之间的样本在坐标图中呈现明显分离(图3E~3G)；其中，LDS组样本主要分布于PC1轴的右侧，而PBS组和ED组样本主要聚集于左侧，PC1和PC2分别解释了菌群差异的16.69%和11.85%的变异(图3E)。在门一级水平上，LDS组小鼠粪便中脱铁杆菌门(Deferribacterota)、脱硫弧菌门(Desulfobacterota)、弯曲菌门(Campylobacterota)相对丰度升高，厚壁菌门(Firmicutes)相对丰度降低(图3H)。在种一级水平上，与PBS组和ED组比较，LDS组小鼠粪便中盲肠螺杆菌(Helicobacter typhlonius)相对丰度均升高，而约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)和鼠乳杆菌(Ligilactobacillus murinus)相对丰度均降低(图3I)。

2.3 LDS暴露破坏肠道屏障并引发炎性损伤

在暴露第14天和第28天，苏木精-伊红(hematoxylin and eosin，HE)染色结果显示：小鼠肠道组织出现明显的炎症细胞浸润和杯状细胞丢失(图4A)。进一步通过组织学评分发现，第14天和第28天后LDS组小鼠肠道损伤评分均显著高于PBS组(均P<0.01)，且第28天后LDS组小鼠肠道损伤评分高于ED组(P<0.05，图4D)。PAS染色结果显示：LDS暴露后相较于PBS组肠道杯状细胞减少(P<0.05，图4B、4E)。MUC2免疫组织化学染色结果显示：LDS组的MUC2蛋白表达水平在第14天和第28天均显著低于PBS组(均P<0.05，图4C、4F)。

Real-time RT-PCR结果显示：在暴露第14天各组间炎症因子水平差异无统计学意义(P>0.05，图4G)；而在暴露第28天，LDS组小鼠的结肠炎症水平明显升高，白细胞介素(interleukin，IL)-1β、IL-6和肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α的mRNA表达水平均明显高于PBS组(均P<0.05)，其中IL-1β和IL-6的表达水平均明显高于ED组(均P<0.05)，而ED组与PBS组间差异无统计学意义(P>0.05，图4H)。

2.4 ED、LDS暴露后肝和肾功能无明显改变

HE染色结果显示：在暴露第14天和第28天，ED组和LDS组小鼠肝组织整体结构仍较为完整，肝小叶排列规则，中央静脉清晰，未见广泛性坏死或实质性结构破坏。然而，部分肝细胞可见轻度气球样变，表现为细胞体积增大、胞质疏松透明，且胞质内空泡数量较PBS组略有增加，但未观察到炎症细胞浸润、肝窦扩张或纤维化等改变(图5A、5B)。

为进一步评估肝和肾功能，采集小鼠血清进行生化指标检测，结果显示：在第7、14和28天，ED组和LDS组小鼠的丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase，ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase，AST)、总胆红素(total bilirubin，TBIL)及白蛋白(albumin，ALB)等肝功能指标均未出现明显改变(图5C~5J)。

Real-time RT-PCR结果显示：除第14天ED组小鼠肝TNF-α的mRNA水平明显降低外(P<0.05，图5L)，在暴露第14天和第28天，ED组和LDS组小鼠肝炎症水平与PBS组相比，差异均无统计学意义(均P>0.05，图5K、5L)。

同时，肾功能结果显示在暴露第7、14和28天，各组小鼠间的差异无统计学意义(均P>0.05；附图1，https://doi.org/10. 57760/sciencedb.xbyxb.00128)。

2.5 ED、LDS暴露后引起肺部炎症反应

HE染色结果显示：在ED和LDS暴露第14天，小鼠气道周围出现炎症细胞浸润，气道壁增厚(图6A)；随着暴露时间延长至28 d，炎症细胞浸润范围进一步扩大，血管周围及支气管周围出现大量淋巴细胞、单核细胞聚集(图6B)。

Real-time RT-PCR结果显示：在暴露第14天，LDS组小鼠肺组织IL-1β和 TNF-α的mRNA表达水平均显著高于PBS组(均P<0.01，图6C、6E)，且TNF-α(P<0.001，图6E)的表达水平显著高于ED组(P<0.001，图6E)；在暴露第28天，LDS组小鼠肺组织IL-1β(图6F)、IL-6(图6G)和TNF-α(图6H)的mRNA表达水平虽有上升，但与PBS组的差异均无统计学意义(均P>0.05)。

