SESN2对Erastin诱导的肾小管细胞铁死亡和急性肾损伤的保护作用

Protective effects of SESN2 on Erastin-induced ferroptosis in renal tubular cells and acute kidney injury

摘要

目的 如何防治围手术期常发生的急性肾损伤(acute kidney injury，AKI)一直是临床实践关注的核心。本研究旨在探讨应激诱导蛋白2(sestrin2，SESN2)在铁死亡诱导剂Erastin诱导的肾小管细胞铁死亡和ICR小鼠AKI中的作用及机制。 方法 体外试验方面，采用稳定转染慢病毒的人肾皮质近曲小管上皮细胞HK-2，分为体外对照组、Erastin体外模型组、SESN2体外干预组3组。体外对照组采用空载体慢病毒LV-Con进行转染；Erastin体外模型组转染LV-Con后给予10 μmol/L的Erastin，处理24 h；SESN2体外干预组转染SESN2过表达慢病毒LV-SESN2后，同样给予10 μmol/L的Erastin进行处理。体内试验方面，通过检测血肌酐(serum creatinine，SCr)和血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)水平验证和评估Erastin诱导的AKI小鼠模型的成功建立后，将18只健康成年ICR雄性小鼠随机分为体内对照组、Erastin体内模型组、SESN2体内干预组3组，每组各6只。体内对照组采用尾静脉注射空载对照病毒AAV9-Con；Erastin体内模型组采用尾静脉注射AAV9-Con，4周后腹腔注射Erastin(30 mg/kg)；SESN2体内干预组采用尾静脉注射SESN2过表达病毒AAV9-Sesn2，4周后腹腔注射Erastin(剂量同Erastin体内模型组)。造模成功24 h后收集血清和肾组织。采用酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)检测细胞和组织的上清液乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)、白细胞介素(interleukin，IL)-6及肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α水平。采用2’,7’-二氯二氢荧光素二乙酸酯(2’,7’-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA)荧光探针法和二氢乙啶(dihydroethidium，DHE)荧光染色法检测活性氧(reactive oxygen species，ROS)的荧光强度。采用比色法检测丙二醛(malondialdehyde，MDA)、谷胱甘肽(glutathione，GSH)、亚铁离子(Fe²⁺)水平；采用膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶(Annexin V-fluorescein isothiocyanate/propidium iodide，Annexin V-FITC/PI)、原位末端转移酶标记法(terminal-deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end labeling，TUNEL)和双染流式细胞术计算细胞凋亡率。采用实时反转录聚合酶链反应(real-time reverse transcription PCR，real-time RT-PCR)及蛋白质印迹法检测SESN2、核转录因子红系2相关因子2(nuclear factor-erythroid 2-related factor 2，Nrf2)、谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase 4，GPX4)和铁死亡抑制蛋白1(ferroptosis suppressor protein 1，FSP1)的mRNA及蛋白质表达情况。 结果 与体外/体内对照组相比，Erastin体外/体内模型组和SESN体外/体内干预组的LDH、IL-6、TNF-α、MDA、ROS、Fe²⁺水平均显著升高，GSH水平显著降低，细胞凋亡率显著增加(均P<0.001)；GPX4、FSP1的mRNA和蛋白质表达水平均显著降低，SESN2及Nrf2的mRNA和蛋白质表达水平均显著升高(均P<0.001)。同时，与Erastin体外/体内模型组相比，SESN2体外/体内干预组中LDH、IL-6、TNF-α、MDA、ROS、Fe²⁺水平均显著降低，GSH水平显著升高，细胞凋亡率显著降低(均P<0.001)，SESN2、Nrf2、GPX4、FSP1的mRNA和蛋白质表达水平均显著升高(均P<0.001)。 结论 SESN2可通过激活Nrf2信号通路，上调铁死亡相关分子GPX4和FSP1的表达，抑制氧化应激、脂质过氧化及炎症反应，从而减轻Erastin诱导的肾小管细胞铁死亡，对铁死亡相关AKI产生保护作用。

