栀子苷通过Hspa1a通路抑制青光眼视网膜细胞凋亡

Geniposide inhibits retinal cell apoptosis induced by glaucoma through the Hspa1a pathway

摘要

目的 青光眼是全球首位不可逆性致盲眼病，降低患者眼内压是目前最有效的治疗手段之一。然而，降低眼内压并不能完全阻止视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells，RGCs)死亡及其导致的视力丧失。中药在青光眼治疗中的应用已得到广泛论证，本研究拟探究栀子苷对视网膜细胞死亡的保护作用，以明确栀子苷在青光眼治疗中的潜在价值。 方法 细胞试验：将视网膜R28细胞分为对照(CTL)组、氧糖剥夺再灌注(oxygen-glucose deprivation/reoxygenation，OGD/R)组、OGD/R+栀子苷(OGD/R+Gen)组、OGD/R+栀子苷+热激蛋白家族A成员1A(heat shock protein family A member 1A，Hspa1a)-小干扰RNA(OGD/R+Gen+H-KD)组。首先采用蛋白质组学技术筛选栀子苷干预后变化的关键分子，继而通过实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real-time PCR，qPCR)和蛋白质印迹法筛选和检测栀子苷和H-KD干预后相关分子变化。然后通过细胞计数试剂盒-8(cell counting kit-8，CCK-8)和乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)试验检测栀子苷和H-KD干预后细胞活力和死亡情况，并采用流式细胞术、活性氧(reactive oxygen species，ROS)检测和原位末端转移酶标记(TdT-mediated dUTP nick-end labeling，TUNEL)染色检测栀子苷和H-KD干预后细胞凋亡情况。动物造模：将SD大鼠分为假手术对照(CTL)组、急性高眼压(acute high intraocular pressure，aHIOP)组、aHIOP+栀子苷(aHIOP+Gen)组、aHIOP+栀子苷+Hspa1a抑制剂apoptozole(aHIOP+Gen+Apo)组，并采用苏木素-伊红(hematoxylin and eosin，HE)染色、TUNEL染色及闪光视网膜电图(flash electroretinogram，fERG)评估各组大鼠的视网膜结构、细胞凋亡和功能变化。 结果 1)蛋白组学技术联合qPCR和蛋白质印迹法筛选出Hspa1a水平在栀子苷干预后明显升高。2)与OGD/R组比较，OGD/R+Gen组细胞活力增强(P<0.05)、死亡细胞减少 (P<0.05)、ROS水平降低(P<0.001)、凋亡细胞数减少(P<0.05)。3)与OGD/R+Gen组比较，OGD/R+Gen+H-KD组p-蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)表达降低(P<0.01)，同时细胞活力降低(P<0.05)、死亡细胞增加(P<0.05)、ROS水平升高(P<0.01)、凋亡细胞数增加(P<0.05)。4)与CTL组比较，aHIOP组视网膜厚度减少(P<0.01)、凋亡细胞数增多(P<0.001)、fERG b波振幅降低(P<0.001)；与aHIOP组比较，aHIOP+Gen组视网膜厚度增加 (P<0.05)、凋亡细胞数减少 (P<0.05)、fERG b波振幅升高(P<0.05)；与aHIOP+Gen组比较，aHIOP+Gen+Apo组视网膜厚度减少(P<0.05)、凋亡细胞数增多(P<0.05)、fERG b波振幅降低(P<0.05)。 结论 栀子苷通过Hspa1a-Akt通路抑制OGD/R及aHIOP诱导的视网膜细胞凋亡与组织损伤，为青光眼的中药治疗提供潜在靶点和新策略。

