ASS1联合LOLA治疗小鼠高氨血症的疗效

Therapeutic efficacy of ASS1 combined with LOLA in the treatment of hyperammonemia in mice

摘要

目的 精氨酸代琥珀酸合成酶1(argininosuccinate synthase 1，ASS1)是尿素循环的关键限速酶且蛋白质高度保守，其催化活性直接决定血氨的清除效率。高氨血症(hyperammonemia)是血氨异常升高引起的、以中枢神经系统功能障碍为主要表现的临床综合征，具有神经毒性和较高病死率。肝功能受损或尿素循环关键酶缺陷时，清除血氨能力下降，导致血氨蓄积并透过血脑屏障，引发意识障碍、昏迷甚至死亡。目前临床常用降氨药物中，门冬氨酸鸟氨酸(L-ornithine-L-aspartate，LOLA)可促进尿素循环降低血氨并保护肝，但高剂量易致胃肠道不良反应，限制其应用。本研究通过原核表达获得具有生物活性的人源ASS1蛋白，解析其酶促动力学特性，旨在探讨ASS1联合LOLA的降血氨作用，为临床高氨血症的治疗提供新的思路和潜在的酶学干预策略。 方法 通过逆转录聚合酶链式反应(reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR)扩增获得人源ASS1的开放阅读框全长，并对该PCR产物及pET-28a载体进行酶切。经琼脂糖凝胶电泳回收纯化上述片段后，利用同源重组技术成功构建了pET-28a-ASS1原核表达载体。随后转化至大肠杆菌中表达并使用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-thiogalactopyranoside，IPTG)诱导6×His-ASS1重组蛋白表达，采用镍柱亲和层析(nickel-nitrilotriacetic acid，Ni-NTA)进行蛋白质纯化。通过体外酶活实验验证重组蛋白的生物活性，构建以瓜氨酸(citrulline，Cit)和天冬氨酸(aspartate，Asp)为底物的酶促反应体系，测定ASS1的最适温度和最适pH反应条件，并进一步解析其酶促动力学参数。构建NH₄Cl(腹腔注射400 mg/kg)诱导的C57BL/6小鼠高氨血症模型，检测ASS1联合LOLA降血氨作用，随机分组，建模4 h后经尾静脉给予ASS1、LOLA或联合干预4 h，并检测血氨与尿素水平；另设ASS1和LOLA联合用药对C57BL/6正常小鼠给药24 h后检测肝功能及肾功能指标。 结果 采用同源重组技术成功构建并获得pET28a-ASS1载体，并在原核表达系统中获得可溶性重组蛋白ASS1；经Ni-NTA亲和层析纯化和浓缩后，蛋白质纯度达95.4%±1.2%，浓度为(10.5±0.8) mg/mL。在体外酶活实验中系统解析了ASS1的酶促反应特性，显示ASS1酶促反应的最适温度为37 ℃，最适pH值为8.0；结合底物Asp和Cit测定其酶促动力学参数，ASS1与Asp和Cit的K_m和k_cat/K_m分别为(31.00±1.24) μmol/L，2.07 L/(μmol·s)和(46.53±2.75) μmol/L，1.35 L/(μmol·s)；在体内实验中，通过腹腔注射400 mg/kg NH₄Cl建立急性高氨血小鼠模型，ASS1(50 mg/kg)可通过加速尿素循环降低血氨浓度，使血氨浓度下降48.86%；ASS1(50 mg/kg)与低剂量LOLA(50 mg/kg)联合给药时，降氨效率进一步提升，血氨浓度下降76.31%，并可使高氨血症小鼠的血氨水平恢复至正常范围。 结论 通过原核表达获得的重组蛋白ASS1具有稳定且明确的生物活性，其催化功能受温度和pH条件显著影响，并呈现出清晰的酶促反应动力学特征。在NH₄Cl诱导的小鼠高氨血症模型中，ASS1与LOLA联合应用较单独用药表现出更稳定的降血氨效果，显示出良好的协同作用，为高氨血症的治疗提供了新的酶学干预思路，进而为发展联合降血氨策略奠定了理论依据，并具有潜在应用前景。