2.6 ED、LDS暴露导致骨量丢失

在暴露第28天，对各组小鼠股骨进行三维重建(图7A)，micro-CT分析结果显示：ED组和LDS组小鼠Tb. BV/TV、Tb. N较PBS组均显著降低(均P<0.01，图7B、7D)，Tb. Th、Tb. Sp、Ct. Th的差异均无统计学意义(均P>0.05，图7C、7E、7F)。

免疫组织化学染色结果显示：在ED或LDS暴露第28天后，小鼠OCN染色阳性成骨细胞数量较PBS组显著降低(P<0.001，图7G、7H)；小鼠TRAP阳性破骨细胞数量显著高于PBS组(P<0.001，图7I、7J)。

2.7 ED、LDS暴露引起骨髓免疫细胞组成改变

流式细胞术结果显示：暴露于ED或LDS均可引起骨髓免疫细胞比例变化。在LDS暴露第28天，CD3⁺T细胞比例显著低于PBS组(P<0.05，图8A)，同时LDS组与ED组的CD8⁺ T细胞比例均显著降低(均 P<0.05，图8C)，而CD4⁺ T细胞比例在LDS或ED暴露后均未发生明显改变(图8B)。在髓系细胞方面，第28天时ED组和LDS组CD11b⁺细胞比例较PBS组均显著上升(均P<0.01，图8D)。对于巨噬细胞，在暴露第7天时ED组与LDS组比例均较PBS组显著降低(均P<0.05)，其中LDS组较ED组下降更为显著(P<0.01，图8E)；至第28天时，ED组和LDS组的巨噬细胞比例仍然低于PBS组(均P<0.001，图8E)。此外，第28天时ED组单核细胞比例较PBS组和LDS组均显著升高(均P<0.01，图8F)。相比之下，第14天时，LDS组和ED组骨髓免疫细胞比例与PBS组间的差异均无统计学意义(图8A~8G)。

综上，ED与LDS暴露均可在第7天及第28天引起除中性粒细胞外的骨髓免疫细胞比例发生显著变化，而在暴露第14天时未见显著差异。

3 讨 论

随着深空探索计划的不断推进，月球成为未来资源开发和空间基地建设的战略要地。然而，月球表面所覆盖的大量松散的月尘可能对人体健康构成威胁。为明确月尘经消化系统暴露造成的毒性，本研究首次评估了LDS灌胃对小鼠肠道菌群、肠道、肺、肝、骨及骨髓免疫所造成的影响。结果显示：ED组和LDS组小鼠体重增长减缓，LDS组肠道菌群α多样性升高，伴随有害菌相对丰度上升，有益菌相对丰度下降；同时，LDS组小鼠肺部炎症加重，结肠结构受损，杯状细胞减少，MUC2表达下调；ED组和LDS组小鼠骨量减少，成骨细胞减少而破骨细胞增加；LDS会导致骨髓巨噬细胞比例下降。上述结果表明，经消化系统暴露的LDS可能通过诱发肠道菌群失衡和系统性炎症反应，进而损害多器官功能。

16S rRNA测序结果显示LDS的消化系统暴露显著改变了小鼠肠道微生物群的多样性与组成。LDS组小鼠肠道微生物α多样性显著升高，这与本研究最初假设LDS会造成肠道细菌减少相反，提示LDS不是单纯地对肠道菌发挥杀伤作用，而是会重塑肠道菌群的组成。在种水平上，LDS暴露后有害菌如盲肠螺杆菌相对丰度升高，而益生菌如约氏乳杆菌和鼠乳杆菌相对丰度明显减少。研究^[18]表明盲肠螺杆菌可通过诱导TNF-α过量生成促进小鼠溃疡性结肠炎。约氏乳杆菌不仅能维持肠道屏障^[19]，还能通过多种途径缓解结肠炎进展^{[14, 20]}，并能逆转慢性肾病和败血症引起的肝损伤^[21-22]。鼠乳杆菌能通过维持肠道屏障降低小鼠高血压^[23]，减轻肠道的缺血再灌注损伤^[24]，还能缓解肺部炎症^[25]，因此LDS消化系统暴露引起的菌群组成能够影响肠外器官稳态，但LDS造成肠道菌群改变是否与肠道屏障以及多脏器损伤有直接关联，以及补充特定的益生菌能否挽救LDS造成的脏器损伤还有待更深入的研究。