Abstract

Objective Glaucoma is the leading cause of irreversible blindness worldwide. Reducing intraocular pressure is currently one of the most effective treatment strategies; however, it cannot completely prevent retinal ganglion cells (RGCs) death and the resulting vision loss. Traditional Chinese medicine has been widely investigated in glaucoma treatment. This study aims to determine whether geniposide can effectively inhibit retinal cell death and to explore its potential role in glaucoma therapy. Methods Cell experiments: Retinal R28 cells were divided into a control (CTL) group, an oxygen-glucose deprivation/reoxygenation (OGD/R) group, an OGD/R+geniposide (OGD/R+ Gen) group, and an OGD/R+Gen+heat shock protein family A member 1A (Hspa1a) small interfering RNA (OGD/R+Gen+H-KD) group. Proteomics analysis was first performed to identify key molecules altered after geniposide intervention. Quantitative real-time PCR (qPCR) and Western blotting were used to detect molecular changes after geniposide and H-KD interventions. Cell viability and death were assessed using cell counting kit-8 (CCK-8) and lactate dehydrogenase (LDH) assays. Flow cytometry, reactive oxygen species (ROS) detection, and terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick-end labeling (TUNEL) staining were used to evaluate apoptosis. Animal experiments: SD rats were divided into a sham control (CTL) group, an acute high intraocular pressure (aHIOP) group, an aHIOP+Gen group, and an aHIOP+Gen+Hspa1a inhibitor apoptozole (aHIOP+Gen+Apo) group. Hematoxylin-eosin (HE) staining, TUNEL staining, and flash electroretinogram (fERG) were used to evaluate retinal structure, apoptosis, and functional changes. Results 1) Proteomics combined with qPCR and Western blotting showed that Hspa1a expression was significantly increased after geniposide treatment. 2) Compared with the OGD/R group, the OGD/R+Gen group showed increased cell viability (P<0.05), fewer dead cells (P<0.05), decreased ROS levels (P<0.001), and reduced apoptosis (P<0.05), indicating that geniposide alleviated OGD/R-induced retinal R28 cell injury and death. 3) Compared with the OGD/R+Gen group, the OGD/R+Gen+H-KD group showed decreased phosphorylated protein kinase B (Akt, p-Akt) expression (P<0.01), reduced cell viability (P<0.05), increased cell death (P<0.05), elevated ROS levels (P<0.01), and increased apoptosis (P<0.05), suggesting that Hspa1a regulates the Akt pathway and mediates the protective effect of geniposide on retinal R28 cells. 4) Compared with the CTL group, the aHIOP group showed reduced retinal thickness (P<0.01), increased apoptosis (P<0.001), and decreased fERG b-wave amplitude (P<0.001). Compared with the aHIOP group, the aHIOP+Gen group showed increased retinal thickness (P<0.05), reduced apoptosis (P<0.05), and increased fERG b-wave amplitude (P<0.05). Compared with the aHIOP+Gen group, the aHIOP+Gen+Apo group showed decreased retinal thickness (P<0.05), increased apoptosis (P<0.05), and reduced fERG b-wave amplitude (P<0.05), indicating that geniposide alleviates aHIOP-induced retinal injury through the Hspa1a pathway. Conclusion Geniposide inhibits OGD/R- and aHIOP-induced retinal cell apoptosis and tissue injury through the Hspa1a-Akt pathway, providing a potential therapeutic target for glaucoma treatment.

Graphical abstract

关键词

栀子苷 / 青光眼 / 视网膜神经节细胞 / 氧糖剥夺再灌注 / 细胞凋亡 / Hspa1a通路

Key words

geniposide / glaucoma / retinal ganglion cells / oxygen-glucose deprivation/reoxygenation / apoptosis / Hspa1a pathway

青光眼是以视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells，RGCs)进行性丢失为特征的不可逆致盲眼病，眼压异常升高是引起青光眼的主要因素^[1-2]，即使通过各种手段将患者眼压降至正常水平，但持续的高眼压已造成眼球各部分组织发生不可逆损害，如RGCs的大量凋亡，因此仍有约10%的患者将完全丧失视力，这给人类健康领域和社会经济发展带来了沉重负担^[3-4]。目前主流的青光眼治疗措施为通过手术或药物降眼压，但这些手段未能完全阻止RGCs凋亡。探求高眼压后RGCs的凋亡机制及保护方法，将为挽救青光眼患者受损的视功能提供新的理论支持。

传统中医药在包括青光眼在内的各种疾病中发挥重要的抗炎、抗氧化和抗凋亡等作用，如橙皮素可以通过激活蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)-核因子E2相关因子2(nuclear factor-erythroid 2-related factor 2，Nrf2)信号通路改善高脂饮食诱导的肝脏氧化应激和炎症反应^[5-6]；雷公藤、姜黄素、虾青素和天麻素等中药成分可通过活化Akt-Nrf2信号通路展现出对抗视网缺血再灌注(ischemia-reperfusion，I/R)损伤的潜力^[7-9]；栀子苷可通过激活Akt-Nrf2通路从而降低心肌或脑I/R诱导的组织损伤、减轻糖尿病视网膜病变中的氧化应激等^[10-11]。值得注意的是，有研究^{[6, 12]}指出Akt-Nrf2通路可能参与青光眼疾病进程，并可作为青光眼治疗的靶点。栀子苷是否可通过调控Akt-Nrf2通路进而发挥治疗青光眼的作用目前缺乏报道。

