miR-34a靶向MTUS1调控大鼠心肌纤维化

miR-34a targets MTUS1 to regulate cardiac fibrosis in rats

摘要

目的 心肌纤维化是多种心血管疾病进展过程中常见的病理改变，其主要特征为心肌间质中细胞外基质(extracellular matrix，ECM)过度沉积，并伴随心脏结构和功能异常。微RNA(microRNA，miRNA)在心肌纤维化相关调控过程中发挥重要作用。已有研究提示miR-34a参与调控心肌纤维化相关病理过程，但其在体内条件下对心肌纤维化及心功能的影响，以及其与微管相关肿瘤抑制因子1(mitochondrial tumor suppressor 1，MTUS1)之间的关系尚不明确。本研究旨在通过体内试验探讨miR-34a靶向MTUS1对大鼠心肌纤维化及心功能改变的影响。 方法 选取健康成年雄性SD大鼠，采用异丙肾上腺素(isoproterenol，ISO)皮下注射建立心肌纤维化模型(模型组)，给药剂量为 10 mg/(kg·d)，连续14 d，对照组给予等体积生理盐水。采用经胸超声心动图(transthoracic echocardiography，TTE)检测心脏结构和功能变化。取左心室组织制备石蜡切片，采用苏木精-伊红(hematoxylin-eosin，HE)染色观察心肌组织结构改变，Masson染色评估胶原沉积情况。采用实时聚合酶链反应(real-time PCR)和蛋白质印迹法检测miR-34a、MTUS1及纤维化相关蛋白α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)和I型胶原(collagen I)的表达水平。利用生物信息学方法预测miR-34a与MTUS1的潜在结合位点，并通过双荧光素酶报告基因实验验证二者之间的靶向关系。进一步采用腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV)在体内下调miR-34a及MTUS1的表达，评估其对心功能及心肌纤维化的影响。 结果 ISO处理后，大鼠心肌组织出现明显纤维化相关病理改变。HE染色显示心肌细胞排列紊乱、间质增宽，Masson染色显示胶原纤维沉积增加。TTE检测结果显示，模型组左心室射血分数较对照组下降 (P<0.05)。与对照组相比，模型组心肌组织中miR-34a表达上调，MTUS1表达下调，α-SMA和collagen I蛋白质表达水平升高(均P<0.05)。双荧光素酶报告基因实验结果表明，miR-34a可直接与MTUS1 3'非翻译区结合并抑制其表达。AAV介导下调miR-34a表达后，大鼠心肌纤维化程度减轻，胶原沉积减少，心功能指标较模型组改善；在同时下调MTUS1表达的条件下，上述改善作用发生相应变化。 结论 在ISO诱导的大鼠心肌纤维化模型中，miR-34a可通过靶向MTUS1参与调控心肌纤维化相关病理过程及心功能改变。体内AAV干预结果提示miR-34a-MTUS1调控轴与心肌纤维化的发展相关。

