LC3介导的细胞自噬通过靶向SIRT1促进糖尿病胃轻瘫发生

LC3-mediated autophagy promotes the occurrence of diabetic gastroparesis by targeting SIRT1

摘要

目的 糖尿病胃轻瘫(diabetic gastroparesis，DGP)是糖尿病的常见并发症，其发病机制复杂，尚未被完全阐明。本研究旨在探讨微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3)介导的细胞自噬是否通过靶向去乙酰化酶1(sirtuin 1，SIRT1)促进DGP进展。 方法 采用35 mmol/L葡萄糖处理大鼠胃平滑肌细胞(gastric smooth muscle cells，GSMCs)以建立DGP模型，采用3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine，3-MA)抑制自噬。检测细胞凋亡率、锥虫蓝阳性细胞率、细胞存活率、SIRT1、自噬标志物(LC3 II、LC3 I、Beclin-1、p62)、凋亡相关蛋白[B细胞淋巴瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2-associated X protein，Bax)、cleaved及non-cleaved caspase-3]的变化，通过免疫共沉淀验证LC3 II与SIRT1的相互作用。将6~8周龄SD大鼠随机分为正常组、阴性对照组、模型组及模型+3-MA组，每组6只，检测胃内色素残留率、肠道推进率、SIRT1及凋亡相关蛋白水平，采用原位末端转移酶标记法(terminal-deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end labeling，TUNEL)染色检测胃组织中细胞凋亡水平。 结果 高糖导致GSMCs凋亡率和锥虫蓝阳性细胞率升高，存活率降低；同时高糖也引起SIRT1、Bcl-2、p62水平均下调，LC3 II/LC3 I比值、Beclin-1、Bax及cleaved caspase-3水平均上调(均P<0.05)；3-MA可逆转高糖对GSMCs的影响。在高糖处理且3-MA干预的GSMCs中，沉默SIRT1引起细胞凋亡率及锥虫蓝阳性细胞率升高，存活率降低；LC3 II/I比值、Beclin-1、Bax及cleaved caspase-3水平均显著升高，而SIRT1、Bcl-2、p62水平均显著降低(均P<0.05)。此外，高糖导致细胞核SIRT1水平降低(P<0.05)，并引起细胞质SIRT1上调(P<0.05)，3-MA处理可逆转高糖对细胞核及细胞质SIRT1的影响。免疫共沉淀结果表明SIRT1可与LC3相互作用；干扰LC3-SIRT1相互作用引起细胞核SIRT1水平升高，并下调细胞质SIRT1水平。模型组大鼠的胃内色素残留率高于阴性对照组，肠道推进率低于阴性对照组；模型组胃组织TUNEL阳性细胞数显著高于阴性对照组；模型组Bax、cleaved caspase-3水平均高于阴性对照组，而SIRT1、Bcl-2水平均低于阴性对照组(均P<0.05)；3-MA可逆转模型组表现。 结论 高糖能以LC3 II依赖性方式下调SIRT1水平，继而诱导GSMCs凋亡，促进DGP进展。

