鼠衣原体与混合菌诱导慢性输卵管炎模型的效果评估与混合菌剂量优化

Evaluation of Chlamydia muridarum and mixed bacteria-induced chronic salpingitis models and optimization of mixed bacterial dosage

摘要

目的 慢性输卵管炎是导致女性继发性不孕、输卵管妊娠及慢性盆腔疼痛的重要诱因，其病理特征主要表现为输卵管黏膜粘连、纤毛运动功能障碍及管腔闭锁。由于临床研究受限于人体活检组织获取的困难，建立一种稳定、标准且符合人体病理演变过程的动物模型对探讨慢性输卵管炎发病机制及筛选治疗药物具有重要的学术价值。目前尚缺乏统一明确、成功率高且经济实用的慢性输卵管炎动物模型。本研究旨在评估鼠衣原体(Chlamydia muridarum，CM)与混合菌(mixed bacteria，MB)诱导SD大鼠慢性输卵管炎的效果，并筛选优化MB造模的最佳参数。 方法 本研究分为病原体模型比较和MB剂量效应评估2个阶段。病原体模型比较：选取30只SPF级雌性SD大鼠，随机分为对照(control，CON)组、CM组[接种浓度2×10⁷包涵体形成单位(inclusion forming units，IFU)/mL]和MB组[接种浓度3×10⁹菌落形成单位(colony forming units，CFU)/mL]。采用生殖道接种法造模，采用苏木精-伊红(hematoxylin and eosin，HE)染色及透射电子显微镜(transmission electron microscopy，TEM)分别于造模后第1、7、14、21、28天观察输卵管组织病理形态及上皮纤毛、线粒体等超微结构变化。MB剂量效应评估：选取30只无特定病原体级雌性SD大鼠分为正常组、低浓度MB组(3×10¹⁰ CFU/mL)及高浓度MB组(3×10¹¹ CFU/mL)。采用酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)技术检测造模后第7、14天血清肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-alpha，TNF-α)水平，结合显微镜下的组织形态学评分对炎症程度进行客观的量化评估。 结果 CM组与MB组均成功诱发了典型的慢性输卵管炎表现，光镜下可见输卵管间质水肿、管壁增厚及明显的淋巴细胞和浆细胞浸润。在TEM超微结构下，造模组大鼠表现出极具特征性的细胞器损伤，包括纤毛排列紊乱、大面积倒伏脱落，轴丝结构不清晰，以及细胞质内线粒体显著肿胀、嵴断裂消失甚至出现空泡样变。时效性对比显示，在造模后第7天，MB组表现出比CM组更显著的炎症反应，其特征为中性粒细胞浸润明显增多。剂量效应分析显示，在造模后第14天，高浓度MB组大鼠血清TNF-α水平显著升高(P<0.01)，且输卵管组织损伤程度加剧，呈现出典型的慢性炎症改变。 结论 CM模型和MB模型均能有效模拟人类慢性输卵管炎从急性炎症反应向慢性纤维化演变的完整病理过程，且2种模型均具有较高的成功率。然而CM模型的病原体培养条件苛刻，购买及维护成本较高，实验周期较长。相比之下，MB模型所采用的混合菌菌株获取便捷、制备成本低廉，且在3×10¹¹ CFU/mL这一特定浓度下构建的MB方案，不仅能够稳定诱导大鼠产生符合慢性炎症标准的形态学改变，而且其炎症因子的表达具有良好的可量化性与可重复性，为慢性输卵管炎的基础研究、临床药物筛选及转化医学研究提供了具有重要学术价值的标准实验载体。