Abstract

Objective Cardiac fibrosis is a common pathological feature during the progression of various cardiovascular diseases and is characterized by excessive deposition of extracellular matrix (ECM) in the myocardial interstitium, accompanied by alterations in cardiac structure and function. MicroRNAs (miRNAs) play important roles in the regulation of cardiac fibrosis. Previous studies have suggested that miR-34a is involved in fibrotic processes; however, its in vivo effects on cardiac fibrosis and cardiac function, as well as its relationship with mitochondrial tumor suppressor 1 (MTUS1), remain unclear. This study aimed to investigate the effects of miR-34a targeting MTUS1 on cardiac fibrosis and cardiac function in rats through in vivo intervention. Methods Healthy adult male Sprague-Dawley (SD) rats were used to establish a myocardial fibrosis model by subcutaneous injection of isoproterenol (ISO) at a dose of 10 mg/(kg·d) for 14 consecutive days (model group), while the control group received equal volumes of normal saline. Transthoracic echocardiography (TTE) was performed to evaluate cardiac structural and functional changes. Left ventricular tissues were collected and paraffin sections were prepared. Hematoxylin-eosin (HE) staining was used to observe histological changes in myocardial tissue, and Masson staining was used to assess collagen deposition. Real-time polymerase chain reaction (real-time PCR) and Western blotting were performed to detect the expression levels of miR-34a, MTUS1, and fibrosis-related proteins including α-smooth muscle actin (α-SMA) and collagen I. Bioinformatics analysis was used to predict potential binding sites between miR-34a and MTUS1. A dual-luciferase reporter assay was performed to verify the targeting relationship between miR-34a and MTUS1. Furthermore, adeno-associated virus (AAV) was used in vivo to downregulate the expression of miR-34a and MTUS1, and the effects on cardiac function and myocardial fibrosis were evaluated. Results ISO-treated rats exhibited pronounced myocardial fibrotic changes. HE staining revealed disorganized myocardial fibers and widened interstitial spaces, and Masson staining demonstrated increased collagen deposition. TTE analysis showed that left ventricular ejection fraction was reduced in the model group compared with the control group (P<0.05). Compared with control rats, ISO-treated rats showed increased miR-34a expression and decreased MTUS1 expression in myocardial tissues, accompanied by elevated protein levels of α-SMA and collagen I (all P<0.05). Dual-luciferase reporter assays demonstrated that miR-34a directly bound to the 3' untranslated region of MTUS1 and suppressed its expression. AAV-mediated downregulation of miR-34a attenuated myocardial fibrosis, reduced collagen deposition, and improved cardiac functional parameters compared with the model group; these effects were correspondingly altered when MTUS1 expression was concurrently modulated. Conclusion In an ISO-induced rat model of cardiac fibrosis, miR-34a participates in the regulation of myocardial fibrosis and cardiac functional alterations by targeting MTUS1. The in vivo AAV intervention results suggest that the miR-34a-MTUS1 regulatory axis is associated with the progression of cardiac fibrosis.

Graphical abstract

关键词

心肌纤维化 / miR-34a / 微管相关肿瘤抑制因子1 / 腺相关病毒 / 经胸超声心动图 / 心功能

Key words

cardiac fibrosis / miR-34a / mitochondrial tumor suppressor 1 / adeno-associated virus / transthoracic echocardiography / cardiac function

心肌纤维化是多种心血管疾病进展过程中常见的病理改变，其主要特征为心肌间质中细胞外基质异常沉积，导致心肌结构重塑并影响心脏功能^[1-3]。持续的心肌纤维化可进一步促进心力衰竭等不良心血管事件的发生^[4-5]。因此，阐明其发生、发展的分子调控机制具有重要意义。近年来，微RNA(microRNA，miRNA)被认为在心血管疾病相关病理过程中发挥重要调控作用。多项研究^[6-8]表明，miRNA通过调控成纤维细胞活化、细胞外基质(extracellular matrix，ECM)沉积及炎症反应等过程，参与心肌纤维化的发生与发展。

miR-34a作为一类与心血管病理过程相关的miRNA，与心肌纤维化、心肌细胞凋亡、心脏重塑等过程有关^[9]。然而，miR-34a在心肌纤维化中的作用及其下游靶基因仍有待进一步明确。微管相关肿瘤抑制因子1(mitochondrial tumor suppressor 1，MTUS1)在细胞增殖和信号转导调控中发挥作用^[10]。研究^[11-12]表明，MTUS1及其剪接变体在心肌肥厚及心肌梗死后心脏重构中发挥重要调控作用，主要涉及血管紧张素信号或线粒体-内质网功能维持。然而，心肌纤维化作为心脏重构的重要病理基础，其分子调控机制与心肌肥厚或缺血损伤并不完全一致。目前尚缺乏关于MTUS1在心肌纤维化过程中的功能证据，尤其是其是否受到miRNA介导的转录后调控仍不清楚。本研究聚焦miR-34a与MTUS1的调控关系，探讨其在ISO诱导心肌纤维化中的作用，旨在为理解心肌纤维化的分子机制提供新的视角。

1 材料与方法

1.1 伦理声明

本研究已通过中南大学湘雅医院医学伦理委员会批准(审批号：2019030560)，所有实验设计与操作均遵循国际疼痛学会(International Association for the Study of Pain，IASP)的动物实验伦理准则。

1.2 实验动物

180~220 g成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司。动物饲养于中南大学湘雅医院实验动物部，环境温度23~25 ℃，相对湿度50%~60%，光照条件为12 h明暗交替，自由摄食标准饲料并饮用清洁自来水。实验前适应性饲养1周。