Abstract

Objective Diabetic gastroparesis (DGP) is a common complication of diabetes mellitus, and its pathogenesis is complex and has not yet been fully elucidated. This study aims to investigate whether microtubule-associated protein 1 light chain 3 (LC3)-mediated autophagy promotes the progression of DGP by targeting sirtuin 1 (SIRT1). Methods Rat gastric smooth muscle cells (GSMCs) were treated with 35 mmol/L glucose to establish an in vitro model of DGP. Autophagy was inhibited using 3-methyladenine (3-MA). The apoptosis rate, trypan blue-positive cell rate, and cell viability were detected. The expression levels of SIRT1, autophagy-related markers (LC3 II, LC3 I, Beclin-1, and p62), and apoptosis-related proteins [B-cell lymphoma-2 (Bcl-2), Bcl-2-associated X protein (Bax), and cleaved/non-cleaved caspase-3] were analyzed. The interaction between LC3 II and SIRT1 was validated by co-immunoprecipitation. Six- to 8-week-old SD rats were randomly divided into 4 groups: A normal group, a negative control group, a model group, and a model + 3-MA group (n=6 per group). Gastric pigment retention rate and intestinal propulsion rate were measured, and the levels of SIRT1 and apoptosis-related proteins were detected. Terminaldeoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end labeling (TUNEL) staining was performed to assess the level of apoptosis in gastric tissues. Results High glucose treatment increased the apoptosis rate and trypan blue-positive cell rate in GSMCs while reducing cell viability. Meanwhile, high glucose also downregulated the expression levels of SIRT1, Bcl-2, and p62, and upregulated the LC3 II/I ratio, Beclin-1, Bax, and cleaved caspase-3 (all P<0.05). Treatment with 3-MA reversed the effects of high glucose on GSMCs. In GSMCs treated with high glucose and 3-MA, SIRT1 silencing increased the apoptosis rate and trypan blue-positive cell rate while reducing cell viability. The LC3 II/I ratio, Beclin-1, Bax, and cleaved caspase-3 were significantly increased (all P<0.05), whereas the expression levels of SIRT1, Bcl-2, and p62 were significantly decreased (P<0.05). In addition, high glucose treatment decreased nuclear SIRT1 levels (P<0.05) while increasing cytoplasmic SIRT1 levels. Treatment with 3-MA reversed the effects of high glucose on nuclear and cytoplasmic SIRT1 expression. Co-immunoprecipitation results showed that SIRT1 interacted with LC3. Disruption of the LC3-SIRT1 interaction increased nuclear SIRT1 levels while decreasing cytoplasmic SIRT1 levels. Compared with the negative control group, rats in the model group showed a higher gastric pigment retention rate and a lower intestinal propulsion rate. The number of TUNEL-positive cells in gastric tissue was significantly higher in the model group than in the negative control group. In addition, the expression levels of Bax and cleaved caspase-3 were higher in the model group (P<0.05), whereas the expression levels of SIRT1 and Bcl-2 were lower (all P<0.05). Treatment with 3-MA reversed these changes. Conclusion High glucose can downregulate SIRT1 expression in an LC3 II-dependent manner, thereby inducing apoptosis of GSMCs and promoting the progression of DGP.

Graphical abstract

关键词

糖尿病胃轻瘫 / 自噬 / 微管相关蛋白1轻链3 / 去乙酰化酶1 / 胃平滑肌细胞

Key words

diabetic gastroparesis / autophagy / microtubule-associated protein 1 light chain 3 / sirtuin 1 / gastric smooth muscle cells

糖尿病是一种由遗传和环境因素引发的代谢性疾病^[1]。糖尿病胃轻瘫(diabetic gastroparesis，DGP)是一种常见的糖尿病消化道并发症，定义为糖尿病患者在无机械性梗阻情况下出现的胃排空延迟综合征^[2-4]。然而，DGP的发病机制尚不明确。高糖环境可诱导胃平滑肌细胞(gastric smooth muscle cells，GSMCs)大量死亡，导致胃动力下降，从而引起DGP^[5-6]。细胞自噬是一种介导受损细胞器及错误折叠蛋白等降解的生物学过程^[7]。DGP伴随自噬激活，表现为自噬标志物微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3)表达上调^[8]。去乙酰化酶1(sirtuin 1，SIRT1)是一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，NAD)⁺依赖性脱乙酰酶，介导底物蛋白的去乙酰化^[9]。在DGP中，SIRT1表达下调与DGP的发生和发展有关^[10]。SIRT1是细胞自噬的底物，自噬激活后，LC3可与SIRT1相互作用并诱导其降解，进而调控生理及病理过程^[11]。然而，在DGP进展中，LC3是否通过SIRT1调控胃动力尚不清楚。本研究拟结合DGP的体外及体内模型，证实LC3是否通过调控SIRT1促进DGP进展，以期为DGP的防治提供潜在靶点。

1 材料与方法

1.1 伦理声明

本研究获得湖南师范大学生物医学研究伦理委员会批准[审批号：伦审科2023第(D2023015)号]。

1.2 材料

1.2.1 实验细胞

大鼠GSMCs(货号：CP-R208)购自武汉普诺赛生命科技有限公司，采用大鼠GSMCs完全培养基于37 ℃、5% CO₂环境中培养，待细胞生长状态良好后进行分组实验。

1.2.2 实验动物

SD大鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司[实验动物生产许可证号：SCXK(京)2021-0006；使用许可证号：SYXK(京)2022-0052]，6~8周龄，体重180~200 g，饲养环境为20~22 ℃、相对湿度50%~60%，自由饮食饮水。适应性饲养1周后，进行实验建模。