Abstract

Objective Prevention and treatment of perioperative acute kidney injury (AKI) remain a major focus in clinical practice. This study aims to investigate the role and underlying mechanism of sestrin2 (SESN2) in Erastin-induced ferroptosis of renal tubular cells and AKI in ICR mice. Methods For in vitro experiments, human renal proximal tubular epithelial cells (HK-2) stably transfected with lentivirus were divided into three groups: control group, Erastin model group, and SESN2 intervention group. The control group was transfected with empty vector lentivirus (LV-Con). The Erastin model group was transfected with LV-Con and then treated with 10 μmol/L Erastin for 24 h. The SESN2 intervention group was transfected with SESN2-overexpressing lentivirus (LV-SESN2) followed by Erastin treatment. For in vivo experiments, after confirming successful establishment of the Erastin-induced AKI mouse model by measuring serum creatinine (SCr) and blood urea nitrogen (BUN), 18 healthy adult male ICR mice were randomly divided into three groups (n=6 per group): control group, Erastin model group, and SESN2 intervention group. The control group received tail vein injection of control virus (AAV9-Con). The Erastin model group received AAV9-Con followed by intraperitoneal injection of Erastin (30 mg/kg) after 4 weeks. The SESN2 intervention group received tail vein injection of SESN2-overexpressing virus (AAV9-Sesn2), followed by Erastin injection at the same dose after 4 weeks. Serum and renal tissues were collected 24 h after modeling. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was used to measure lactate dehydrogenase (LDH), interleukin (IL)-6, and tumor necrosis factor (TNF)-α levels in cell and tissue supernatants. Reactive oxygen species (ROS) levels were assessed using 2’,7’-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA) and dihydroethidium (DHE) fluorescence staining. Malondialdehyde (MDA), glutathione (GSH), and ferrous ion (Fe²⁺) levels were determined by colorimetric assays. Cell apoptosis was calculated using Annexin V-FITC/propidium iodide (PI), terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end labeling (TUNEL) assay, and flow cytometry. The mRNA and protein expression levels of SESN2, nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (Nrf2), glutathione peroxidase 4 (GPX4), and ferroptosis suppressor protein 1 (FSP1) were detected by real-time reverse transcription-polymerase chain reaction (real-time RT-PCR) and Western blotting (WB). Results Compared with the in vitro/in vivo control groups, the Erastin model groups and SESN2 intervention groups showed significantly increased levels of LDH, IL-6, TNF-α, MDA, ROS, and Fe²⁺, along with significantly decreased GSH levels and increased apoptosis rates (all P<0.001). The mRNA and protein expression levels of GPX4 and FSP1 were significantly decreased, whereas those of SESN2 and Nrf2 were significantly increased (all P<0.001). Compared with the Erastin model groups, the SESN2 intervention groups exhibited significantly reduced levels of LDH, IL-6, TNF-α, MDA, ROS, and Fe²⁺, increased GSH levels, and decreased apoptosis rates (all P<0.001). In addition, the mRNA and protein expression levels of SESN2, Nrf2, GPX4, and FSP1 were significantly increased (all P<0.001). Conclusion SESN2 exerts protective effects against Erastin-induced ferroptosis in renal tubular cells and ferroptosis-related AKI by activating the Nrf2 signaling pathway, upregulating ferroptosis-related molecules GPX4 and FSP1, and inhibiting oxidative stress, lipid peroxidation, and inflammatory responses.

Graphical abstract

关键词

应激诱导蛋白2 / 铁死亡诱导剂 / 铁死亡 / 人肾皮质近曲小管上皮细胞 / 急性肾损伤 / 谷胱甘肽过氧化物酶4 / 铁死亡抑制蛋白1

Key words

sestrin2 / ferroptosis inducer / ferroptosis / human renal proximal tubular epithelial cells / acute kidney injury / glutathione peroxidase 4 / ferroptosis suppressor protein 1

急性肾损伤(acute kidney injury，AKI)是围手术期常见的严重并发症之一，具有高发生率和不良预后^[1]的特点。AKI在围手术期各种复杂因素作用下发生，其防治策略一直是临床实践关注的核心。铁死亡是一种以铁离子依赖性脂质过氧化物累积为特征的程序性细胞死亡方式，已被证实广泛参与缺血再灌注损伤^[2]、代谢性损伤^[3]等多种组织器官损伤的病理过程。近年来的研究^[4-5]表明，AKI的发生和进展与细胞内铁离子异常蓄积、活性氧(reactive oxygen species，ROS)暴发、脂质过氧化水平升高及细胞膜完整性破坏等密切相关。