Abstract

Objective Chronic salpingitis is an important cause of secondary infertility, tubal pregnancy, and chronic pelvic pain in women. Its pathological characteristics mainly include adhesion of the tubal mucosa, impaired ciliary motility, and luminal occlusion. Due to the difficulty in obtaining human biopsy tissues, establishing a stable, standardized animal model consistent with the pathological progression in humans is of great academic significance for investigating the pathogenesis of chronic salpingitis and screening therapeutic drugs. Currently, there is still a lack of unified, reliable, and cost-effective animal model for chronic salpingitis. This study aims to evaluate the effects of Chlamydia muridarum (CM) and mixed bacteria (MB) in inducing chronic salpingitis in SD rats and to optimize the parameters for MB modeling. Methods The study consisted of 2 stages: pathogen model comparison and MB dose-effect evaluation. For pathogen model comparison, 30 SPF female SD rats were randomly divided into a control (CON) group, a CM group [inoculation concentration 2×107 inclusion forming units (IFU)/mL], and an MB group [inoculation concentration 3×10⁹ colony forming units (CFU)/mL]. A reproductive tract inoculation method was used to establish the model. Hematoxylin-eosin (HE) staining and transmission electron microscopy (TEM) were performed on days 1, 7, 14, 21, and 28 after modeling to observe pathological morphology of the fallopian tube and ultrastructural changes in epithelial cilia and mitochondria. For MB dose-effect evaluation, 30 specific pathogen free female SD rats were divided into a normal group, a low-dose MB group (3×10¹⁰ CFU/mL), and a high-dose MB group (3×10¹¹ CFU/mL). Serum tumor necrosis factor-α (TNF-α) levels were measured on days 7 and 14 after modeling using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Combined with histomorphological scoring under microscopy, inflammation severity was quantitatively evaluated. Results Both the CM group and MB group successfully induced typical manifestations of chronic salpingitis. Light microscopy showed interstitial edema of the fallopian tube, thickening of the tubal wall, and marked infiltration of lymphocytes and plasma cells. Under TEM, rats in the modeling groups exhibited characteristic organelle damage, including disordered ciliary arrangement, extensive ciliary collapse and shedding, indistinct axoneme structure, and significant mitochondrial swelling with cristae disruption or disappearance and vacuolar degeneration in the cytoplasm. Time-course comparison showed that on day 7 after modeling, the MB group exhibited a more pronounced inflammatory response than the CM group, characterized by increased neutrophil infiltration. Dose-effect analysis demonstrated that on day 14 after modeling, serum TNF-α levels were significantly elevated in the high-dose MB group (P<0.01), accompanied by aggravated fallopian tube tissue damage with typical chronic inflammatory changes. Conclusion Both CM and MB models can effectively simulate the complete pathological process of chronic salpingitis in humans, from acute inflammatory response to chronic fibrosis, with relatively high success rates. However, the CM model requires stringent pathogen culture conditions, higher purchase and maintenance costs, and a longer experimental cycle. In contrast, the MB model uses mixed bacterial strains that are easier to obtain and less costly to prepare. This study confirmed that the MB protocol constructed at a concentration of 3×10¹¹ CFU/mL can stably induce morphological changes consistent with chronic inflammation in rats, and the expression of inflammatory factors shows good quantifiability and reproducibility. This model provides a standardized experimental platform with important academic value for basic research, clinical drug screening, and translational studies of chronic salpingitis.

Graphical abstract

关键词

慢性输卵管炎 / 鼠衣原体 / 混合菌 / 动物模型 / 输卵管纤毛 / 肿瘤坏死因子-α

Key words

chronic salpingitis / Chlamydia muridarum / mixed bacteria / animal model / fallopian tube cilia / tumor necrosis factor-alpha

输卵管炎症性病变指感染性输卵管炎及其他伴有炎症细胞浸润的非肿瘤性病变，可导致严重的后遗症，包括输卵管不孕症和异位妊娠^[1]。输卵管炎性不孕指因输卵管阻塞、粘连等因素导致输卵管通畅异常所引起的不孕，占女性不孕症的25%~35%，而慢性输卵管炎(chronic salpingitis，CS)是其首要病因^[2]。CS反复刺激诱发输卵管黏膜受损，输卵管上皮细胞分泌减少和纤毛活动障碍，其中大量粘连或丢失的纤毛易造成纤毛摆动频率减慢，阻碍卵细胞运输及受精过程^[3]。