Abstract

Objective Argininosuccinate synthase 1 (ASS1) is a key rate-limiting enzyme in the urea cycle and is highly conserved at the protein level. Its catalytic activity directly determines the efficiency of ammonia clearance. Hyperammonemia is a clinical syndrome caused by abnormally elevated blood ammonia levels and is characterized mainly by central nervous system dysfunction, with neurotoxicity and a high mortality rate. When liver function is impaired or key enzymes of the urea cycle are deficient, ammonia clearance is reduced, leading to ammonia accumulation and passage across the blood-brain barrier, resulting in disturbances of consciousness, coma, or even death. Among currently used ammonia-lowering agents, L-ornithine-L-aspartate (LOLA) can promote the urea cycle to reduce blood ammonia levels and protect the liver; however, high doses are prone to gastrointestinal adverse effects, limiting its clinical application. This study obtained biologically active human ASS1 protein through prokaryotic expression and analyzed its enzymatic kinetic properties, aiming to explore the ammonia-lowering effect of ASS1 combined with LOLA and to provide new ideas and potential enzymatic intervention strategies for the clinical treatment of hyperammonemia. Methods The full-length open reading frame of human ASS1 was amplified by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR), and both the PCR product and the pET-28a vector were digested with restriction enzymes. After purification by agarose gel electrophoresis, the pET-28a-ASS1 prokaryotic expression vector was successfully constructed using homologous recombination technology. The recombinant plasmid was transformed into Escherichia coli, and expression of the 6×His-ASS1 recombinant protein was induced by isopropyl β-D-thiogalactopyranoside (IPTG). The protein was purified by nickel-nitrilotriacetic acid (Ni-NTA) affinity chromatography. In vitro enzyme activity assays were performed to verify the biological activity of the recombinant protein. An enzymatic reaction system using citrulline (Cit) and aspartate (Asp) as substrates was established to determine the optimal temperature and pH conditions for ASS1 activity and to further analyze its enzymatic kinetic parameters. A hyperammonemia mouse model was established in C57BL/6 mice by intraperitoneal injection of NH₄Cl (400 mg/kg). The ammonia-lowering effects of ASS1 combined with LOLA were evaluated. Mice were randomly grouped, and 4 hours after modeling, ASS1, LOLA, or combined treatment was administered via the tail vein for 4 hours, followed by measurement of blood ammonia and urea levels. In addition, normal C57BL/6 mice were treated with combined ASS1 and LOLA for 24 hours, after which liver and renal function indices were assessed. Results The pET28a-ASS1 vector was successfully constructed using homologous recombination, and soluble recombinant ASS1 protein was obtained in a prokaryotic expression system. After purification and concentration by Ni-NTA affinity chromatography, the protein purity reached 95.4%±1.2%, with a concentration of (10.5± 0.8) mg/mL. In vitro enzyme activity assays systematically characterized the enzymatic properties of ASS1, showing an optimal reaction temperature of 37 ℃ and an optimal pH of 8.0. Using Asp and Cit as substrates, the enzymatic kinetic parameters were determined. The K_m and k_cat/K_m values of ASS1 for Asp and Cit were (31.00±1.24) μmol/L and 2.07 L/(μmol·s), and (46.53±2.75) μmol/L and 1.35 L/(μmol·s), respectively. In vivo experiments showed that in an acute hyperammonemia mouse model induced by intraperitoneal injection of NH₄Cl (400 mg/kg), ASS1 (50 mg/kg) reduced blood ammonia levels by 48.86% by accelerating the urea cycle. When ASS1 (50 mg/kg) was combined with low-dose LOLA (50 mg/kg), the ammonia-lowering efficiency was further enhanced, with a reduction of 76.31%, restoring blood ammonia levels to the normal range in hyperammonemic mice. Conclusion Recombinant ASS1 protein obtained by prokaryotic expression exhibits stable and well-defined biological activity, with catalytic function significantly influenced by temperature and pH and displaying clear enzymatic kinetic characteristics. In an NH4Cl-induced mouse model of hyperammonemia, combined application of ASS1 and LOLA showed a more stable and effective ammonia-lowering effect than monotherapy, demonstrating good synergistic effects. These findings provide a new enzymatic intervention strategy for the treatment of hyperammonemia, lay a theoretical foundation for the development of combination ammonia-lowering therapies, and indicate potential application prospects.