在AKI相关的铁死亡调控机制中，谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase 4，GPX4)的表达量减少被公认为关键标志之一^[6-7]。同时，铁死亡抑制蛋白1(ferroptosis suppressor protein 1，FSP1)可通过与GPX4共同作用，抑制脂质过氧化，从而减缓铁死亡的进程^[8]。应激诱导蛋白2(sestrin2，SESN2)是一种高度保守的内源性抗氧化应激因子，其在铁死亡进程中的保护作用受到广泛关注。研究^[9-10]显示，SESN2可能通过调节铁死亡信号通路减轻肠道及肾脏缺血再灌注损伤。然而，关于SESN2在肾脏铁死亡中的保护作用机制及其是否通过调控GPX4和FSP1来发挥肾脏保护作用，目前尚未明确。因此，本研究采用铁死亡诱导剂Erastin诱导肾小管细胞铁死亡和ICR小鼠AKI，旨在探究SESN2在铁死亡诱导的急性肾损伤中的保护作用，为AKI的防治新策略提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 伦理声明

本研究已获得贵州医科大学实验动物伦理委员会批准(审批号：2304644)。

1.2 细胞、动物与主要试剂

人肾皮质近曲小管上皮细胞HK-2购自武汉普诺赛生命科技有限公司。8~10周龄、体重20~25 g的清洁级ICR雄性小鼠40只，由贵州医科大学实验动物中心提供，实验前于动物房适应性饲养1周。饲养环境及条件：温度22~26 ℃，相对湿度50%~60%，12 h/12 h 明暗循环，自由摄食饮水。

铁死亡诱导剂Erastin购自美国APExBIO Technology LLC公司；非冻型组织RNA保存液(RNASafer Reagent)、HiPure总RNA小提试剂盒(HiPure Total RNA Mini Kit)购自广州美基生物科技有限公司；亚铁离子(Fe²⁺)、还原型谷胱甘肽(glutathione，GSH)比色法测试盒均购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司；细胞丙二醛(malondialdehyde，MDA)测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所有限公司；ROS检测试剂盒购自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司；二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白定量试剂盒购自上海碧云天生物技术股份有限公司；核转录因子红系2相关因子2(nuclear factor-erythroid 2-related factor 2，Nrf2)、GPX4、FSP1一抗购自武汉爱博泰克生物科技有限公司；甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)一抗购自武汉三鹰生物技术有限公司；SESN2一抗、山羊抗兔二抗购自英国Abcam公司；实时反转录聚合酶链反应(real-time reverse transcription PCR，real-time RT-PCR)第一链互补DNA(complementary DNA，cDNA)合成试剂盒购自美国Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养

在含10%胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、100 U/mL青霉素及100 μg/mL链霉素的杜氏改良Eagle培养基(Dulbecco’s modified Eagle medium，DMEM)中培养人肾皮质近曲小管上皮细胞HK-2，于37 ℃、5% CO₂、饱和湿度的恒温培养箱中进行培养。待细胞融合度达80%时，采用浓度为0.25%的胰蛋白酶进行消化并传代，按1꞉3的比例接种于新培养皿。后续实验均选用对数生长期细胞进行。

1.3.2 SESN2过表达稳定细胞株构建

委托上海吉凯基因医学科技股份有限公司构建携带人SESN2基因的慢病毒过表达载体LV-SESN2，载体型号为GV492，含3×FLAG标签及增强型绿色荧光蛋白(genetically codon-optimized green fluorescent protein，gcGFP)；同时制备空载对照慢病毒LV-Con(仅含GV492载体骨架，无目的基因插入)。细胞感染与筛选流程如下：1)取对数生长期HK-2细胞，以5×10⁴/孔的密度接种于6孔板，加入含10% FBS的DMEM中，培养24 h至细胞融合度达30%；2)依据预实验结果确定最佳感染复数(multiplicity of infection，MOI)为20，SESN2过表达组加入LV-SESN2慢病毒悬液，空载对照组加入LV-Con慢病毒悬液；3)37 ℃培养8 h后更换为完全培养基，继续培养48 h；4)改用含2 μg/mL嘌呤霉素的完全培养基持续筛选7 d，每2 d更换1次含药培养基，直至未转染病毒的空白细胞组完全死亡。稳转株采用双重验证法：1)荧光验证。荧光显微镜下观察gcGFP的表达情况，以阳性细胞占比>90%为转染合格标准。2)分子验证。采用real-time RT-PCR及蛋白质印迹法(Western blotting，WB)分别检测正常细胞组、LV-Con组、LV-SESN2组的SESN2 mRNA及蛋白质表达水平。验证标准：正常细胞组与LV-Con组的SESN2表达差异无统计学意义(P>0.05)，且LV-SESN2组SESN2 mRNA及蛋白质表达水平较LV-Con组显著升高(P<0.05)，即为构建合格。