笔者团队前期研究^[13]发现栀子苷可通过激活Akt-Nrf2通路，减少活性氧(reactive oxygen species，ROS)和视网膜细胞凋亡，最终减轻体外培养R28细胞氧糖剥夺再灌注(oxygen-glucose deprivation/re-oxygenation，OGD/R)损伤和大鼠视网膜急性高眼压(acute high intraocular pressure，aHIOP)诱导的细胞凋亡，为青光眼治疗提供了潜在的干预药物和药理机制。鉴于中药分子在青光眼治疗中展现出良好潜力，且具有不良反应少等优势，可在一定程度上弥补西医治疗的不足。本研究拟系统阐明栀子苷在青光眼治疗中的完整分子调控通路，以期为探索青光眼治疗新策略提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 伦理声明

本研究已获得中南大学湘雅二医院实验动物伦理委员会批准(审批号：20250507、Z0422-02)。

1.2 细胞培养及OGD/R损伤模型制备

大鼠源性视网膜R28细胞来源于中南大学湘雅基础医学院人体解剖与神经生物学系，该细胞被广泛用于青光眼基础研究中^[14-15]。R28细胞于5% CO₂细胞培养箱中、37 ℃条件下使用杜氏改良伊格尔培养基(Dulbecco’s modified eagle medium，DMEM)高糖液体培养基(货号：SH30022.01B，购自美国赛默飞世尔科技公司)+10%胎牛血清(货号：10270-106，购自美国赛默飞世尔科技公司)进行培养；待细胞生长至80%融合时，更换为DMEM低糖液体培养基(货号：SH30021.01B，购自美国赛默飞世尔科技公司)，并在1%的低氧条件下损伤2 h，随后将损伤细胞于正常培养条件下培养0、2、4、6或8 h，以建立不同时间点的氧糖剥夺再灌注(oxygen-glucose deprivation/reoxygenation，OGD/R)模型(OGD/R组)。栀子苷干预组(OGD/R+Gen组)则于OGD损伤前30 min，向培养基中加入终浓度为100 μmol/L的栀子苷。

1.3 蛋白质组学测序与生物信息学数据分析

收集OGD/R组与OGD/R+Gen组的R28细胞样本，经液氮速冻研磨破碎后，加入裂解缓冲液进行超声裂解；离心收集上清液并测定蛋白质浓度，将提取的合格蛋白质样本交由深圳华大基因股份有限公司通过DNBSEQ测序平台进行蛋白质组学测序分析。具体流程为：取等量蛋白质样品，经三氯乙酸沉淀、丙酮洗涤后，以四乙基溴化铵复溶，加入胰蛋白酶过夜酶解。酶解产物依次经二硫苏糖醇还原和碘乙酰胺烷基化处理。肽段经NanoElute超高效液相色谱系统分离，流动相A为含0.1%甲酸和2%乙腈的水溶液，流动相B为含0.1%甲酸和100%乙腈的溶液，线性梯度洗脱程序为：0~90 min，B相6%~80%，流速450 nL/min。分离后肽段经Capillary离子源(1.75 kV)电离，在timsTOF Pro质谱中以PASEF模式进行检测。一级与二级质谱均采用高分辨TOF模式，二级扫描范围100~1 700 m/z，动态排除时间设为30 s。

对蛋白质组学测序获得的差异表达蛋白质进行基因本体(Gene Ontology，GO)分析和京都基因与基因组百科数据库(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路分析。

1.4 实时荧光定量PCR

1.4.1 总RNA提取

向细胞中加入1 mL预冷的TRIzol试剂(货号：15596026CN，购自美国赛默飞世尔科技公司)，并于室温下孵育5 min，加入200 μL氯仿并于室温下孵育5 min。随后以相对离心力13 000×g在4 ℃下离心 20 min并加入500 μL异丙醇，于室温下孵育20 min。以相对离心力13 000×g在4 ℃下离心5 min，去除上清液后保留管底白色RNA沉淀，使用NanoDrop分光光度计测定各RNA样品的浓度和纯度。