肠道屏障是一个组成复杂且动态的集合体，其负责监视肠道环境并保护宿主免受微生物入侵和有害刺激^[26]。有研究^[27]发现与月尘化学成分相近的火山灰经消化系统暴露能造成小鼠结肠组织水肿并伴黏膜和黏膜下层炎症细胞浸润。本研究发现LDS的消化系统暴露均可导致肠道屏障结构受损、杯状细胞减少、MUC2表达下调以及炎症细胞的浸润，尤其在 LDS暴露 第28天，结肠炎症水平显著升高，提示LDS同样具有破坏肠道屏障完整性的能力，这或许与LDS独特的物理特性和化学组成有关。

LDS颗粒的尖锐棱角能直接造成肠道黏膜的机械损伤，与ED相比LDS还独有TiO₂。有研究^[28]证明TiO₂纳米颗粒的聚集物能够穿过回肠正常上皮和滤泡相关上皮，并改变结肠上皮的旁细胞通透性。TiO₂暴露还能导致特定细菌种群丰度发生变化，并引发肠道功能紊乱，如短链脂肪酸水平下降、杯状细胞和隐窝数量减少、黏液分泌减少，以及肠道炎症生物标志物水平升高^[29]。与ED相比，LDS中CaO和Na₂O含量更高，这些成分在遇水后迅速转化为强碱性的NaOH和Ca(OH)₂，并在与胃酸中和过程中释放大量热量。本研究采用的是LDS的混悬液；然而，在实际暴露情境下，CaO和Na₂O与黏膜直接接触可能会引发剧烈放热反应，并具有较强的腐蚀性。LDS对肠道屏障造成损伤的具体机制是否与其独特的理化性质相关，以及真实月尘对肠道屏障和肠道菌群的影响，仍有待进一步研究。

MUC2黏液层作为肠道的第一道屏障，能阻止有害菌与结肠上皮细胞直接接触，其糖链是可被不同黏膜相关有益细菌降解的营养来源，并能促进微生物群产生维生素和短链脂肪酸等代谢产物，这些代谢物以有益的方式影响着宿主生理功能^[30-31]。有研究^[32]发现在MUC2缺失的情况下，Retnlb基因的表达增加，诱导了抗菌蛋白REG3β的产生并针对有益的乳杆菌属(Lactobacillus spp)发挥杀菌作用，这引起小鼠的自发性结肠炎。因此，杯状细胞及其所分泌的MUC2是维持宿主与有益菌正常共生的关键，LDS独特的理化性质在进入消化道后很可能直接造成了肠道杯状细胞和MUC2屏障的损伤，这进一步引发了肠道菌群的失衡。

除肠道外，LDS和ED暴露均可诱导肺部炎症反应，表现为肺血管周围炎症细胞浸润增加、炎症因子表达升高。多环芳烃暴露诱导的小鼠肺部炎症伴有肠道鼠乳杆菌的丢失，而在补充鼠乳杆菌后能通过色氨酸代谢物和短链脂肪酸调节Th17/Treg失衡以改善小鼠肺炎^[25]，鼻内给予约氏乳杆菌减轻了高压氧诱导的肺损伤和肺部炎症^[33]。因此，乳酸杆菌对于维持呼吸系统的稳态至关重要，在LDS暴露后引起的菌群改变很可能是引起肺部炎症的关键因素。尽管本研究的实验操作人员已熟练掌握灌胃操作，并在过程中有效固定小鼠头部以避免其摆动，但仍无法完全排除部分试剂在灌胃过程中误入气管，或因小鼠呛咳导致误吸的可能性，具体原因仍需通过重复实验和进一步研究加以确认。

月球的重力仅为地球的六分之一，有研究^[34]发现人工模拟的月球重力环境造成了小鼠的骨量丢失，提示未来人类在月球长期驻留过程中也可能面临低重力对骨骼健康的不利影响。本研究发现，ED和LDS暴露可导致小鼠骨量减少、成骨细胞活性下降、破骨细胞活性增强。因此，在月球重力环境下，若同时发生月尘经消化道的暴露，可能对骨骼健康产生更显著的不良影响，相关的防治策略仍待探索。