1.3.3 体外试验分组、干预及样本收集

取构建成功的LV-Con稳定株与LV-SESN2稳定株，以2×10⁵/孔的密度接种于6孔板，加入含10% FBS的DMEM培养24 h后，分为3组(每组设3个复孔)进行分组干预：1)对照组。更换含1%二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)的新鲜完全培养基培养LV-Con稳定株。2)Erastin体外模型组。更换含10 μmol/L Erastin(以1% DMSO溶解)的新鲜完全培养基培养LV-Con稳定株。3)SESN2体外干预组。更换含10 μmol/L Erastin(以1% DMSO溶解)的新鲜完全培养基培养LV-SESN2稳定株。所有组均置于37 ℃、5% CO₂、饱和湿度的培养箱中持续培养，24 h后收集样本：1)收集细胞上清液，置于-80 ℃冻存，用于后续检测乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)、白细胞介素(interleukin，IL)-6和肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α；2)收集细胞，经磷酸盐缓冲盐水(phosphate-buffered saline，PBS)漂洗后，一部分进行裂解，用于real-time RT-PCR、WB检测SESN2、Nrf2、GPX4、FSP1的mRNA及蛋白质表达水平，另一部分制备成单细胞悬液，用于流式细胞术检测细胞凋亡情况。

1.3.4 体内试验分组、干预及样本采集

1.3.4.1 铁死亡肾损伤模型的构建与验证

参照相关研究^[11]中的方法，采用腹腔注射Erastin构建小鼠铁死亡肾损伤模型。取12只健康ICR雄性小鼠，随机分为溶剂组(V组)及Erastin模型组(M组)2组(n=6)。M组腹腔注射Erastin(30 mg/kg，溶于1% DMSO，溶剂体积不超过总给药体积的5%)，每日2次，连续5 d；V组腹腔注射等体积1% DMSO，给药方式及周期同M组。末次给药后24 h，采集2组小鼠血清，采用全自动生化分析仪检测血肌酐(serum creatinine，SCr)和血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)水平，以M组SCr、BUN水平较V组显著升高(P<0.05)为模型构建成功的标准。

1.3.4.2 体内干预试验

采用随机数字表法将18只ICR雄性小鼠分为体内对照组、Erastin体内模型组、SESN2体内干预组3组(n=6)。1)体内对照组：尾静脉注射空载对照腺相关病毒AAV9-Con(溶于100 μL PBS，4×10¹¹ vg/只)，4周后腹腔注射等体积生理盐水，每日2次，连续5 d。2)Erastin体内模型组：尾静脉注射AAV9-Con(剂量、溶剂同体内对照组)，4周后采用上述已验证的方法腹腔注射Erastin(30 mg/kg，溶于1% DMSO)，每日2次，连续5 d，构建铁死亡肾损伤模型。3)SESN2体内干预组：尾静脉注射SESN2过表达腺相关病毒AAV9-Sesn2(4×10¹¹ vg/只，溶于100 μL PBS)，4周后腹腔注射Erastin(剂量、给药方式及周期同Erastin体内模型组)。