1.3 心肌纤维化模型的建立及动物分组

参照既往研究^[13-14]方法建立异丙肾上腺素(isoproterenol，ISO)诱导的大鼠心肌纤维化模型。大鼠腹部剃毛并消毒后，以10 mg/(kg·d)的剂量皮下注射ISO(上海陶素生化科技有限公司，货号T1056)，连续给药14 d，建立心肌纤维化模型。对照(Control)组大鼠注射等体积生理盐水。

采用计算机随机数字表法对大鼠进行分组，并根据不同实验目的开展实验，所有实验操作及结果评估均在盲法条件下完成。第1部分实验分为2组：Control组和ISO组。第2部分实验分为4组：Control组、ISO组、ISO+miR-34a阴性对照(ISO+miR-34a-NC)组和ISO+miR-34a抑制[ISO+miR-34a inhibition(miR-34a-inh)]组。第3部分实验分为4组：ISO组、ISO+miR-34a抑制(ISO+miR-34a-inh)组、ISO+miR-34a抑制+MTUS1阴性对照(ISO+miR-34a-inh+MTUS1-NC)组和ISO+miR-34a抑制+MTUS1下调[ISO+ miR-34a-inh+MTUS1 knockdown(MTUS1-KD)]组。

1.4 腺相关病毒干预

采用心肌内注射腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV)进行体内基因干预。采用AAV-miR-34a sponge(miR-34a-inh)进行miR-34a抑制；采用携带针对MTUS1的干扰序列/下调元件的AAV(MTUS1-KD)进行MTUS1下调；相应阴性对照病毒分别为miR-34a NC及MTUS1-NC。病毒由上海吉凯基因医学科技股份有限公司提供，滴度均为7.5×10¹² vg/mL。所有AAV均于ISO建模前21 d完成心肌内注射(每只大鼠为1×10¹¹ vg)，以保证病毒稳定表达。心肌切片置于荧光显微镜下，观察AAV载体携带的增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein，EGFP)报告基因信号以评估转染情况。EGFP信号采用绿色荧光蛋白/异硫氰酸荧光素(green fluorescent protein/fluorescein isothiocyanate，GFP/FITC)通道采集(激发波长为488 nm，发射波长为507~530 nm)。

1.5 心脏取材

实验结束后，大鼠在麻醉状态下迅速开胸，经心尖部灌注生理盐水以去除残余血液。取出心脏后置于预冷生理盐水中冲洗以去除残余血液，沿房室交界处切除心房，仅保留心室部分。以左心室作为主要分析对象。取左心室中段(乳头肌水平)心肌组织用于组织学检测。心脏组织经4%多聚甲醛固定液固定24~48 h后，按常规流程脱水、透明并进行石蜡包埋。包埋后的心脏组织沿心脏短轴方向连续切片，切片厚度为4~5 μm。用于组织学染色的切片均来源于相同解剖水平的连续切片，以保证不同染色结果之间的可比性。同时，选取左心室组织液氮速冻后置于-80 ℃保存，用于蛋白质和RNA检测。

1.6 组织学染色

为明确ISO处理是否成功诱导心肌纤维化，对心肌组织结构及心功能进行评估。固定后的心脏组织经常规脱水、透明、石蜡包埋及切片处理，切片厚度为5 μm。采用苏木精-伊红(hematoxylin-eosin，HE)染色观察心肌组织结构变化，Masson染色评估心肌胶原沉积情况。在光学显微镜下观察染色切片，并采集图像用于分析。

1.7 经胸超声心动图

采用Vivid E7 小动物超声系统(美国GE公司)进行经胸超声心动图(transthoracic echocardiography，TTE)检测。大鼠在异氟烷吸入麻醉下取仰卧位，获取左心室短轴M型图像，连续记录不少于10个心动周期。测量舒张末期容积(end-diastolic volume，EDV)、收缩末期容积(end-systolic volume，ESV)、每搏输出量(stroke volume，SV)、左心室舒张末期内径(left ventricular internal diameter at diastole，LVIDd)及收缩末期内径(left ventricular internal diameter at systole，LVIDs)、左心室收缩期后壁厚度(left ventricular posterior wall thickness at systole，LVPWs)及舒张期后壁厚度(left ventricular posterior wall thickness at diastole，LVPWd)、左心室射血分数(ejection fraction，EF)、缩短分数(fractional shortening，FS)、心输出量(cardiac output，CO)，用于评估心脏结构和功能变化。所有参数取连续3个心动周期的平均值，每组检测4只动物。