Graphical abstract

关键词

精氨酸代琥珀酸合成酶1 / 原核表达与纯化 / 门冬氨酸鸟氨酸 / 高氨血症小鼠模型 / 降血氨作用

Key words

argininosuccinate synthase 1 / prokaryotic expression and purification / L-ornithine-L-aspartate / hyperammonemia mouse model / ammonia-lowering effect

精氨酸代琥珀酸合成酶1(argininosuccinate synthase 1，ASS1)是尿素循环的限速酶，催化瓜氨酸(citrulline，Cit)和天冬氨酸(aspartate，Asp)在腺苷三磷酸(adenosine triphosphate，ATP)供能的条件下生成精氨酸代琥珀酸，此为机体将有毒氨转化为无毒尿素的关键步骤^[1]。ASS1基因定位于9q24.11-9q23.12，开放阅读框长度为1 239 bp，编码412个氨基酸，分子量为46 kD(1 D=1 U)^[2]。

生理条件下ASS1形成同源四聚体发挥功能，人和哺乳动物ASS1氨基酸序列及四聚体结构高度保守^[3]，ASS1活性直接决定血氨清除效率，其活性下降或丧失会导致Cit无法有效利用，尿素循环受阻，体内氨无法及时清除，引起高氨血症。

高氨血症是以血氨水平异常升高而导致中枢神经系统功能障碍为主要表现的临床综合征^[4-5]。氨是机体蛋白质正常代谢产物，具有神经毒性。在正常生理状态下，约80%的氨经门静脉入肝，在肝中经尿素循环将有毒的氨转化为无毒的尿素后随尿液排出体外^[6-7]。当肝功能严重受损或尿素循环代谢酶发生遗传性缺陷时，肝对氨的清除能力显著降低或丧失，导致血氨浓度增高，大量的氨透过血脑屏障进入中枢神经系统，继而引起中枢神经系统功能失调，出现意识障碍，行为失常，昏迷，甚至死亡^[8-10]。目前，临床直接降血氨的药物主要是谷氨酸钠(钾)、精氨酸、门冬氨酸鸟氨酸(L-ornithine-L-aspartate，LOLA)等，其中谷氨酸钠(钾)、精氨酸对肝肾功能不全或腹水者会产生严重的毒副作用^[11-13]；LOLA分解成Asp和鸟氨酸，促进尿素和谷氨酰胺的合成，起降低血氨、保护肝的作用，但高剂量的LOLA会引起较为严重的胃肠道反应^[14-15]。因此，寻找新的、高效低毒的降血氨策略是高氨血症患者临床治疗亟须解决的重要问题。

本研究通过构建可以稳定表达人ASS1蛋白的载体、人ASS1基因的克隆和蛋白质表达获得具有生物活性的人ASS1蛋白，并对其酶学性质进行检测，旨在探究其与LOLA联合用药治疗高氨血症的疗效，为临床降血氨提供新的治疗策略和更多有生物活性的ASS1酶源。