1.4.2 反转录合成cDNA

采用All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR，qPCR)反转录试剂盒(货号：AT341-01，购自北京全式金生物技术股份有限公司)，严格按照试剂盒说明书操作并配制反应体系，以1 μg总RNA为模板进行cDNA反转录合成。PCR仪参数设置为：42 ℃孵育15 min，85 ℃处理5 s，4 ℃终止反应。

1.4.3 qPCR扩增基因

按照TransStart® Green qPCR SuperMix试剂盒(货号：AQ111-01，购自北京全式金生物技术股份有限公司)说明书进行qPCR实验，设置qPCR仪参数为：94 ℃预变性30 s，随后94 ℃变性5 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸10 s，共40个循环。使用CFX Manager软件收集荧光信号，以2^-ΔΔCt方法计算基因相对表达量。引物序列见表1。

1.5 蛋白质印迹法

将含1%磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂(货号：P1045，购自上海碧云天生物技术股份有限公司)的组织细胞裂解液(货号：P0013C，购自上海碧云天生物技术股份有限公司)加入R28细胞中裂解20 min，于4 ℃下以相对离心力12 000×g离心15 min。小心吸取上清液并测出蛋白质浓度，加入变性缓冲液在沸水中煮5 min至蛋白质完全变性，随后在每条泳道中上样20 μg蛋白质，使用100 V恒压进行电泳，在冰浴下按照100 V电压2 h的条件将蛋白质转移到聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜上。在室温下使用5%的脱脂奶粉将PVDF膜孵育1 h进行非特异性蛋白质封闭，加入特异性一抗并于4 ℃下孵育过夜；次日在室温下加入辣根过氧化物酶标记的二抗并孵育1 h，使用增强化学发光显影液(货号：CW0049S，购自康为世纪生物科技股份有限公司)进行蛋白质显影。使用ImageJ软件测量目标蛋白质的相对表达水平，以 β-tubulin或β-actin为内参。

1.6 Hspa1a小干扰RNA转染

R28细胞达到30%~40%汇合度时，将正常培养细胞的DMEM换为不含血清的DMEM，按照Lipo2000(货号：11668019，购自美国赛默飞世尔科技公司)说明书将等比例的Hspa1a小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)和Opti-mem(货号：31985070，购自美国赛默飞世尔科技公司)培养基混匀孵育5 min，同时将Lipo2000与Opti-mem培养基等比例混匀并孵育5 min。将2者混合并继续孵育20 min。孵育结束后将上述转染复合体加入R28细胞中转染4 h，将培养基换为含血清的正常培养基，培养48 h后完成转染。siRNA序列由上海生工生物工程股份有限公司通过siDirect网站设计，3条siRNA序列为：siRNA-1，5'-ATCTTTCTCTCGATTGTAACTCC-3'；siRNA-2，5'-CTGTAAATCAATCAAACCTAAGA-3'；siRNA-3，5'-CAGAGCTATATTGATATAGCAAG-3'。转染后采用蛋白质印迹法验证Hspa1a的敲减效率。敲减效率合格的细胞用于后续OGD/R损伤+栀子苷干预的联合试验(即OGD/R+Gen+H-KD组)。

1.7 细胞活力检测试验

根据细胞计数试剂盒-8(cell counting kit-8，CCK-8；货号C0037，购自上海碧云天生物技术股份有限公司)说明书，按照1꞉9的比例将CCK-8原液与基础培养基配制成CCK-8工作液，并将100 μL的CCK-8工作液分别加入每孔中，在37 ℃且避光条件下孵育1 h，使用多功能酶标仪在波长450 nm下检测各待测样品的吸光度值。细胞活力=(处理组吸光度值-空白孔吸光度值)/(对照组吸光度值-空白孔吸光度值)×100%。