样本采集于末次给药后24 h进行。采用3%七氟烷吸入麻醉，待小鼠角膜反射及翻正反射完全消失后，经眼眶后静脉丛采集全血，室温静置30 min后，于4 ℃以3 500 r/min离心15 min，分离血清并置于-80 ℃保存，用于后续SCr、BUN、LDH、IL-6、TNF-α的检测。将小鼠仰卧位固定于手术台，沿腹正中线作1 cm切口，快速分离双侧肾脏。左肾置于4%多聚甲醛固定液中固定，用于原位末端转移酶标记法(terminal-deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP- biotin nick end labeling，TUNEL)及组织学分析；右肾经液氮速冻后转移至-80 ℃保存，用于real-time RT-PCR、WB及生化指标检测。

1.3.5 相关指标检测方法

1.3.5.1 LDH、IL-6及TNF-α的检测

采用酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)进行LDH、IL-6及TNF-α的检测，取细胞上清液或血清样本，严格按照试剂盒说明书操作，通过酶标仪检测吸光度值并计算浓度。

1.3.5.2 SCr和BUN的检测

采用全自动生化分析仪进行检测，取制备好的血清样本，按仪器操作规范检测，直接读取SCr和BUN的浓度值。

1.3.5.3 ROS的检测

参照以往研究^[12-13]中的方法，分别采用2’,7’-二氯二氢荧光素二乙酸酯(2’,7’-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA)荧光探针法检测HK-2细胞的ROS水平，以及二氢乙啶(dihydroethidium，DHE)荧光染色法检测肾组织中的ROS水平，通过荧光显微镜观察并使用ImageJ软件对图像进行分析，以平均荧光强度作为ROS水平的指标。

1.3.5.4 MDA、GSH及Fe²⁺的检测

均采用比色法进行检测，按试剂盒说明书规范操作，取细胞或肾组织匀浆上清，用酶标仪检测对应波长吸光度并计算含量。

1.3.5.5 细胞凋亡率检测

参照既往研究^[14]中的方法，采用膜联蛋白 V-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶(Annexin V-fluorescein isothiocyanate/propidium iodide，Annexin V-FITC/PI)和双染流式细胞术检测HK-2细胞的凋亡情况。

1.3.5.6 肾组织细胞凋亡率检测

采用TUNEL染色检测肾组织的细胞凋亡率，使用瑞士Roche公司的原位凋亡检测试剂盒，严格按照试剂盒说明书操作。肾组织切片经脱蜡、通透、染色后，在荧光显微镜下观察并计算染色阳性细胞的占比。

1.3.5.7 Real-time RT-PCR检测mRNA的表达

采用real-time RT-PCR检测HK-2细胞及肾组织中SESN2、Nrf2、GPX4、FSP1的mRNA的表达水平。提取细胞或肾组织的mRNA并反转录为cDNA，采用表1中的引物进行PCR扩增，反应条件为95 ℃ 5 s、56 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，设置40个循环。采用2^-ΔΔCt法计算目的基因mRNA的表达水平。

1.3.5.8 WB检测

采用WB检测HK-2细胞及肾组织中SESN2、Nrf2、GPX4、FSP1的蛋白质表达水平。提取HK-2细胞或肾组织中的蛋白质并进行定量，经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)、转膜、封闭后，分别加入SESN2一抗(稀释比1꞉1 500)、Nrf2一抗(稀释比1꞉500)、GPX4一抗(稀释比1꞉1 000)、FSP1一抗(稀释比1꞉1 000)、GAPDH一抗(稀释比1꞉1 000)，于4 ℃孵育过夜并洗膜后，加入二抗(稀释比1꞉6 000)进行孵育，增强化学发光(enhanced chemiluminescence，ECL)显色后使用ImageJ软件分析各蛋白质的相对表达水平。

1.4 统计学处理

采用SPSS 20.0软件进行数据处理与分析。计量资料采用Shapiro-Wilk检验进行正态性检验，符合正态分布的数据以均数±标准差表示。采用Levene检验确认方差齐性，对符合正态分布且方差齐性的数据的组间比较采用单因素方差分析，若不符合则采用Kruskal-Wallis非参数检验。根据方差齐性的检验结果选择相应的事后多重比较方法：方差齐时采用Bonferroni校正，方差不齐时选用Tamhane’s T2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 SESN2 过表达对Erastin诱导的HK-2细胞铁死亡的影响