1 研究对象与方法

1.1 伦理声明

本研究所有动物实验方案均已获得中南大学生命科学学院伦理委员会批准[审批号：伦审(科)第2021-2-49号]，并严格按照相关指南进行，以最大限度地减少动物痛苦。

1.2 动物和材料

1.2.1 动物与分组

5~6周龄C57BL/6雄性小鼠购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司。动物饲养于无特定病原体(specific pathogen free，SPF)级屏障环境，室温控制在(22±2) ℃，相对湿度为50%±10%，12 h明暗循环，自由摄食饮水。

1.2.2 材料与仪器

大肠杆菌DH5α、BL21(DE3)菌株、同源重组试剂盒均购自南京诺唯赞生物医药科技有限公司，人乳腺癌细胞系MCF-7、pET28a质粒为本实验室保藏，焦磷酸酶、LOLA均购自美国Sigma-Aldrich公司，镍柱亲和层析(nickel-nitrilotriacetic acid，Ni-NTA)琼脂糖购自德国Qiagen公司，胶回收试剂盒购自美国Promega公司，ASS1单克隆抗体购自美国CST(Cell Signaling Technology)公司，限制性核酸内切酶EcoR I-HF和Hind III-HF购自美国New England Biolabs公司，TRIzol、二喹啉甲酸(bicinchonininc acid，BCA)蛋白质检测试剂盒购自美国Invitrogen公司，超滤管购自美国Millipore公司，其他常规化学试剂均购自北京索莱宝科技有限公司。

多功能酶标仪EnSpire为美国PerkinElmer公司产品，冷冻离心机为德国Eppendorf公司产品，聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)仪、十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)系统为美国Bio-Rad公司产品，超声波细胞粉碎机为宁波新芝生物科技有限公司产品，全自动生化分析仪为美国Beckman Coulter公司产品。

1.2.3 实验用缓冲液的配置

1.2.3.1 蛋白质纯化相关缓冲液

裂解缓冲液(1 L)：50 mmol/L Tris.HCl，500 mmol/L NaCl，10 mmol/L咪唑，用NaOH将pH调节至8.0。

洗涤缓冲液(1 L)：50 mmol/L Tris.HCl，500 mmol/L NaCl，20 mmol/L咪唑，用NaOH将pH调节至8.0。

洗脱缓冲液(1 L)：50 mmol/L Tris.HCl，500 mmol/L NaCl，250 mmol/L咪唑，用NaOH将pH调节至8.0。

洗脱后脱盐并更换缓冲液(20 mmol/L的Tris.HCl+100~300 mmol/L NaCl)。

1.2.3.2 酶活性检测相关缓冲液

ASS1酶活性检测反应缓冲液(50 mL)：20 mmol/L Tris.HCl，2 mmol/L ATP，10 mmol/L Cit，10 mmol/L Asp，6 mmol/L MgCl₂，20 mmol/L KCl；0.2 U焦磷酸/孔。

ASS1酶活性检测钼酸盐缓冲液(50 mL)： 10 mmol/L维生素C，2.5 mmol/L 钼酸铵，2%(v/v)硫酸。

1.3 方法

1.3.1 pET28a-ASS1质粒的构建

采用TRIzol法从人乳腺癌细胞系MCF-7中提取总RNA，逆转录为互补DNA(complementary DNA，cDNA)后，使用ASS1特异性引物进行PCR扩增，ASS1正向引物为5'-ACCCTCGAGGGATCCGAATT-CATGTCCAGCAAAGGCTCC-3'，ASS1反向引物为 5'-AGACTGCAGGTCGACAAGCTTTTATTTGGCAG-TGACCTT-3'。反应条件：首先，94 ℃ 3 min；然后进行30个循环，94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s；最后72 ℃ 10 min。反应结束后4 ℃保存备用。采用EcoR I-HF和Hind III-HF对pET28a质粒进行双酶切，37 ℃孵育5~15 min。随后将PCR产物和酶切产物同时进行琼脂糖凝胶电泳后回收，采用同源重组的方法将ASS1基因整合到pET28a载体中。随后采用热激发将pET28a-ASS1质粒转化到大肠杆菌DH5α感受态中，筛选出阳性克隆进行菌落PCR，PCR阳性菌落送华大基因测序，测序正确的阳性菌落-80 ℃保菌备用。