1.8 乳酸脱氢酶释放试验检测细胞死亡

根据乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)试剂盒(货号：C0016，购自上海碧云天生物技术股份有限公司)说明书，将96孔板分为空白孔对照、最大酶活性释放对照、正常对照、损伤或药物处理组，在检测时间前1 h将LDH释放试剂加入到最大酶活性释放对照组中，随后继续正常培养。在此期间，进行检测工作液的配制：1)碘硝基氯化四氮唑蓝(iodonitrotetrazolium chloride，INT)溶液。将10×的INT母液用INT稀释液稀释至1×工作浓度。2)LDH检测液。将乳酸溶液和酶溶液按说明书比例混合，现配适量LDH检测液。3)取新的96孔板，每孔依次加入20 μL 1×INT溶液和60 μL LDH检测液。将细胞培养板以500 ×g，收集上清液并与LDH检测液混匀，于37 ℃且避光条件下孵育30 min后，使用多功能酶标仪于波长490 nm下检测各待测样品的吸光度值。细胞死亡率=(损伤或药物处理组吸光度值-正常对照吸光度值)/(最大酶活性释放对照吸光度值-空白孔吸光度值)×100%。

1.9 ROS检测

按ROS试剂盒(货号：S0034，购自上海碧云天生物技术股份有限公司)说明书进行，以无血清DMEM培养基按1꞉1 000的比例稀释2’,7’-二氯二氢荧光素二乙酸酯(2’,7’-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA)母液，配制成检测工作液。去除细胞原培养基后，加入DCFH-DA工作液，在37 ℃培养箱中孵育20 min。使用无血清DMEM洗涤细胞3次，在荧光显微镜下观察并采集DCFH-DA荧光图像。采用ImageJ软件分析阳性产物的平均荧光强度值。

1.10 原位末端转移酶标记染色检测细胞凋亡

按照原位末端转移酶标记(TdT-mediated dUTP nick-end labeling，TUNEL)试剂盒(货号：C1088，购自上海碧云天生物技术股份有限公司)说明书进行，将培养的R28细胞使用磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffered saline，PBS)洗涤3次，随后使用4%多聚甲醛(paraformaldehyde，PF)溶液固定细胞30 min，并使用0.3% Triton X-100的PBS洗涤细胞5 min以通透细胞膜，在此过程中按照1꞉9꞉10的比例混合TdT酶、荧光标记液和TUNEL原液以配制TUNEL检测工作液。将TUNEL检测工作液加入到细胞中并于37 ℃下避光孵育1 h，使用PBS洗涤细胞3次后封片，使用荧光显微镜拍照并采集细胞TUNEL荧光染色图像。视网膜冰冻切片经蛋白激酶K(20 μg/mL)工作液处理20 min后，置于TUNEL检测液中孵育，后续步骤同R28细胞染色。采用ImageJ软件计数TUNEL阳性细胞并计算其比例。

1.11 SD大鼠急性高眼压模型制备及分组

所有大鼠均腹腔注射50 mg/kg戊巴比妥钠溶液进行麻醉，行眼部扩瞳处理。试验共设4组：对照组(CTL组)、急性高眼压(acute high intraocular pressure，aHIOP)组、aHIOP+栀子苷(aHIOP+Gen)组、aHIOP+栀子苷+Hspa1a抑制剂apoptozole(aHIOP+Gen+Apo)组。aHIOP组采用眼前房灌注法造模：将连接生理盐水的30 G针头小心刺入眼前房，缓慢将前房压力升高至120 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)并维持45 min^{[14, 16]}。对照组(CTL组)仅行假手术操作，不升高前房压力。aHIOP+Gen组与aHIOP+Gen+Apo组在造模前一天分别经角膜缘缓慢注入5 μL 200 μmol/L栀子苷溶液或 5 μL 200 μmol/L栀子苷与Hspa1a抑制剂apoptozole的混合液，注药后留针5 min确保药物充分弥散。各组大鼠于6 h后，经心脏灌注4%PF溶液行全身固定，随后在冰上于无菌条件下摘除眼球，置于4%PF溶液中后固定12 h。组织标本经梯度蔗糖溶液脱水处理后，制备厚度为6 μm的冰冻切片，用于后续检测。

1.12 苏木精-伊红染色

采用苏木精-伊红(hematoxylin and eosin，HE)染色观察大鼠视网膜组织形态学变化。大鼠麻醉后经PF溶液灌注固定，在冰上于无菌条件下摘除眼球并于PF溶液中后固定12 h。组织经梯度蔗糖溶液脱水后，置于包埋盒中，用OCT包埋剂(货号：4583，购自美国樱花公司)包埋成块。最后用冰冻切片机切取6 μm厚切片，蒸馏水洗涤2次，每次2 min。切片经苏木素染液孵育10 min，蒸馏水洗涤10 min，伊红染液孵育2 min，70%乙醇洗涤2次后，直接镜检并采集图像。