目前CS生物性造模常用的病原微生物包括金黄色葡萄球菌、衣原体和混合菌(mixed bacteria，MB；大肠埃希菌꞉金葡菌꞉链球菌为2꞉1꞉1)^[4]。研究^[5]表明，在人类急性输卵管炎和CS中可分离出沙眼衣原体，而MB可复制临床致病菌多样性、符合生殖道逆行感染情况。然而既往研究^[6]较少直接比较鼠衣原体(Chlamydia muridarum，CM)与MB的慢性炎症差异，且尚未确立统一适宜的MB造模浓度。本研究旨在通过对比CM和MB造模后大鼠的一般情况、体重变化、输卵管肉眼观、病理染色和纤毛透射电子显微镜(transmission electron microscopy，TEM)结果，探究2种输卵管炎造模方法在造模成功率、成模速度、炎症反应程度等方面的特点；并进一步设计不同浓度MB的SD大鼠的CS模型，以筛选最佳菌量与持续时间等造模条件，为适宜的菌液浓度提供数据支撑。

1 材料与方法

1.1 伦理声明

本研究已获得成都中医药大学附属医院实验动物伦理委员会批准(审批号：2022DL-002)。

1.2 实验动物

60只无特定病原体级雌性SD大鼠[体重为(200±20) g，6~8周龄]均购自斯贝福生物科技(北京)有限公司，实验动物使用许可证编号为SCXK(京)2019-0010。所有动物于成都中医药大学基础医学院动物实验中心规范饲养，全程维持恒温环境为(22±2) ℃，相对湿度为30%~70%。正式实验前先进行7 d适应性饲养。

1.3 主要试剂与仪器

杜尔贝科改良伊格尔培养基(Dulbecco’s modified Eagle medium，DMEM)购自中国servicebio公司，HeLa细胞、金黄色葡萄球菌、乙型溶血性链球菌均购自北京百欧博伟生物技术公司，冷冻包埋剂购自日本樱花公司，肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-alpha，TNF-α)购自武汉贝莱因生物，二乙氨基乙基葡聚糖(diethylaminoethyl dextran，DEAE)购自美国西格玛公司，CM由课题组提供。

转轮式切片机为德国徕卡产品，自动脱水机为武汉俊杰电子有限公司产品，组织包埋机、病理组织漂烘仪均为常州中威医疗仪器有限公司产品，数字切片扫描仪(Pannoramic250)为匈牙利3D HISTECH公司产品，正置荧光显微镜为日本尼康公司产品，超低温冰箱为青岛海尔股份有限公司产品，恒温磁力搅拌器为上海司乐仪器有限公司产品。

1.4 方法

1.4.1 细菌混悬液的制备

1.4.1.1 CM的制备

制备菌液由南华大学周洲团队提供，经过标准化HeLa细胞扩大培养后破碎细胞提取使用，将CM菌液稀释为2×10⁷ 包涵体形成单位(inclusion forming units，IFU)/mL。

1.4.1.2 MB混悬液制备

MB混悬液参考赵广兴等^[7]的“MB接种法”并加以改进。首先，将大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌与乙型溶血性链球菌的冻存原菌液于37 ℃的鲁里亚-伯塔尼(Luria-Bertani broth，LB)液体培养基中复苏，并扩大培养至对数生长期。随后，采用麦氏比浊法分别测定并调整各原菌液浓度至1×10⁸菌落形成单位(colony forming units，CFU)/mL。最后，将3种菌液按2꞉1꞉1的体积比混合，获得总浓度为3×10⁹ CFU/mL的母液。通过平板计数法对母液浓度进行验证后，使用不加琼脂且溶剂减半的液体培养基进行倍比稀释，分别制备出3×10¹⁰ CFU/mL与3×10¹¹ CFU/mL的MB工作液以供后续实验使用。