1.3.2 ASS1蛋白的表达与纯化

将测序正确的pET28a-ASS1质粒采用热激法转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态中，筛选出阳性克隆后扩大培养，待光密度(optical density，OD)₆₀₀到0.4~0.6，加入终浓度为1 mmol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-thiogalactopyranoside，IPTG)25 ℃诱导18 h，将菌液离心收集菌体沉淀。按每克2~ 5 mL加入裂解缓冲液重悬细菌，加入溶菌酶至终浓度为1 mg/mL，冰上放置30 min，超声破壁，离心去上清，冰上待用。按每4 mL裂解液加入1 mL 50% Ni-NTA填料的比例加入填料，4 ℃旋转孵育60 min，将混合物装柱，洗涤缓冲液洗2次，每次1 mL，采用高浓度咪唑洗脱缓冲液洗4次，每次1 mL，收集4次洗脱缓冲液放入超滤管中进行浓缩，离心除盐，根据蛋白质的性质，调整储存缓冲液，根据所需的浓度，调整缓冲液体积。纯化的蛋白质采用BCA法进行浓度测定，随后分装，每支10~20 μL分装，液氮速冻后-80 ℃保存。

1.3.3 蛋白质印迹法

将纯化获得的ASS1蛋白样品与5×SDS-PAGE上样缓冲液混合，于100 ℃加热变性10 min。取等量蛋白质(约2 µg)与预染蛋白质分子量标准品一起进行上样，经SDS-PAGE分离。随后，采用湿转法在恒流300 mA条件下将蛋白质转移至预先经甲醇活化的PVDF膜上进行转膜。转膜结束后，将膜置于含5%脱脂奶粉的含Tween 20的磷酸盐缓冲液(Tris-buffered saline with Tween 20，TBST)中，室温封闭 2 h。封闭后，将膜与兔抗人ASS1多克隆一抗 (1꞉2 000稀释)于4 ℃孵育过夜。TBST缓冲液洗涤3次(每次10 min)后，与辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG二抗(1꞉5 000稀释)室温孵育1 h。再次充分洗涤后，使用增强化学发光(enhanced chemiluminescence，ECL)底物于化学发光成像系统内曝光显影。

1.3.4 温度和pH值对ASS1酶活力影响

ASS1酶活性检测参考Madiraju等^[16]的方法，步骤如下：

体外表达并纯化的ASS1(0.5 μM)和反应缓冲液按1꞉9混合后，于37 ℃下100 r/min摇床孵育10 min。取样50 μL，加入96孔板中，再加入50 μL钼酸盐缓冲液于37 ℃下180 r/min反应2 min，电吹风吹掉气泡，OD₆₆₀检测吸光度。每次实验中设置1组阴性对照，该组对照不加ASS1，其它成分与实验中一致。酶活力单位(U)定义为最适条件下，每分钟催化生成1 μmol/L焦磷酸所需的酶量。

1.3.4.1 最适反应温度和热稳定性的检测

温度对酶活性的影响具有双重效应，一方面当温度升高，分子运动加快，能量增加，化学反应速度加快。与此同时，温度升高会使酶的结构发生变化甚至变性失活，其催化活性也会下降。

在其它条件不变，温度为20~60 ℃条件下测定ASS1的酶活性，以酶活性最高值定义为100%。将ASS1在不同温度下保温1 h后，迅速冷却至0 ℃，检测酶的残余酶活性。残余酶活性(%)=处理后测得的酶活性/最高酶活性×100%