1.2.3 主要试剂和药物

原位末端转移酶标记法(terminal-deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end labeling，TUNEL)染色细胞凋亡检测试剂盒(货号：C1086)、蛋白酶K(货号：ST533)、细胞核蛋白与细胞质蛋白抽提试剂盒(货号：P0028)、Triton X-100试剂(货号：P0096)、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)凝胶配制试剂盒(货号：P0012A)、带有巨细胞病毒主要即刻早期启动子(plasmid with cytomegalovirus major immediate-early promoter，pCMV)-多克隆酶切位点(cloning site，C)-增强型绿色荧光蛋白的质粒(enhanced green fluorescent protein，EGFP)(货号：D2636)、pCMV-绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)-LC3B(货号：D2815)、Annexin V-异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)细胞凋亡检测试剂盒(货号：C106S)、细胞计数试剂盒-8(cell counting kit-8，CCK-8；货号：C0037)、5×上样缓冲液(货号：P0015L)均购自上海碧云天生物技术有限公司；4%多聚甲醛固定液(货号：E672002)、Tris缓冲盐溶液(Tris-buffered saline with Tween^® 20，TBST)溶液(货号：C006161)均购自上海生工生物工程股份有限公司；蛋白A磁珠(货号：88846)购自美国Pierce公司；GFP抗体(货号：HY-P80141)、链脲佐菌素(货号：HY-13753)、3-甲基腺嘌呤[3-methyladenine，3-MA(自噬抑制剂)；货号：HY-19312]和雷帕霉素(细胞自噬激活剂，货号：61925)均购自美国MedChemExpress公司；IgG抗体(货号：ab182931)、SIRT1抗体(货号：ab189494)、LC3抗体(货号：ab192890)、B细胞淋巴瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)抗体(货号：ab194583)、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2-associated X protein，Bax)抗体(货号：ab32503)、β-actin抗体(货号：ab8226)、p62抗体(货号：ab109012)均购自英国Abcam公司；cleaved caspase-3抗体(货号：9661)、non-cleaved caspase-3抗体(货号：9662)、SIRT1 siRNA(si-SIRT1；货号：12241)、siRNA阴性对照(si-NC；货号：6568)均购自美国Cell Signaling Technology公司；GFP标签抗体(货号：66002-1-Ig)购自武汉三鹰生物技术有限公司；大鼠GSMCs完全培养基(货号：CM-R208)购自武汉普诺赛生命科技有限公司。si-SIRT1-1：正义链5'-GAACAAAGUUGACGAUUUAGA-3'；反义链5'-UAAAUCGUCAACUUUGUUCUU-3'。si-SIRT1-2：正义链5'-GCACUAAUUCCAAGUUCUAUA-3'；反义链5'-UAGAACUUGGAAUUAGUGCUA-3'。si-SIRT1-3：正义链5'-GCUCUGUUCUAUACCAGUAUG-3'；反义链5'-UACUGGUAUAGAACAGAGCUG-3'。SIRT1 siRNA (si-SIRT1-1~3)(货号：HY-RS12939)及siRNA阴性对照(货号：HY-150150)均购自美国MedChemExpress公司。美蓝溶液(货号：G1300)、锥虫蓝(货号：C0040)均购自北京索莱宝科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 细胞分组

为探究高糖背景下细胞自噬对GSMCs的影响，将GSMCs分为对照组、高糖组、雷帕霉素组；为验证LC3对SIRT1蛋白稳定性的影响，将GSMCs分为对照组、高糖组、高糖+3-MA组；为进一步探究LC3介导的自噬是否通过诱导SIRT1降解促进高糖下GSMCs死亡，将GSMCs分为高糖组、高糖+3-MA组、高糖+3-MA+si-NC组和高糖+3-MA+si-SIRT1组。对照组用含5 mmol/L葡萄糖的培养基孵育细胞24 h。雷帕霉素组接受含5 mmol/L葡萄糖的培养基孵育，并加入雷帕霉素(终浓度为1 mmol/L)孵育细胞24 h。高糖组接受含35 mmol/L葡萄糖的培养基孵育细胞24 h。高糖+3-MA组采用10 mmol/L 3-MA和35 mmol/L葡萄糖同时孵育细胞24 h。高糖+3-MA+si-NC组及高糖+ 3-MA+si-SIRT1组接受通过脂质体法转染的siRNA，转染48 h后采用3-MA和35 mmol/L葡萄糖同时处理细胞24 h。使用锥虫蓝染色法检测各组细胞活力。