1.8 蛋白质印迹法

取左心室组织提取总蛋白质，采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)分离蛋白质并转膜至聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride membrane，PVDF)。分别检测α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA；稀释比1꞉1 000)、I型胶原(collagen I；稀释比1꞉1 000)及MTUS1(稀释比1꞉2 000)的蛋白质表达水平，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH；稀释比1꞉1 000)作为内参。采用增强化学发光法(enhanced chemiluminescence，ECL)显影并进行灰度值分析。

1.9 实时聚合酶链反应

实时聚合酶链反应(real-time PCR)引物由美国GeneCopoeia公司提供，包括rno-mir-34a-5p(RmiRQP0440)、U6(RmiRQP9003)、GAPDH (RQP049537)、MTUSl(RQP053351)和collagen I(RQP054226)。采用TRIzol法提取左心室组织总RNA，反转录为互补DNA(complementary DNA，cDNA)后进行实时聚合酶链反应(real-time PCR)，检测miR-34a和MTUS1的表达水平。miR-34a以内参U6进行标准化，MTUS1以内参GAPDH进行标准化，采用2^-ΔΔCt计算MTUS1相对表达量。

1.10 双荧光素酶报告基因实验

通过生物信息学方法预测miR-34a与MTUS1的潜在结合位点，构建含MTUS1 3'非翻译区(3' untranslated region，3'UTR)野生型及突变型序列的荧光素酶报告载体。采用双荧光素酶报告基因实验检测荧光素酶活性变化，以验证miR-34a与MTUS1之间的靶向关系。

1.11 统计学处理

所有数据均采用GraphPad Prism 9.0软件进行统计与分析。数据以均数±标准差表示。2组连续变量间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析(one-way analysis of variance，one-way ANOVA)，若ANOVA检验结果差异具有统计学意义，进一步采用Student-Newman-Keuls(SNK)法进行两两比较。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 ISO诱导心肌纤维化模型的形态结构及心功能改变

HE染色和Masson染色(图1A)结果显示，与Control组相比，ISO组大鼠心肌胶原纤维明显增多，心肌细胞肥大且排列紊乱。Masson染色下ISO组的左心室胶原容积分数(collagen volume fraction，CVF)较Control组显著升高(P<0.01，图1B)。蛋白质印迹法结果(图1C和1D)显示，ISO组左心室心肌组织中的α-SMA和collagen I蛋白质水平较Control组均明显上调(均P<0.05)，表明心肌纤维化模型构建成功。

TTE检测结果(图2A)显示，ISO处理后大鼠心脏结构和功能均发生明显改变。与Control组相比，ISO组SV明显降低(P<0.05)，EDV、ESV的差异均无统计学意义(均P>0.05，图2B)。结构参数LVIDd、LVIDs、LVPWs及LVPWd的差异均无统计学意义(均P>0.05，图2C)。功能方面，ISO组EF、FS及CO均较Control组显著降低(均P<0.05，图2D和2E)，提示心室收缩功能和泵血能力受损。

2.2 miR-34a在心肌纤维化心脏中的表达变化及抑制后对纤维化的影响

Real-time PCR结果显示，ISO组大鼠左心室组织中miR-34a表达水平显著高于Control组(P<0.05；附图1A，https://doi.org/10.57760/sciencedb.xbyxb.00098)。构建的miR-34a-inh AAV结构如附图1B~1C(https://doi. org/10.57760/sciencedb.xbyxb.00098)所示。与未注射病毒的对照心脏相比，免疫荧光显示AAV可以在心肌细胞表达，其荧光强度显著增高(P<0.05)，心肌组织中可见明显绿色荧光信号(附图1D~1E，https://doi.org/10.57760/sciencedb.xbyxb.00098)，提示病毒转染成功。

HE染色(图3A)和Masson染色(图3B)结果显示，miR-34a抑制后心肌纤维化程度明显减轻，胶原沉积减少，心肌纤维化减轻。CVF定量分析结果进一步证实，miR-34a抑制显著降低左心室CVF(P<0.05，图3C)。同时，ISO+miR-34a-inh组miR-34a表达水平显著低于ISO组及ISO+miR-34a-NC组(均P<0.01，图3D)，表明抑制miR-34a可减轻心肌纤维化。