1.13 闪光视网膜电图

采用闪光视网膜电图(flash electroretinogram，fERG)检测大鼠视功能变化。将SD大鼠放入暗室中6 h进行暗适应，以下操作均在昏暗红色光照下进行。大鼠用戊巴比妥钠溶液(50 mg/kg)经腹腔注射麻醉，对其左眼进行散瞳。将记录电极插入大鼠眼睛前房，并将另一记录电极和参考电极分别置于前额皮下和尾端皮下。设置通道滤波为10 Hz、闪光亮度为 1.6 CD/(s·m^-2)，用闪光灯照射眼球3次，每次间隔 5 min，记录b波，b波的值为b波振幅波峰到a波振幅波谷的值。

1.14 统计学处理

采用GraphPad Prism 8.0软件进行统计学分析。符合正态分布的计量数据以均数±标准误表示，2组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 生物信息学数据挖掘栀子苷在青光眼治疗中的潜在关键分子

在蛋白质组学分析中，火山图结果(图1A)显示，与OGD/R组比较，OGD/R+Gen组共鉴定出106个差异表达蛋白质，其中41个蛋白质表达上调，65个蛋白质表达下调。GO功能富集分析结果(图1B)显示，相关生物学过程主要包括细胞增殖、细胞死亡、细胞迁移和糖代谢反应等；涉及相关靶点的主要分子功能包括DNA结合、钙离子结合、泛素连接酶结合和丝氨酰内肽酶抑制活性等；参与此过程的主要细胞组分包括胞质、细胞外基质蛋白复合体和高尔基体等。进一步对差异表达蛋白质进行KEGG通路富集分析(图1C)，结果显示，其主要富集于铁死亡通路、细胞肉瘤感染通路、补体与凝血级联信号通路和Nod样受体通路等。最后，通过热图将2组间变化最为明显的差异表达蛋白质进行汇总(图1D)，其中表达降低最明显的为Nucb2、Mfn1、Prkx、Pcgf6和Prnp(绿色框标记)，而表达增多最明显的为Rsrp1、Ptk2B、Afm、Atp2B4和热激蛋白家族A成员1A(heat shock protein family A member 1A，Hspa1a)(红色框标记)。

2.2 qPCR验证及筛选栀子苷在青光眼治疗中的潜在关键分子

为进一步筛选和验证栀子苷在青光眼治疗中的潜在关键分子，从转录层面验证蛋白质组学筛选结果。选取蛋白质组学分析中表达降低最明显的分子和表达增多最明显的10个分子进行qPCR实验。qPCR结果显示，与蛋白质组学结果一致的为：Nucb2和Pcgf6表达降低，而Ptk2b、Afm和Hspa1a表达增多(图2)。

2.3 蛋白质印迹法筛选和验证栀子苷在青光眼治疗中的可能关键分子

蛋白质印迹法结果(图3)显示，与OGD/R组比较，OGD/R+Gen组Nucb2表达显著降低(P<0.05)，而Ptk2b和Hspa1a表达均显著增加(均P<0.05)，与前序试验结果一致。

2.4 Hspa1a可能为栀子苷经Akt通路发挥青光眼保护作用的重要调控分子

通过蛋白质组学、qPCR及蛋白质印迹法联合筛选出栀子苷处理OGD/R损伤视网膜R28细胞后变化一致的分子，即Nucb2、Ptk2b和Hspa1a。进一步通过模拟分子构象、蛋白质-蛋白质相互作用分析及免疫共沉淀验证发现：Akt与Hspa1a存在相互作用(图4A~4C)。

蛋白质印迹法结果(图4D、4E)显示：OGD/R组中Hspa1a表达较CTL组显著上调(P<0.001)；OGD/R+ Gen组Hspa1a的表达水平较OGD/R组进一步升高 (P<0.05)。