1.3.2 流式细胞术

消化细胞后，用PBS洗涤并进行细胞计数。取 1 mL细胞悬液(细胞密度为5×10⁴/mL)，根据细胞凋亡试剂盒说明书进行染色。采用流式细胞仪检测各组细胞凋亡率。

1.3.3 免疫荧光

弃去细胞培养基，使用4%多聚甲醛固定液室温固定细胞15 min。用TBST洗涤3次后，加入0.1% Triton X-100试剂室温通透10 min。再用TBST洗涤3次，然后加入含5% BSA的TBST封闭液室温封闭1 h。又用TBST洗涤后，依次加入LC3一抗于4 ℃下孵育过夜，二抗室温下避光孵育1 h。加入抗荧光淬灭封片剂，于荧光显微镜下观察。LC3一抗稀释度为1꞉100，荧光素标记的二抗稀释度为1꞉50。

1.3.4 核质蛋白质分离试验

用PBS溶液洗涤细胞后，将细胞转移至新的离心管中。于4 ℃下低速(300 g)离心5 min后弃上清液，收集细胞沉淀，采用细胞核蛋白质与细胞质蛋白质抽提试剂盒进行核质蛋白质分离试验。

1.3.5 蛋白质印迹法

收集样品，加入200 μL预冷的放射免疫沉淀分析(radioimmunoprecipitation assay，RIPA)裂解液，样品充分裂解后于4 ℃下以12 000 g离心15 min，取上清液，进行蛋白质印迹法检测。采用BCA蛋白检测试剂盒测定蛋白质浓度，并将各组蛋白质样品均调整至2 μg/mL，加入1×上样缓冲液，在沸水浴中加热10 min。使用SDS-PAGE凝胶试剂盒配制分离胶。转膜后，将聚偏二氟乙烯(polyvinylidene difluoride，PVDF)膜置于封闭液中，振荡孵育1 h。用TBST溶液清洗后，加入稀释后的一抗于4 ℃下孵育过夜。用TBST溶液清洗3次，加入二抗室温下孵育1 h。使用增强化学发光法(enhanced chemiluminescence，ECL)试剂进行显色反应。上机，采用蛋白质凝胶成像仪获取蛋白条带图像，使用ImageJ软件分析，以β- actin为内参蛋白计算蛋白质相对水平。所用抗体稀释比例如下：β-actin(1꞉1 000)；SIRT1抗体(1꞉1 000)；Bax抗体(1꞉1 000)；Bcl-2抗体(1꞉1 000)；Beclin-1抗体(1꞉1 000)；LC3抗体(1꞉1 000)；p62抗体(1꞉10 000)。

1.3.6 CCK-8法

将细胞接种于96孔板，待细胞贴壁后进行前述分组处理。处理24 h后，每孔加入10 μL CCK-8，于37 ℃下孵育细胞1 h。使用酶标仪检测每组样品在450 nm处的吸光度(A)值，并计算细胞存活率。细胞存活率=(实验孔A值-空白孔A值)/(对照孔A值-空白孔A值)×100%。

1.3.7 免疫共沉淀

免疫共沉淀(co-immunoprecipitation，Co-IP)方法：取GSMCs，分为GFP组和GFP-LC3组。GFP组接受pCMV-C-GFP和pcDNA3.1-SIRT1质粒共转染，GFP-LC3组接受pCMV-GFP-LC3和pcDNA3.1-SIRT1共转染。收集细胞样品，加入200 μL RIPA裂解液，充分裂解后于4 ℃下以12 000 g离心15 min获得上清液。取20 μL上清液作为Input对照，加入等体积2×上样缓冲液，95 ℃加热10 min，于-20 ℃保存，用于后续蛋白质印迹法检测SIRT1蛋白水平。剩余上清液用于免疫沉淀处理。