1.4.2 大鼠模型制备及样本采集

1.4.2.1 病原体模型比较

将30只SD雌性大鼠随机分为对照(control，CON)组、CM组和MB组，每组10只。采用3%戊巴比妥钠30 mg/kg麻醉，将麻醉好的大鼠仰卧位固定，腹部备皮后常规消毒，铺巾后于腹部正中做2~3 cm切口，打开腹腔，暴露子宫，沿Y形子宫向上找到双侧输卵管，于子宫角近输卵管处注射，CON组注入生理盐水0.05 mL，CM组注入CM菌液0.05 mL，MB组注入MB菌液0.05 mL。然后，缝合创口，术毕碘伏消毒手术区域，将大鼠置于30 ℃的恒温铺垫上，直至大鼠苏醒。于术后第1、7、14、21、28天随机处死各组中的2只大鼠，取输卵管标本备检。

1.4.2.2 MB剂量效应

将30只SD雌性大鼠随机分为正常组、低浓度MB 7 d组、低浓度MB 14 d组、高浓度MB 7 d组和高浓度MB 14 d组，每组6只。麻醉剖腹暴露双侧输卵管步骤同前，选取子宫角近输卵管处，用1 mL注射器分别取0.1 mL的3×10¹⁰ CFU/mL MB菌液(低浓度MB)、3×10¹¹ CFU/mL MB菌液(高浓度MB)进针，向输卵管－卵巢方向注入双侧输卵管内，缝合腹壁切口。正常组不做处理。术后于第7、14天处死各组的大鼠，取输卵管标本备检。

CM: Chlamydia muridarum; MB: Mixed bacteria; CON: Control; SPF: Specific pathogen free.

1.5 观察及检测指标

1.5.1 大鼠一般情况

结合输卵管炎急慢性进展，造模期间应观察至少4周，约1次/周。观察大鼠的动作情况、精神状态、舌色、爪色、毛发颜色、粪便质地，并做好实验记录。

1.5.2 大鼠体重数据分析

实验过程中，各组大鼠每周进行1次体重测量。

1.5.3 观察解剖形态

肉眼评估输卵管时，重点观察以下病理改变：管壁增粗或变细、弹性减退、管周组织粘连、色泽异常，以及积水或化脓等病变。参考冯子聪等^[8]的方法通过注射亚甲蓝液体观察输卵管通畅情况，距宫角约1 cm处用动脉夹夹闭子宫腔，用含2 mL 5%亚甲蓝溶液的注射器自宫角处向输卵管方向进针，向输卵管内注射，根据液体溢出情况将通畅程度分为通畅、较为通畅、通而不畅、不通。

1.5.4 病理检测指标

处死动物观察，精确切取输卵管，于10%中性甲醛溶液中固定，常规切片，苏木精-伊红(hematoxylin and eosin，HE)染色，光学显微镜下观察记录大鼠子宫和输卵管组织腔壁结构改变、腔上皮细胞增生和炎症细胞浸润等情况，进行病理分级评分(表1)，并求得秩均数。

为观测输卵管组织细胞超微结构，另取样本经4%戊二醛磷酸缓冲液预固定后，以1%锇酸行二次固定，经丙酮梯度脱水、环氧树脂包埋制备超薄切片，最终通过TEM进行观测。

1.5.5 炎症因子分析

在造模后第7、14天，根据说明书方法采用酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)试剂盒检测大鼠血浆TNF-α含量。

实验流程见图1。

1.6 统计学处理

采用SPSS26.0统计学软件进行数据分析。所有数据进行正态性分析，计量资料以均数±标准差表示；多组间比较采用方差分析，多组多个时间点间比较采用重复测量方差分析；组间比较采用Bonferroni检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 病原体模型比较

2.1.1 大鼠一般情况及行为学观察

各组大鼠造模前一般情况良好，实验期间CON组大鼠活泼好动，毛发光亮浓密，舌色正常，大便成形、色味正常。CM组和MB组大鼠在造模后，逐渐表现出行动迟缓、活动减少、喜蜷缩，全身抽动，毛色发黄、皮毛散乱，舌色或深红或紫黯，爪色由淡粉色变为紫红，大便质稀、便中带血、臭味较重。