2.3 miR-34a 抑制可降低心肌纤维化相关蛋白表达并改善心功能

蛋白质印迹法结果显示，与ISO组及ISO+miR-34a-NC组相比，ISO+miR-34a-inh组左心室组织中α-SMA和collagen I的蛋白质表达水平均显著降低(均P<0.05，图4A~4C)。TTE检测结果显示，miR-34a抑制可部分逆转ISO诱导的心功能下降(图4D)。与ISO组及ISO+miR-34a-NC组相比，ISO+miR-34a-inh组SV明显升高(均P<0.05，图4E)，EF和FS显著改善(均P<0.05，图4G)，CO亦明显升高(均P<0.05，图4H)。

2.4 miR-34a可直接靶向MTUS1并负向调控其表达

TargetScan预测结果(图5A)显示，miR-34a与MTUS1 3'UTR存在潜在互补结合位点。双荧光素酶报告基因实验结果(图5B)表明，过表达miR-34a可显著抑制MTUS1-wt的荧光素酶活性，而下调miR-34a则显著增强其活性(均P<0.01)；上述效应在MTUS1-mut载体中未见明显变化。Real-time PCR结果显示ISO诱导心肌纤维化过程中MTUS1 mRNA表达显著下调(P<0.05，图5C)。在体内抑制miR-34a后，MTUS1 mRNA及蛋白质表达水平均明显上调(均P<0.05，图5D~5F)，提示miR-34a对MTUS1具有负向调控作用。

2.5 MTUS1下调削弱miR-34a抑制对心肌纤维化的改善作用

在miR-34a抑制基础上下调MTUS1后，HE和Masson染色结果(图6A~6C)显示，心肌纤维化程度加重，胶原沉积增加，CVF明显回升(P<0.05)。蛋白质印迹法结果(图6D~6F)显示，miR-34a抑制所致 α-SMA和collagen I表达降低在MTUS1下调后被部分逆转(均P<0.01)。

TTE检测结果(图7A~7E)显示，miR-34a抑制对SV、EF、FS及CO的改善作用在MTUS1下调后明显减弱，上述心功能指标再次下降(均P<0.05)。

3 讨 论

本研究基于ISO诱导的大鼠心肌纤维化体内模型，从整体水平、分子靶向验证及功能因果关系3个层面系统探讨了miR-34a/MTUS1轴在心肌纤维化中的作用机制。首先，在体内条件下证实miR-34a在心肌纤维化心脏中显著上调，而MTUS1表达明显下调，并伴随心肌结构重构及心功能减退，明确了二者在心肌纤维化背景下的表达特征。其次，通过生物信息学预测结合双荧光素酶报告基因实验，证实miR-34a可直接靶向MTUS1的3'UTR，从分子层面明确了二者之间的直接调控关系。最后，借助AAV介导的体内干预手段，本研究进一步证明下调MTUS1可显著削弱miR-34a抑制所产生的抗纤维化效应，建立了miR-34a→MTUS1→心肌纤维化与心功能改变之间的因果关联。

这些结果共同表明，miR-34a/MTUS1构成一条参与调控心肌纤维化的重要分子轴，为MTUS1在心肌纤维化领域的功能提供了新的体内证据。ISO是常用于构建心肌纤维化动物模型的β肾上腺素能受体激动剂，其通过诱导心肌细胞应激、氧化损伤及凋亡，进而促进心肌间质重构和胶原沉积^{[11, 13-15]}。本研究中，连续14 d ISO处理后，大鼠左心室组织出现明显的心肌细胞排列紊乱、细胞肥大及胶原纤维沉积增加。Masson染色定量分析显示左心室CVF显著升高，蛋白质印迹法结果显示α-SMA和collagen I的蛋白质表达明显上调。同时，TTE检测发现ISO组大鼠EF、FS、SV及CO均显著下降，提示心脏收缩功能受损。这些结果表明本研究成功构建了形态学和功能学特征一致的心功能减退型心肌纤维化模型，与既往研究^[15-16]结果一致。

miRNA作为一类重要的转录后调控因子，在心血管疾病发生、发展中发挥关键作用^[17]。既往研究^{[6, 9, 12, 18-19]}表明，miR-34a在心肌梗死、心肌肥厚及心力衰竭等多种病理状态下被激活，并参与调控心肌细胞凋亡、应激反应及间质重构过程。本研究进一步证实，在ISO诱导的心肌纤维化模型中，miR-34a表达显著上调。通过AAV介导的体内抑制实验发现，下调miR-34a可显著减轻心肌纤维化程度，降低胶原沉积和α-SMA、collagen I的表达，并明显改善EF、FS、SV及CO等心功能参数，提示miR-34a在心肌纤维化过程中具有促纤维化作用。