鼠李糖乳杆菌GG(Lactobacillus rhamnosus GG)不仅能通过调节Th17/Treg平衡改善卵巢切除大鼠的骨质疏松^[35]，还能通过代谢产物丁酸诱导骨髓调节性T细胞的增殖，Treg与骨髓CD8⁺ T细胞的相互作用引起骨形成因子Wnt10b的分泌增加，从而促进成骨^[36]；罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)能通过逆转抗生素诱导的菌群失调引起的肠道屏障功能障碍来预防小鼠的骨量丢失^[37]；约氏乳杆菌N6.2(Lactobacillus johnsonii N6.2)产生的磷脂可在骨髓衍生树突状细胞中诱导出类似迁移调节的转录特征^[38]，对接受异基因造血干细胞移植治疗的患者进行自体粪便微生物群移植重建其免疫细胞组成^[39]。因此，骨骼以及骨髓免疫稳态的维持同样受到肠道菌群的调控，特定益生菌的补充或能在一定程度上逆转LDS所致的骨量丢失和免疫失衡。在ED和LDS暴露第28天，与PBS组相比，2组小鼠髓系细胞比例明显升高，而巨噬细胞比例明显下降，这可能是长期暴露引起了骨髓免疫重编程，推动了粒-单系祖细胞向中性粒细胞而非巨噬细胞分化；此外，LDS暴露引发的多器官炎症反应以及破骨细胞数量的增加，提示骨髓中的巨噬细胞发生向其他器官迁移或向破骨细胞分化的过程，这或许能解释骨髓中巨噬细胞比例下降的现象。然而，LDS对成骨细胞、破骨细胞及骨髓免疫细胞群调控的具体机制仍有待进一步深入研究。

值得注意的是，无论从炎症因子表达水平、肝功能指标，还是肝组织学结果来看，ED或LDS的暴露均未引起肝的显著变化。考虑到肝具备强大的再生能力、免疫吞噬功能以及较高的免疫耐受性，在当前实验所设定的暴露剂量和时程条件下，尚不足以诱发明显的肝炎症反应或损伤。未来可通过设置更多的剂量梯度及延长暴露时间，进一步探讨LDS对肝的潜在影响。

根据上述结果推测，LDS进入消化系统后能直接或通过菌群间接造成肠道屏障的损伤，并可能通过“微生物-肠-肺轴”和“微生物-肠-骨轴”进行跨器官调控破坏肠外器官稳态。

本研究仍然存在局限性：1)仅采用了雌鼠构建模型，月尘作为一种新型的环境物质，探索其对全性别机体的毒性也是非常必要的，在今后的研究中会严格考虑性别因素对实验结果带来的影响。2)采用灌胃方式使LDS与消化系统直接接触，因此重点检测了肠道菌群和部分消化器官(如肠道和肝)的改变。研究^[40]已证明吸入LDS能引起肺部炎症，为此本研究也对消化系统暴露LDS小鼠的肺组织进行了评估。鉴于目前尚无研究报道月尘或其模拟物暴露对心脏有直接影响，故本研究未将心脏作为重点评估的靶器官。3)观察到在灌胃过程中ED组与LDS组小鼠体重增长均减缓，为明确暴露是通过抑制摄食还是影响代谢导致体重降低，将在后续研究中监测小鼠的摄食量和饮水量，并利用代谢笼精确评估其能量代谢水平。

尽管本项研究所采用的LDS与真实月球高地风化层具有相似的矿物组成、化学成分和物理特性，但仍不能完全替代真实的月尘，因其不含有纳米铁，也不具备活性自由基、太阳风辐射改造和表面风化等特性，对于极细小LDS颗粒是否能直接进入血液循环造成器官损伤仍有待验证。呼吸系统和消化系统是2个主要的与外界发生直接接触的系统，吸入暴露气态污染物也能导致消化系统损伤。本课题组在后续研究已采用尘土混悬液经气管滴注的方式观察LDS和ED对小鼠呼吸系统的影响，而本研究主要关注LDS经消化系统暴露对小鼠机体的影响，所以仅采用灌胃方式模拟消化系统暴露。这在某种程度上也尽可能避免了LDS通过呼吸系统暴露而对机体产生的影响，未来也将探索和尝试更能模拟真实暴露环境的方式进行研究。最后，本研究重点探讨了LDS可能导致多器官损伤的潜在机制。然而，ED引起的肺部炎症和骨量减少是否与肠道菌群紊乱及肠道屏障损伤有关，以及ED与LDS所诱导的机体反应差异是否源于其理化性质的不同，仍有待进一步深入研究与探讨。

综上所述，本研究发现LDS可引起肠道有益菌丢失和有害菌增加、肠道屏障损伤，以及肺部炎症反应、骨量丢失和骨髓免疫失衡。因此，在未来的月球任务中，应高度重视月尘对健康的潜在危害；靶向补充有益菌以预防月尘暴露所致的健康危害，或可成为一种具有应用前景的干预策略。

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基金资助

湖南省科技厅湖湘青年英才项目(2023RC3075)

中南大学中央高校基本科研业务费专项资金(2024ZZTS0887┫。This work was supported by the Science and Technology Innovation Program of Hunan Province ┣2023RC3075)

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