2.1.2 体重

各组大鼠体重在基线期(造模后1 d)差异无统计学意义(P>0.05)；在造模后第7天，CM组和MB组体重均显著高于CON组(均P<0.01)，表现为急性期的体重应激性增加；在造模后第14天，CON组体重均值虽高于CM组和MB组，但差异均无统计学意义(均P>0.05)；CON组平均体重在整个实验期间呈逐渐上升趋势，而CM组和MB组大鼠的体重涨幅从第7天到第14天均明显小于CON组(表2)。

2.1.3 肉眼观察大体形态

在造模后第1、7、14、21和28天，解剖CON组大鼠，其盆腔内均未观察到异常粘连，且输卵管外观呈现均匀粗细、表面光滑圆润、色泽红润且弹性良好的特点，与周边组织无粘连迹象，未见积水或化脓，通畅度正常。相比之下，CM组大鼠在造模后第7、14、21和28天解剖时，可见输卵管与周围组织发生粘连，外观变得粗糙、色泽苍白，并明显变细，部分样本还观察到积水或积脓现象，个别可见积水或积脓，在造模后第28天观察到输卵管不畅。在造模后第7天解剖MB组大鼠可观察到腹膜存在充血现象，盆腔出现明显的膜性粘连，腹腔可见积液，符合急性盆腔炎改变；同时，双侧输卵管系膜血管显示充血征象，管壁呈现水肿并增粗，提示急性炎症反应；在造模后第14、21、28天，MB组大鼠在解剖后仍可见盆腔膜性粘连，盆腔积液较造模后第7天明显减少，输卵管系膜血管充血，管腔稍增粗、扭曲，内有淡黄色积液；输卵管通畅情况较差，造模后第14、28天可见明显不畅(表3)。

2.1.4 大鼠输卵管病理染色观察

HE染色结果(图2)表明，在造模后第21、28天，CON组大鼠输卵管黏膜层、肌层、浆膜层均未见明显的炎症细胞浸润，组织结构清楚。在造模后第21天，CM组大鼠输卵管黏膜层浸润的炎症细胞开始集中于黏膜层和肌层的交界处，呈长条状弥散分布，并可见少量炎症细胞浸润肌层，平滑肌细胞间可见单个或多个炎症细胞浸润，但浆膜层未累及；在造模后第28天，黏膜皱襞变短、僵硬，管腔稍增大，纤毛变短、少部分脱落，浆膜层血管扩张，未见明显炎症细胞浸润。在造模后第21天，MB组大鼠输卵管组织上皮不连续，大量上皮及固有层内细胞变性坏死，坏死区域及腔内可见大量细胞碎片及大量淋巴细胞或中性粒细胞；在造模后第28天，黏膜层仍可见炎症细胞全层浸润，上皮细胞呈矮柱状。黏膜皱襞僵硬，间质呈现空化现象，管腔显著增大，纤毛已大部分脱落。

输卵管病变程度评分结果(表4)表明，CON组大鼠输卵管组织结构完整，无炎症表现，病理评分均为0。相比之下，各模型组均表现出不同程度的组织病理学改变，且呈现随感染时间延长而进行性加重的趋势。在造模后第21天，CM组大鼠呈现轻至中度病变(评分为1~2)，MB组大鼠则表现为一致的中度病变(评分均为2)，提示存在管壁结构改变及上皮增生。在造模后第28天，病理损伤进一步恶化，CM组大鼠评分进展为中至重度(评分为2~3)，而MB组大鼠所有样本均达到重度感染标准(评分均为3)，表现为显著的输卵管扩张、严重的上皮增生及大量炎症细胞浸润。