既往研究提示，miR-34a可通过调控TGF-β1/Smad信号通路^[20]、抑制c-Ski^[6]等分子，促进心肌成纤维细胞活化及ECM沉积。本研究结果与上述结果一致，并进一步从靶基因层面揭示了miR-34a介导心肌纤维化的重要分子基础。为阐明miR-34a的下游作用机制，本研究明确鉴定MTUS1为其直接靶基因。双荧光素酶报告基因实验显示，miR-34a可特异性结合 MTUS1的3'UTR并抑制其转录活性，而突变结合位点后该作用消失。在体内试验中，ISO诱导心肌纤维化过程中MTUS1 mRNA和蛋白质水平均显著下降，而抑制miR-34a可恢复MTUS1的表达，提示miR-34a通过转录后调控方式抑制MTUS1的表达。

MTUS1作为微管相关蛋白，已被报道在肿瘤发生、心肌肥厚及缺血性心脏病中发挥重要调控作用，主要涉及血管紧张素Ⅱ型受体(angiotensin II type 2 receptor，AT2R)信号、细胞增殖及氧化应激调控^{[11-12, 21-23]}。然而，其在心肌纤维化中的作用尚缺乏直接证据。本研究发现，抑制MTUS1可显著削弱 miR-34a抑制所产生的抗纤维化效应，表现为胶原沉积增加、α-SMA和collagen I表达上调，以及心功能指标(EF、FS、CO)下降，表明MTUS1是miR-34a介导心肌纤维化的重要功能靶点。

结合既往研究及本研究结果，笔者推测miR-34a/MTUS1轴可能通过多种机制参与心肌纤维化的发生、发展。一方面，MTUS1被认为是AT2R信号通路的重要调控因子，其表达下调可能削弱AT2R介导的抗纤维化保护效应，从而间接促进心肌间质细胞活化及胶原沉积。另一方面，miR-34a与TGF-β1/Smad信号通路之间存在交互作用，miR-34a上调可能增强促纤维化信号转导，而MTUS1下调是否进一步放大该效应，仍有待后续实验加以验证。此外，MTUS1在氧化应激调控及细胞凋亡中的潜在作用亦提示，miR-34a介导的MTUS1抑制可能通过影响心肌细胞应激反应，加速心肌损伤与纤维化进程。

上述机制的具体分子通路及相互作用关系仍需通过进一步的功能实验和信号通路分析予以阐明。本研究还从功能学层面证实，抑制miR-34a可显著改善心肌纤维化所致的心功能减退，而MTUS1下调可逆转这一改善效应，提示miR-34a对心功能的调控主要依赖MTUS1介导。该发现进一步强化了miR-34a/MTUS1轴在心肌结构与功能重构中的关键作用。

本研究仍存在一定局限性。首先，研究主要基于动物模型，尚缺乏临床样本验证miR-34a与MTUS1表达变化的临床相关性；其次，MTUS1下游信号通路尚未进行深入解析；最后，miR-34a具有多靶点调控特性，其在心肌纤维化中的完整调控网络仍需进一步研究。

综上所述，本研究表明miR-34a在心肌纤维化过程中高表达，通过直接靶向抑制MTUS1促进心肌纤维化进展。抑制miR-34a可减轻心肌纤维化程度并改善心功能，而MTUS1下调可逆转上述保护效应。miR-34a/MTUS1调控轴在心肌纤维化发生、发展中具有重要作用，为心肌纤维化的分子机制研究及潜在干预策略提供了新的实验依据。

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基金资助

湖南省自然科学基金(2024JJ6652)

湖南省自然科学基金(2025JJ50554)

长沙市自然科学基金(kq2403005┫。This work was supported by the Natural Science Foundation of Hunan Province ┣2024JJ5574)

长沙市自然科学基金(2025JJ50554)

the Changsha Natural Science Foundation(kq2403005)

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