1.3.4.2 最适反应pH值和pH值稳定性的检测

pH值会影响底物和酶分子的电离状态，影响酶分子的空间结构及与底物的结合，从而影响酶的催化活性。为了了解pH值对ASS1酶活性的影响，在其他条件不变的情况下，改变缓冲液的pH值{分别采用浓度为20 mmol/L的如下缓冲液：乙酸钠缓冲液(pH 4.0~5.5)、2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲液[2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid buffer，MES；pH 5.5~6.5]和三羟甲基氨基甲烷缓冲液[Tris(hydroxymethyl)aminomethane buffer，Tris；pH 6.5~9.0]}，检测其酶活性，将酶活性最高的定义为100%，计算不同pH下的相对酶活性。与此同时，将ASS1用不同pH值的缓冲液稀释，在4 ℃下放置1 h后，检测酶的残余酶活性。

1.3.5 ASS1酶动力学参数的检测

分别配置Asp和Cit浓度分别为6.25、12.50、25.00、50.00、100.00、150.00、200.00、300.00和400 μmol/L，在最适反应条件下测定酶活力，其中检测Asp与ASS1的酶动力学参数时Cit浓度为饱和状态；检测Cit与ASS1的酶动力学参数时，Asp为饱和状态。最后，通过Lineweaver-Burk双倒数法求得V_max和K_m，根据反应体系的酶浓度计算催化常数(catalytic constant，k_cat )。并计算酶对底物的催化效率(k_cat/K_m)。

1.3.6 ASSI联合LOLA治疗高氨血症的药效和安全性初步探讨

1.3.6.1 药效试验

将5~6周龄C57BL/6小鼠适应性喂养3~4 d后，随机分为6组(n=6)：1)正常对照组(未经任何处理的健康小鼠，用于确立各项指标的生理基线水平)； 2)NH₄Cl模型组；3)ASS1治疗组；4)LOLA低剂量治疗组；5)ASS1+LOLA联合治疗组；6)LOLA高剂量治疗组。除正常对照组外，其余各组均通过腹腔注射400 mg/kg的NH₄Cl诱导急性高氨血症。造模4 h后，各治疗组通过尾静脉注射给予相应药物(ASS1治疗组给予50 mg/kgASS1，LOLA低剂量治疗组给予50 mg/kg LOLA，ASS1+LOLA联合治疗组给予 50 mg/kg ASS1+50 mg/kg LOLA，LOLA高剂量治疗组给予200 mg/kg LOLA)，NH₄Cl模型组则给予等体积溶剂。所有干预持续4 h后，经眼眶静脉丛采集血样，并使用全自动生化分析仪检测血氨与血尿素浓度。

1.3.6.2 ASSI联合LOLA用药对小鼠肝肾指标的影响

将5~6周龄C57BL/6小鼠适应性喂养3~4 d后，随机分为2组(n=6)：1)正常对照组(给予等体积溶剂)；2)ASS1+LOLA联合治疗组(给予50 mg/kg ASS1+50 mg/kg LOLA)。给药后24 h，经眼眶静脉丛采集血样，检测肝功能和肾功能的相关指标。同时，取小鼠肝及肾组织进行病理学分析：组织经4%多聚甲醛固定24 h，常规脱水、石蜡包埋后制备4 μm切片。切片经脱蜡、水化后，进行苏木精-伊红(hematoxylin and eosin，HE)染色，光镜下进行图像采集。

1.4 统计学处理

采用SPSS 18.0或Graph Prism 7软件进行分析，所有定量数据均采用均数±标准差表示。动物药效试验中多组间均数比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA)进行统计，并使用Tukey事后多重比较检验评估组间差异，P˂0.05为差异具有统计学意义。联合用药对小鼠肝、肾功能指标影响的评估采用非配对t检验。