2.1.5 纤毛细胞TEM

TEM下观察CON组大鼠输卵管黏膜上皮细胞，其游离端可见密集的纤毛，纤毛内部微管排列典型。细胞核形态饱满，细胞质内富含线粒体且高尔基体发达。上皮细胞呈高柱状，核结构清晰可辨。间质中胶原纤维含量丰富，可见肥大细胞，染色质内分布有大量圆形颗粒(图3)。

CM组大鼠的输卵管组织纤毛、微绒毛排列紊乱，可见不完整的细胞膜，线粒体肿胀、内质网扩张。MB组大鼠的输卵管组织纤毛排列紊乱、断裂，纤毛短小，上皮细胞结构模糊，呈柱状或卵圆形，细胞核形态异常，呈柱状或不规则形，染色深且浓缩；细胞质体积缩减。间质呈现明显水肿及空化现象，同时伴有胶原纤维增生。可见多个自噬溶酶体，线粒体肿胀、内质网扩张(图3)。

2.2 MB剂量效应评估

2.2.1 5组大鼠输卵管形态观察

如图4所示，在正常组中，输卵管管壁结构完整，黏膜柔软，无明显病变；而在模型组，特别是高浓度MB 14 d，输卵管呈现出不同程度的充血、水肿、增粗及与周围组织的粘连，部分个体可见脓性分泌物，提示炎症程度较重。相较而言，低浓度MB 7 d组和高浓度MB 7 d组形态学损伤相对较轻，表现为轻中度的管壁变厚、黏膜松弛，支持炎症累积效应随浓度与时间增强的趋势。

2.2.2 TNF-α含量

所有模型组大鼠的血浆TNF-α水平均显著高于正常组(均P<0.05)。

在同一菌液浓度下，比较不同造模时点的炎症水平发现，高浓度MB 14 d组大鼠的血浆TNF-α水平虽高于高浓度MB 7 d组，但差异无统计学意义(P>0.05)；低浓度MB 14 d组大鼠的血浆TNF-α水平与低浓度MB 7 d组相比，差异无统计学意义(P>0.05)。

在相同造模时间下，比较不同菌液浓度的炎症水平可见，高浓度MB 7 d组TNF-α水平略高于低浓度MB 7 d组，差异无统计学意义(P>0.05)；高浓度MB 14 d组显著高于低浓度MB 14 d组(P<0.01，图5)。

3 讨 论

作为一种常见妇科疾病，CS可造成输卵管壁粘连阻塞，输卵管纤毛排列紊乱、活性降低甚至大量脱落进而增加不孕风险^{[7, 9-10]}，因此建立高效稳定的CS动物模型对于该疾病相关实验研究以及临床治疗具有重要意义。

目前建立动物模型的方法可分为化学性和生物性2种。化学性以苯酚胶浆法为代表，生物性则是通过接种病原微生物来造模^[11]。化学造模与实际情况中因病原体感染致病的发病途径有所差别，故目前使用不如生物造模广泛。研究^[12]表明，输卵管炎的病原体包含沙眼衣原体、大肠杆菌、淋病奈瑟球菌、金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌等，众多学者运用不同致病菌制作输卵管炎性模型。Lyons等^[13]运用沙眼衣原体经阴道感染建立输卵管炎性不孕症小鼠模型。胡喜姣等^[14]使用金黄色葡萄球菌经输卵管注射建模，在术后第7、21天分别形成急性输卵管炎、CS模型，且未造成大鼠死亡。赵广兴等^[7]选用MB菌液经输卵管注射建立CS大鼠模型，在注菌1周内有部分大鼠因急性感染死亡，其余大鼠输卵管可肉眼观察到组织粘连、积水或积脓。相比衣原体通过胞内寄生和免疫逃逸实现的慢性持久感染，混合菌模型更侧重于模拟临床非特异性感染的菌群多样性^[15]。混合菌模型不仅造模成功率高、操作简便，且在病原学构成及感染途径上更贴近人类慢性盆腔炎的实际临床过程^[16]。