2.5 Hspa1a可能作为Akt的上游分子在栀子苷抑制OGD/R损伤后视网膜R28细胞凋亡中发挥作用

蛋白质印迹法结果显示，第1和3条Hspa1a-siRNA可敲减Hspa1a(图5A、5B)；后续试验将这2条siRNA混合用于处理栀子苷干预的OGD/R损伤R28细胞(即OGD/R+Gen+H-KD组)。

CCK-8细胞活力检测显示，与OGD/R+Gen组比较，OGD/R+Gen+H-KD组细胞活力明显降低(P<0.05，图5C)；LDH试验结果显示，与OGD/R+Gen组比较，OGD/R+Gen+H-KD组细胞死亡率显著升高(P<0.05，图5D)。

蛋白质印迹法结果(图5E~5J)显示：与CTL组比较，OGD/R组Akt和其磷酸化活化形式p-Akt蛋白表达水平显著降低(均P<0.01)；OGD/R+Gen组较OGD/R组p-Akt蛋白表达水平明显升高(P<0.001)；而敲减Hspa1a可逆转栀子苷对p-Akt的上调作用(P<0.05)。此外，与OGD/R+Gen组比较，OGD/R+Gen+H-KD组的细胞凋亡相关指标cleaved caspase-3蛋白表达显著升高(P<0.05)，BAX/Bcl-2比值明显增大(P<0.05)。

2.6 栀子苷通过Hspa1a途径抑制OGD/R损伤后视网膜R28细胞的ROS产生和凋亡

DCFH-DA探针检测结果(图6A、6B)显示，与OGD/R组比较，OGD/R+Gen组ROS水平显著降低(均P<0.001)；而OGD/R+Gen+H-KD组ROS水平较OGD/R+Gen组显著升高(P<0.01)。TUNEL染色(图6C、6D)和流式细胞术(图6E、6F)检测结果显示，与OGD/R组比较，OGD/R+Gen组凋亡细胞数量显著减少(均P<0.05)；而OGD/R+Gen+H-KD组凋亡细胞数量较OGD/R+Gen组显著升高(均P<0.05)。

2.7 栀子苷通过激活Hspa1a-Akt通路减轻aHIOP

诱导的大鼠视网膜细胞凋亡分子改变

在动物试验中，蛋白质印迹法结果(图7)表明，与CTL组比较，aHIOP组Hspa1a蛋白表达水平显著升高(P<0.01)；与aHIOP组比较，aHIOP+Gen组Hspa1a蛋白表达水平进一步升高(P<0.001)；而aHIOP+Gen+Apo组的Hspa1a蛋白表达水平较aHIOP+Gen组显著降低(P<0.001)。此外，与CTL比较，aHIOP组Akt和p-Akt蛋白表达水平均显著降低(均P<0.001)；与aHIOP组比较，aHIOP+Gen组p-Akt蛋白表达水平明显升高(P<0.001)；aHIOP+Gen+Apo组p-Akt蛋白表达水平较aHIOP+Gen组显著降低(P<0.01)。与CTL组比较，aHIOP组cleaved caspase-3蛋白表达水平显著升高(P<0.001)；与aHIOP组比较，aHIOP+Gen组p-Akt蛋白表达水平显著降低(P<0.001)；aHIOP+Gen+Apo组p-Akt蛋白表达水平较aHIOP+Gen组显著升高 (P<0.05)。

2.8 栀子苷通过激活Hspa1a通路减轻aHIOP诱导的大鼠视网膜损伤和细胞凋亡

HE染色结果(图8A、8B)显示，CTL组视网膜节细胞层细胞排列紧密且界限清晰，aHIOP视网膜厚度显著减少，细胞边界变得模糊且分布紊乱；aHIOP+Gen组视网膜厚度有所恢复，节细胞层细胞边界和分布也变得更加清晰；aHIOP+Gen+Apo组再次出现视网膜厚度减少和细胞边界不清楚、分布紊乱。

TUNEL染色结果(图8C、8D)显示，与CTL组比较，aHIOP组中包括RGCs在内的视网膜各层TUNEL阳性凋亡细胞数明显增多(P<0.001)；与aHIOP组比较，aHIOP+Gen组视网膜各层凋亡细胞数明显减少(P<0.05)；与aHIOP+Gen组比较，aHIOP+Gen+Apo组凋亡细胞数显著增多(P<0.05)。

fERG结果(图8E、8F)表明，与CTL组比较，aHIOP组b波显著降低(P<0.001)；与aHIOP组比较，aHIOP+Gen组b波显著增高(P<0.05)；与aHIOP+Gen组比较，aHIOP+Gen+Apo组b波显著降低(P<0.05)。