取适量蛋白质A磁珠，用裂解液洗涤3次。分别加入1 μg/mL的IgG抗体或GFP抗体，室温下轻缓旋转孵育2 h，使抗体与磁珠偶联。偶联完成后，用裂解液洗涤磁珠2次以去除未结合抗体。向剩余上清液中分别加入上述制备好的IgG-磁珠复合物或GFP-磁珠复合物，于4 ℃下振荡孵育过夜。用磁力架收集磁珠，弃上清。用500 μL预冷的洗涤缓冲液重悬磁珠，重复洗涤4次。向洗净的磁珠沉淀中加入20 μL 1×上样缓冲液，95 ℃煮沸10 min，使结合蛋白解离。瞬时离心后，取上清液作为免疫沉淀样品。用蛋白质印迹法检测Input及免疫沉淀样品中的SIRT1蛋白水平。

1.3.8 SIRT1突变体构建

研究^[11]表明SIRT1上W221及W224位点突变可显著减弱LC3与SIRT1间的相互作用，从而抑制细胞自噬介导的SIRT1蛋白降解。应用实时荧光定量PCR(quantitative PCR，qPCR)技术扩增SIRT1基因，并克隆至pcDNA 3.1质粒，获得待突变质粒模板。应用QuickMutation™基因定点突变试剂盒和PCR技术行定点突变(突变位点包括W221A及W224A)，进行感受态大肠杆菌转化及阳性克隆鉴定，鉴定正确后收集质粒，获得SIRT1突变质粒。通过脂质体法将SIRT1突变质粒转染至细胞以诱导SIRT1突变。

1.3.9 蛋白质稳定性检测

将细胞接种于6孔板，在正常培养条件下培养至约80%汇合度。根据实验设计，将细胞进行前述分组处理。将100 µg/mL环己酰亚胺加入各孔培养基中，以此时间点记为0 h，于0、2、4、8 h收集细胞样品，通过蛋白质印迹法分析各时间点细胞裂解物中的SIRT1及内参蛋白β-actin的蛋白质丰度。

1.3.10 动物分组

将大鼠分为正常组、阴性对照组、模型组、模型+3-MA组，每组6只。动物建模方法参考既往研究^[12-13]。正常组：全程给予正常标准饮食。阴性对照组：腹腔注射与链脲佐菌素等体积的生理盐水溶剂，并全程给予正常标准饮食。模型组：腹腔注射50 mg/kg链脲佐菌素以诱导糖尿病，随后给予高脂高糖饮食8周以建立DGP模型。模型+3-MA组：在成功建立DGP模型后，于实验的第8至9周腹腔注射15 mg/kg 3-MA。后2组的模型制备过程：健康SD大鼠腹腔注射50 mg/kg链脲佐菌素，72 h后对大鼠进行禁食16 h，采集尾静脉血样，使用全自动生化仪检测血糖浓度，当血糖>16.8 mmol/L时判定为糖尿病模型诱导成功，随后，给予糖尿病大鼠高糖高脂饲料饲养8周后，检测所有大鼠的胃内色素残留率及肠道推进率，筛选出具有胃轻瘫症状的大鼠，并随机分为模型组和模型+3-MA组。高糖高脂饲养9周后，测定所有大鼠的随机血糖和体重，并再次检测胃内色素残留率和肠道推进率。采用颈椎脱臼法处死大鼠，收集胃组织，部分用于蛋白质印迹分析，部分用于制备石蜡组织切片。

1.3.11 胃内色素残留率和肠道推进率检测

采用胃内色素残留率和肠道推进率评价大鼠胃排空能力。大鼠禁食16 h后，用0.2 mL 0.01%亚甲蓝(美蓝)溶液灌胃。灌胃2 h后行脱臼法处死，剖腹，暴露全胃并取出，置于含2 mL蒸馏水、1.5 mL四氯化碳、0.5 mL无水乙醇的15 mL试管中，振荡试管至胃内残留色素充分溶解，以1 000 g离心30 min，取上清液。使用紫外分光光度计测定620 nm处的A值。将阴性对照组、模型组、模型+3-MA组作为实验组，正常组记为正常对照组，胃内色素残留率计算公式如下：胃内色素残留率=(实验组A值/正常对照组A值)×100%。大鼠处死后，分离全部小肠，使用手术剪剪断肠系膜，牵拉小肠至直线状，使用直尺测量小肠总长度(S)及肠道内美蓝标志物在小肠中的推进距离(T)，按以下公式计算肠道推进率：肠道推进率=(T/S)×100%。