虽然每种病原体模型均有一定的实验支撑，但输卵管炎相关课题的造模方法尚未统一，缺乏广泛认可的造模方法评价体系^[17-18]。另外，以往实验较少选择CM和MB作为造模对照，故本次研究选取CM和MB对照进行7、14、21、28 d的比较，验证现有输卵管炎造模方式，比较单一CM和MB对输卵管炎症模型形成的影响。在病原体模型比较实验期间，CM和MB组大鼠模型均可见行动迟缓、活动减少、被毛粗乱无光泽等一般情况，以及输卵管内大量炎症细胞浸润，出现自噬溶酶体，线粒体肿胀、内质网扩张，伴随着纤毛细胞排列紊乱和脱落等病理表现。

当宫腔内接种菌液量保持不变时，菌液浓度对动物感染细菌量具有显著影响。低浓度导致感染困难，高浓度易引发败血症而使动物死亡。因此，为进一步优化MB所致输卵管炎模型的建立条件，MB剂量优化实验在病原体模型比较实验造模成功的基础上设立相同菌种构成的不同剂量感染组，即接种浓度在原有基础上提升至3×10¹⁰ CFU/mL和3×10¹¹ CFU/mL，以探索炎症反应的剂量依赖关系。同时设置了第7天与第14天2个时间点作为解剖观察节点，以明确诱导稳定慢性炎症的最佳浓度与时效窗口，从而为建立标准化模型提供量化依据。

MB剂量优化实验血清TNF-α检测结果显示，所有模型组TNF-α水平均显著高于正常组，提示模型可有效激活促炎因子表达。高浓度MB组在造模后第7天与第14天均表现出较高的炎症水平，其中高浓度MB 14 d组显著高于低浓度MB 14 d组，表明炎症反应对菌液浓度的敏感性；而在相同浓度组内，造模后第7天与第14天大鼠血浆的TNF-α水平差异无统计学意义，提示低浓度感染可能早期即进入炎症平台期，导致时间效应不显著；这反映了低剂量模型的稳定性。综上结果可见，炎症反应对菌液浓度更为敏感，而时间因素的影响则依赖于炎性刺激强度，即在高浓度建模条件下，时间延长可进一步提升炎症水平，而低浓度下炎症反应可能较早进入平台期。形态学观察结果则进一步印证了上述结论，正常组输卵管结构完整，无异常；模型组中则可见不同程度的管壁增厚、水肿、充血及粘连，尤以高浓度MB 14 d组表现最为明显，部分个体可见脓性分泌物，呈现出明显的病理性炎症改变。

作为经典促炎因子^[19]，TNF-α在引发输卵管炎症反应(如白细胞浸润、组织降解)的同时，启动表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)/细胞外信号调控的蛋白激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)信号通路介导纤毛核心转录因子叉头框蛋白J1(forkhead box protein J1，FOXJ1)的磷酸化失活，导致纤毛脱落、加速输卵管黏膜结构的破坏，进而严重损害生育功能^[20]。

然而，本研究尚存在一定的局限性，未来进一步实验中可考虑设立包含亚有效剂量、有效剂量及饱和剂量在内的更多梯度，以描绘完整的剂量－反应曲线；在输卵管纤毛功能检测方面，可加入如膜片钳、冷冻电子断层扫描术等操作以进一步补充完善输卵管功能检测指标。

综上所述，在本研究采用的感染剂量和手术植入途径下，CM和MB这2种致病菌模型均成功诱导了大鼠CS，且未观察到实验动物死亡。相较于衣原体单一感染，MB模型操作简易，更符合临床致病菌多样性的特点。MB剂量优化实验结果表明，提高MB感染剂量至3×10¹¹ CFU/mL能有效增强模型的炎症特征，这不仅有利于观察TNF-α等炎症因子的病理学变化，也为后续药物干预实验选择关键时间窗提供了重要依据。

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基金资助

国家自然科学基金(82205175)

四川省科技厅重点研发项目(2022YFS0415┫。This work was supported by the National Natural Science Foundation ┣82205175)

the Key Research and Development Program of the Science and Technology Department of Sichuan Province(2022YFS0415)