3 讨 论

本研究对栀子苷处理前后的OGD/R损伤细胞进行蛋白质组学分析，筛选发现Hspa1a可能作为Akt的上游调控分子，参与OGD/R损伤后栀子苷对视网膜细胞的保护作用。

Hspa1a是热激蛋白70(heat shock protein 70，Hsp70）家族的成员，具有介导新合成蛋白质折叠的功能，从而维持蛋白质的稳定^[17-20]。本研究发现，在OGD/R和aHIOP损伤后，Hspa1a表达显著增加。该现象可能源于细胞在应激状态下代偿性增多，通过维持下游效应分子的稳态，从而减轻损伤并保护细胞存活。但仅仅是细胞代偿性增多不足以实现对细胞的保护作用。栀子苷处理后，增加的Hspa1a可介导Akt促活通路的活化，从而抑制细胞凋亡。Hspa1a可通过影响Akt的磷酸化状态参与多种生理病理过程^{[8, 21]}。Hspa1a是肌动蛋白骨架蛋白1(LIM and SH3 domain protein 1，LASP1)重要的伴侣分子。LASP1在多种肿瘤中可调控Akt途径，从而在肿瘤细胞中发挥各种功能，LASP1的过表达可增强p-Akt的磷酸化水平^[22]。在非小细胞肺癌和鼻咽癌中，LASP1与Hspa1a直接结合后，LASP1通过诱导Akt的磷酸化来促进恶性程度的进展^[23]。以特异性抑制剂靶向抑制或通过基因敲减Hspa1a，已成为多种肿瘤治疗的潜在新策略。

先前研究^[13]已确认栀子苷对青光眼的治疗作用，本研究进一步通过蛋白质组学筛出栀子苷处理前后的差异表达蛋白质，从而深入探讨Hspa1a可能经Akt通路介导栀子苷抑制视网膜细胞凋亡的作用。在本研究中，将Hspa1a-siRNA加入到栀子苷处理的OGD/R损伤R28细胞中以敲减Hspa1a的水平，结果显示，与OGD/R+Gen组比较，Hspa1a-siRNA处理可抑制p-Akt的表达、增加ROS的产生并削弱栀子苷对OGD/R诱导R28细胞凋亡的抑制作用。此外，本研究将Hspa1a抑制剂apoptozole^[24-25]注射到aHIOP损伤的大鼠玻璃体腔内，进一步证实抑制Hspa1a可削弱栀子苷对aHIOP诱导视网膜细胞凋亡的保护作用。这提示Hspa1a可能作为Akt的上游调控分子参与栀子苷的视网膜保护效应，即栀子苷通过Hspa1a-Akt信号通路抑制OGD/R及aHIOP诱导的细胞凋亡。研究^[26]指出，Hspa1a可通过Akt途径在神经系统中发挥作用，如慢性锰中毒可激活大鼠海马中Akt信号通路，同时伴随着Hspa1a转录和翻译的增强，导致海马神经元凋亡。然而，另有研究^[27]指出，七氟烷诱导的神经毒性可导致海马神经元丢失和Hspa1a表达升高，而通过Hspa1a抑制剂坦螺旋霉素可降低Hspa1a依赖性的细胞凋亡、氧化应激和促炎信号通路，从而降低七氟烷诱导的神经毒性。还有研究^[18]表明使用腺病毒干扰多巴胺神经元中的Hspa1a后，可以明显保护帕金森病(Parkinson disease，PD)模型小鼠的多巴胺能神经元，从而发挥治疗PD的潜在作用。本研究结果与之相悖，这种差异可能源于Hspa1a在不同疾病模型或细胞类型中的功能异质性。例如，在1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶引起的PD模型大鼠中，Hspa1a可发挥神经元保护作用^[18]。提示Hspa1a在神经系统中具有情境依赖性，未来研究应针对Hspa1a在不同疾病和组织中的特异性功能进行深入解析。

综上，本研究揭示栀子苷通过Hspa1a-Akt途径抑制OGD/R及aHIOP诱导的视网膜细胞凋亡，为青光眼的中药治疗提供了潜在靶点和新策略。

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基金资助

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