1.3.12 TUNEL染色

取胃组织石蜡切片，脱蜡水化后滴加20 mg/mL蛋白酶K溶液，于37 ℃湿盒中孵育15 min。PBS溶液洗涤3次后，加入3%过氧化氢溶液，室温孵育 30 min，以彻底灭活内源性过氧化氢酶。根据TUNEL细胞凋亡检测试剂盒说明书进行TUNEL染色，苏木精染剂复染1 min，1%盐酸乙醇分化，自来水返蓝，再依次进行脱水、透明、封片，观察TUNEL染色情况。

1.4 统计学处理

采用GraphPad 9.0软件进行数据可视化，SPSS 23.0统计学软件分析数据。计量资料以均数±标准差表示。组间比较采用单因素方差分析，事后两两比较采用Tukey检验。所有检验均为双尾检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 DGP伴随有细胞自噬激活

免疫荧光实验显示，雷帕霉素组和高糖组LC3蛋白明显多于对照组(图1)，表明自噬激活剂和高糖环境可上调LC3表达。经单因素方差分析验证，对照组、高糖组、雷帕霉素组的LC3 II/I比值(F=56.310，P=0.001)、Beclin-1(F=7.446，P=0.005)、p62(F=7.289，P=0.025)差异均有统计学意义，高糖组、雷帕霉素组LC3 II/LC3 I比值(均P=0.001)和Beclin-1(分别P=0.047，P=0.029)均高于对照组，而p62低于对照组(分别P=0.038，P=0.037；图2)。

2.2 自噬促进GSMCs死亡

对照组、高糖组、雷帕霉素组凋亡率分别为(4.19±0.83)%、(13.25±1.64)%、(13.99±1.95)%，经方差分析，3组凋亡率差异有统计学意义(F=24.900， P=0.001)，其中高糖组和雷帕霉素组细胞凋亡率均显著高于对照组(均P<0.01)。锥虫蓝染色结果显示高糖组和雷帕霉素组锥虫蓝阳性细胞均高于对照组(均P<0.001，图3)，雷帕霉素组锥虫蓝阳性细胞略高于高糖组，但差异无统计学意义(P>0.05)。

CCK-8实验表明，对照组细胞存活率为(99.05±10.25)%，高糖组为(52.15±8.13)%，雷帕霉素组为(48.69±7.38)%，经方差分析，3组细胞存活率差异有统计学意义(F=31.540，P<0.001)，高糖组和雷帕霉素组细胞存活率均低于对照组(均P<0.01，图4)。

3组Bcl-2(F=13.690，P=0.006)、Bax(F=6.913，P=0.028)、cleaved caspase-3(F=7.504，P=0.023)表达差异均有统计学意义，高糖组和雷帕霉素组的Bax、cleaved caspase-3蛋白水平均高于对照组(均P<0.05)，高糖组和雷帕霉素组Bcl-2蛋白水平均低于对照组(均P<0.05，图5)。

2.3 LC3促进SIRT1降解

对照组SIRT1蛋白相对表达量为0.78±0.10，高糖组为0.29±0.04，高糖+3-MA组为0.75±0.10，差异有统计学意义(F=20.090，P=0.002)，其中高糖组SIRT1蛋白低于对照组(P<0.01)，而高糖+3-MA组SIRT1蛋白高于高糖组(P<0.01，图6)。

Co-IP结果显示，GFP组Input泳道出现SIRT1蛋白条带，IgG和GFP泳道无SIRT1蛋白，而GFP-LC3组中Input和GFP泳道出现SIRT1蛋白，IgG组无SIRT1蛋白，表明SIRT1可与GFP标记的LC3蛋白相互作用。对照组、高糖组、高糖+3-MA组细胞质SIRT1(F=22.140，P=0.002)及细胞核SIRT1(F=15.260，P=0.004)差异均有统计学意义；高糖组与对照组相比，细胞核SIRT1蛋白水平下调(P<0.01)，细胞质SIRT1蛋白水平上调(P<0.01)；高糖+3-MA组与高糖组相比，细胞核SIRT1蛋白水平上调(P<0.05)，细胞质SIRT1蛋白水平下调(P<0.01，图7)。本研究应用定点突变技术构建SIRT1突变体，即W221A和W224A。Co-IP结果表明SIRT1突变体减弱了LC3-SIRT1的相互作用。