2 结 果

2.1 pET28a-ASS1 载体的构建与鉴定

从人乳腺癌MCF-7细胞系中提取总RNA(图1A)，ASS1的编码序列(coding sequence，CDS)长度为1 239 bp，PCR产物条带在1 000~1 500 bp(图1B)，位置吻合；同时采用EcoR I-HF和Hind III-HF限制性内切酶对pET28a质粒进行双酶切(图1C)，随后将PCR产物和酶切后的质粒同时进行回收，应用同源重组的方式将ASS1基因构建到pET28a载体中，随后将构建好的重组质粒转化到大肠杆菌DH5α中，采用含卡那霉素的固体培养皿进行筛选，随机挑选进行菌落PCR验证(图1D)，随后将PCR阳性的菌落送华大基因测序，结果显示序列正确，表明质粒构建成功。

2.2 ASS1的表达与纯化

SDS-PAGE结果表明，ASS1蛋白在上清中高表达(图2A，S)，但也有大量ASS1以包涵体的形式存在于沉淀中(图2A，P)。Ni-NTA亲和纯化结果表明，与裂解上清液(图2B，L)相比，上样流出液(图2B，F)在目标条带处显著减少，而其他位置无显著变化，大部分目的条带与Ni-NTA结合。洗涤2次后，大部分未结合的蛋白质被去除(图2B，W2)，4次竞争洗脱(图2B，E1~E4)中第2次(图2B，E2)获得的目的蛋白质最多，随后逐渐减少；洗脱液浓缩后最终获得纯度超过95%±1.2%(图2C)，浓度为(10.5±0.8) mg/mL的ASS1蛋白。

蛋白质印迹结果表明，所纯化的蛋白质确定为ASS1(图2D)。

2.3 温度对ASS1酶活性的影响

相对酶活性检测结果如图3A所示，ASS1最适反应温度为37 ℃，在20~37 ℃，增加反应温度，酶活性增加；超过37 ℃后，增加反应温度，酶活性迅速降低；当温度达到60 ℃时，酶活性降低到30%以下。

温度对酶稳定性的影响检测结果如图3B所示，酶活性随温度升高而降低，在20~30 ℃时，残留酶活性保持在80%以上，稳定性较好；当温度超过40 ℃时，酶活性降到40%以下；当温度达到60 ℃时，酶活性接近0。

2.4 pH值对ASS1酶活性的影响

相对酶活性检测结果如图4A所示，ASS1最适pH值为8.0，pH值在4.0~8.0时，增加pH值，酶活性增加；其中pH值在6.0~8.0时，ASS1相对酶活性大于90%；当pH值大于8.0时，酶活性显著降低。

pH值对酶稳定性的影响检测结果如图4B所示，当pH值在4.0~8.0时，pH值越高，ASS1酶温度稳定性越好；其中pH值在7.0~8.0时，ASS1酶活性保持在90%以上；当pH值为8.0，相对酶活性最高，与其反应最适pH值一致。

2.5 ASS1酶动力学参数

酶动力学参数检测结果表明，Asp与ASS1的酶动力学参数时Cit浓度为饱和状态(图5A)；检测Cit与ASS1的酶动力学参数时，Asp为饱和状态(图5B)。酶浓度计算结果如表1所示，ASS1与Asp的K_m值低于ASS1与Cit的K_m值，ASS1与Asp的亲和力更高；ASS1对Asp的催化效率要明显高于对Cit的催化效率，其中反应速率k_cat无显著差异，催化效率的差异主要是由于酶与底物的亲和力(K_m)的不同。

2.6 ASSI联合LOLA治疗高氨血症小鼠的疗效

将C57BL/6小鼠腹腔注射400 mg/kg NH₄Cl，构建高氨血症模型(图6A)，结果显示，以溶剂组为对照，正常对照组小鼠血氨浓度为(18.68±0.75) μmol/L，血尿素浓度为(8.25±0.17) mmol/L，NH₄Cl模型组小鼠血氨浓度为(84.22±2.52) μmol/L，血尿素浓度为(15.15±0.45) mmol/L，NH₄Cl处理后小鼠的血氨浓度和血尿素浓度均显著增加(均P<0.001)，表明建模成功(图6B、6C)。