进一步研究表明SIRT1突变体抑制高糖诱导的SIRT1核质易位(图7D)。蛋白质稳定性实验显示，在正常糖浓度下，SIRT1野生型与SIRT1突变体的蛋白降解速率相近，而在高糖条件下SIRT1野生型的降解速率增加(图8)。由此可见，在高糖状况下，LC3-SIRT1相互作用驱动SIRT1核质易位，继而通过募集自噬溶酶体系统促进SIRT1在细胞质中的降解。

2.4 LC3介导的自噬通过诱导SIRT1降解促进高糖下GSMCs死亡

qPCR检测转染效果后发现si-SIRT1-1的RNA干扰效果最佳，因此最终选择si-SIRT1-1作为SIRT1特异性siRNA。随后，使用SIRT1特异性siRNA敲低SIRT1在GSMCs中的表达，蛋白质印迹法检测结果证实SIRT1 siRNA转染成功(图9)。

高糖组凋亡率为(14.63±1.25)%，高糖+3-MA组为(6.15±1.25)%，高糖+3-MA+si-NC组为(5.98±1.36)%，高糖+3-MA+si-SIRT1组为(11.50±1.14)%，差异有统计学意义(F=22.930，P<0.001)。高糖+3-MA组细胞凋亡率低于高糖组(P<0.01)，高糖+3-MA+si-SIRT1组细胞凋亡率高于高糖+3-MA+si-NC组(P<0.01)。4组SIRT1、Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3水平差异均有统计学意义(分别F=13.150，P=0.002；F=24.730，P<0.001；F=13.050，P=0.002；F=10.410，P=0.004)。高糖+3-MA组Bax和cleaved caspase-3水平均显著低于高糖组(均P<0.05)，SIRT1、Bcl-2水平均高于高糖组(均P<0.01)，高糖+3-MA+si-SIRT1组Bax和cleaved caspase-3水平均高于高糖+3-MA+si-NC组(均P<0.05)，SIRT1、Bcl-2水平均低于高糖+3-MA+si-NC组(均P<0.01)。锥虫蓝染色结果显示，高糖+3-MA组锥虫蓝阳性细胞率低于高糖组(P<0.001)，高糖+3-MA+si-SIRT1组锥虫蓝阳性细胞率高于高糖+3-MA+si-NC组(P<0.001，图10)。

高糖组、高糖+3-MA组、高糖+3-MA+si-NC组、高糖+3-MA+si-SIRT1组细胞存活率分别为(51.58±7.19)%、(85.79±6.73)%、(83.18±7.15)%、(61.78±5.92)%。经方差分析，4组存活率差异有统计学意义(F=17.480，P<0.001)，高糖+3-MA组存活率高于高糖组(P<0.01)，高糖+3-MA+si-SIRT1组存活率低于高糖+3-MA+si-NC组(P<0.05，图11)。

2.5 LC3介导的自噬通过SIRT1促进大鼠DGP

阴性对照组、正常组、模型组、模型+3-MA组血糖、体重、胃内色素残留率及肠道推进率差异均有统计学意义(均P<0.01)，模型组血糖、胃内色素残留率均高于阴性对照组(均P<0.05)，体重、肠道推进率均低于阴性对照组(均P<0.05)，模型+3-MA组血糖、胃内色素残留率均低于模型组(均P<0.05)，体重、肠道推进率均高于模型组(均P<0.05，表1)。

阴性对照组、正常组、模型组、模型+3-MA组的SIRT1、Bax、Bcl-2、cleaved caspase-3的蛋白水平差异均有统计学意义(分别F=8.121，P=0.008；F=7.016，P=0.013；F=6.846，P=0.013；F=7.558，P=0.010)，其中模型组的Bax及cleaved caspase-3水平均高于阴性对照组(P<0.05)，SIRT1和Bcl-2水平均低于阴性对照组(均P<0.05)，模型+3-MA组的Bax和cleaved caspase-3水平均低于模型组(均P<0.05)，SIRT1和Bcl-2水平均高于模型组(均P<0.05)。TUNEL染色结果显示，模型组TUNEL阳性细胞多于阴性对照组，模型+3-MA组TUNEL阳性细胞少于模型组(图12)。