单独注射ASS1和低剂量的LOLA虽然均能显著降低血氨浓度(ASS1：48.86%；LOLA：20.53%)，但无法降低到正常水平；当二者联合使用时，血氨浓度能降低76.31%，与正常组血氨浓度均值接近，且优于高剂量LOLA阳性对照组(63.30%)，展现出更佳的降血氨能力(图6B、6C)。与此同时，血尿素浓度随血氨浓度降低而增加(图6D)，相关性分析发现，血尿素与血氨呈显著负相关(Pearson’s ρ=-0.909，P=0.022)。

2.7 ASSI联合LOLA治疗对小鼠肝肾指标影响

肝、肾功能检测结果如表2所示，与正常对照组比较，ASS1与LOLA的联合用药对小鼠ALT、AST、肌酐和尿酸均无显著影响。HE染色结果如图7所示，ASS1与LOLA联合用药组小鼠肝、肾细胞结构清晰，细胞质丰富。

3 讨 论

本研究成功实现了ASS1蛋白的高效表达与高纯度纯化，为相关研究与应用提供了具备高催化活性的关键酶源。ASS1蛋白的表达和纯化在国内外文献中鲜有报道，仅Berning等^[17]采用pQE-30质粒表达野生型ASS1，通过酶活实验检测发现，其K_m分别为68 μmol/L(Asp)和112 μmol/L(Cit)。而本研究表达纯化的ASS1的K_m分别为31.00 μmol/L(Asp)和 46.53 μmol/L(Cit)，表明本研究表达的ASS1与底物亲和力更好。

ASS1作为尿素循环的限速酶，主要在肝、肾中高表达，能催化Cit和Asp在ATP供能的情况下生成精氨酸代琥珀酸^[18]。正常情况下，ASS1、Cit和Asp在血清中的含量低。因此，单独使用ASS1时，缺乏足够多的Cit和Asp底物，虽然均能显著降低血氨浓度，但与正常血氨浓度还有很大差异，仍无法将血氨恢复至生理水平。当ASS1与LOLA联合使用时，降低血氨的效果优于单独使用高剂量LOLA。笔者推测这可能与以下协同作用有关：LOLA可快速提供鸟氨酸和Asp作为ASS1的直接底物，与Cit共同高效生成精氨酸代琥珀酸，进而转化为精氨酸和延胡索酸^[19]。其中，精氨酸可促进尿素合成以清除血氨，而延胡索酸则可通过三羧酸循环供能，支持整个解毒过程。因此，ASS1与LOLA可能构成了一个从底物供给与能量代谢层面协同增强尿素循环通路的“酶-底物协同”体系。

目前，临床上针对高氨血症的药物治疗策略主要集中于2大类：一是补充尿素循环的关键底物或前体(例如LOLA)^[20]；二是启用旁路排泄途径以直接清除血氨^[21]，即使用氨清除剂(如苯丁酸钠及其前体药物)，此类药物(如甘油苯丁酸酯)是尿素循环障碍长期管理中的选择。ASS1是尿素循环的限速酶^[22]，其残余活性与血氨水平直接相关^[23]。在此基础上，本研究提出直接补充关键限速酶ASS1，并与经典药物LOLA协同，从源头上重建尿素循环的核心催化功能，实现更快速、更稳定的血氨控制，这代表了一种更具靶向性的治疗思路。值得注意的是，本研究主要验证了单次给药的急性期疗效与短期安全性，提示ASS1与LOLA的联合用药在急性干预中具有良好的耐受性，但其长期用药的潜在毒性，特别是对肝肾功能可能产生的慢性影响，仍有待进一步评估。综上，本研究从“重建尿素循环核心功能”与“协同增效”的角度，为高氨血症的临床治疗提供了新思路和新策略，同时也证实并提供了具有生物活性的功能性ASS1酶源，为相关机制研究与未来应用奠定基础。

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基金资助

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