3 讨 论

DGP是常见的糖尿病并发症，伴随GSMCs凋亡。研究^[14-17]表明高糖环境可导致GSMCs产生氧化应激，并引起钙流及代谢异常，从而促进细胞凋亡。本研究结果显示，高糖下GSMCs凋亡率显著增加，细胞存活率降低。高糖也引起GSMCs中Bax水平上调、Bcl-2水平降低、caspase-3裂解并活化。由此可见，高糖环境可导致GSMCs死亡。

细胞通过自噬以清除受损的细胞器或细胞^[18-19]。LC3是细胞自噬的关键组分，本研究结果表明在DGP中LC3 II上调。高糖状况下LC3 II/LC3 I比值及Beclin-1水平升高，表明高糖可激活GSMCs自噬。病理状况下细胞自噬可能过度激活，从而加剧细胞死亡^[20-21]。本研究结果显示高糖可诱导GSMCs死亡，而细胞自噬抑制剂3-MA逆转这一变化。动物实验进一步证实3-MA可有效改善DGP大鼠血糖水平升高、体重减轻、胃排空功能障碍，并抑制细胞凋亡，提示高糖环境能通过激活自噬促进GMSCs凋亡，从而促进胃轻瘫。

SIRT1是糖尿病及其并发症的重要调控因子，上调SIRT1水平能抑制高血糖诱导的细胞凋亡，缓解糖尿病症状^{[22, 23]}。既往研究^{[10, 24]}表明，SIRT1在DGP动物模型胃组织中表达下调，而上调SIRT1表达后胃排空功能有所改善。本研究结果显示SIRT1在高糖处理的GSMCs中表达下调，表明GSMCs凋亡与SIRT1表达下调有关。随后，本研究进一步探究了导致SIRT1表达下调的原因。SIRT1可在核质间穿梭，然而细胞质SIRT1易受自噬-溶酶体系统降解^[25]。研究^[11]表明，细胞自噬标志物LC3与SIRT1结合后可驱动SIRT1核质易位，继而促进自噬-溶酶体系统对SIRT1的降解作用。本研究结果显示高糖导致细胞核SIRT1表达下调及细胞质SIRT1表达上调，并引起SIRT1总体蛋白质水平降低，而细胞自噬抑制剂3-MA逆转了以上趋势，表明高糖可通过激活细胞自噬促进SIRT1的核质易位，并导致SIRT1蛋白降解。随后，本研究针对LC3-SIRT1相互作用位点构建SIRT1突变体，并发现在高糖诱导的GSMCs中LC3 II可与SIRT1相互作用，SIRT1突变体逆转了这种相互作用；同时SIRT1突变体也抑制了高糖诱导的SIRT1核质易位。由此可见，高糖通过LC3-SIRT1相互作用促进SIRT1核质易位，从而促进SIRT1表达下调。进一步研究显示，在高糖环境下SIRT1表达下调能逆转3-MA对GSMCs凋亡的抑制作用。由此可见，高糖以LC3 II依赖性方式促进SIRT1表达下调，继而诱导GSMCs凋亡，促进DGP的进展。

本研究存在诸多不足之处：1)胃起搏单元由Cajal间质细胞和平滑肌细胞组成^[26]，高糖可能引起Cajal间质细胞异常，然而本研究未阐明Cajal间质细胞在其中的具体作用；2)SIRT1通过促进靶蛋白去乙酰化调控糖尿病及其并发症的发生，本研究侧重于阐明SIRT1在DGP中表达下调的原因，但未进一步探究SIRT1在DGP中的去乙酰化靶点。鉴于上述局限性，后续研究将重点探究SIRT1的靶蛋白，同时以Cajal间质细胞和平滑肌细胞为研究对象，进一步完善SIRT1对DGP的调控网络。此外，本研究结论主要基于对自噬关键蛋白的静态分析，未来研究可采用GFP-LC3等荧光示踪系统监测自噬流的动态变化，以期提供更直观的证据。

综上所述，本研究证实糖环境下LC3通过促进SIRT1降解加剧GSMCs死亡。本研究从自噬角度探究了高血糖对胃动力的调控机制，增进了对糖尿病并发症的认识，并为DGP的治疗提供了潜在的靶点。

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基金资助

湖南省自然科学基金(2022JJ70026)

湖南中医药大学校院联合基金(2025XYLH058┫。This work was supported by the Natural Science Foundation of Hunan Province ┣2022JJ70026)

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