2.1.1 3组HK-2细胞中LDH、IL-6、TNF-α、MDA、ROS、Fe²⁺及GSH水平的比较

与体外对照组相比，Erastin体外模型组和SESN2体外干预组中LDH、IL-6、TNF-α、MDA、ROS、Fe²⁺水平均显著升高，GSH水平显著降低(均P<0.001)；与Erastin体外模型组相比，SESN2体外干预组中LDH、IL-6、TNF-α、MDA、ROS、Fe²⁺水平均显著降低，GSH水平显著升高(均P<0.001，表2)。

2.1.2 3组HK-2细胞中SESN2、Nrf2、GPX4及FSP1的mRNA表达水平的比较

与体外对照组相比，Erastin体外模型组和SESN2体外干预组中GPX4、FSP1的mRNA表达水平均显著降低(均P<0.001)，SESN2和Nrf2的mRNA表达水平均显著升高(均P<0.001，表3)。

2.1.3 3组HK-2细胞中SESN2、Nrf2、GPX4、FSP1的蛋白质表达水平的比较

与体外对照组相比，Erastin体外模型组和SESN2体外干预组中GPX4、FSP1的蛋白质表达水平均显著降低，SESN2、Nrf2的蛋白质表达水平均显著升高；与Erastin体外模型组相比，SESN2体外干预组中SESN2、Nrf2、GPX4、FSP1的蛋白质表达水平均显著升高(均P<0.001，表4、图1)。

2.1.4 3组HK-2细胞的凋亡率比较

与体外对照组相比，Erastin体外模型组和SESN2体外干预组的细胞凋亡率显著升高(均P<0.001)；与Erastin体外模型组相比，SESN2体外干预组的细胞凋亡率显著降低(P<0.001，表5)。

2.2 SESN2 过表达对Erastin诱导的AKI的保护作用

2.2.1 AKI模型小鼠的肾损伤程度评估

生化检测结果(表6)显示，与体内对照组相比，Erastin体内模型组与SESN2体内干预组小鼠的SCr和BUN水平均显著升高；与Erastin体内模型组相比，SESN2体内干预组小鼠的SCr和BUN水平均显著降低(均P<0.001)。

2.2.2 3组小鼠的血清LDH、IL-6及TNF-α浓度比较

与体内对照组相比，Erastin体内模型组和SESN2体内干预组小鼠血清中LDH、IL-6及TNF-α水平显著升高(均P<0.001，表7)。

2.2.3 3组小鼠肾组织中MDA、GSH水平及ROS荧光强度的比较

与体内对照组相比，Erastin体内模型组和SESN2体内干预组小鼠肾组织中的MDA、ROS水平均显著升高，而GSH的含量显著降低(均P<0.001，表8)。

2.2.4 3组小鼠肾组织中SESN2、Nrf2、GPX4、FSP1的mRNA表达水平比较

与体内对照组相比，Erastin体内模型组和SESN2体内干预组小鼠肾组织中GPX4、FSP1的mRNA表达水平均显著降低，而SESN2及Nrf2的mRNA表达水平均显著升高(均P<0.001)；同时，与Erastin体内模型组相比，SESN2体内干预组小鼠肾组织中SESN2、Nrf2、GPX4、FSP1的mRNA表达水平均显著升高(均P<0.001，表9)。

2.2.5 3组小鼠肾组织中SESN2、Nrf2、GPX4及FSP1的蛋白质表达水平比较

与体内对照组相比，Erastin体内模型组和SESN2体内干预组小鼠肾组织中GPX4、FSP1的蛋白质表达水平均显著降低，SESN2及Nrf2的蛋白质表达水平均显著升高(均P<0.001)；与Erastin体内模型组相比，SESN2体内干预组小鼠肾组织中SESN2、Nrf2、GPX4、FSP1的蛋白质表达水平均显著升高(均P<0.001，表10、图2)。

2.2.6 3组小鼠肾组织TUNEL阳性细胞比较

与体内对照组相比，Erastin体内模型组和SESN2体内干预组小鼠的TUNEL阳性细胞率均显著升高；与Erastin体内模型组相比，SESN2体内干预组小鼠TUNEL阳性细胞率显著降低(均P<0.001，表11)。

3 讨 论

近年来，随着危重症患者进行手术治疗的人数增多，AKI发病率及病死率也逐年攀升，重症患者的AKI发生率可达50%，且其住院死亡风险显著增加^[15-16]。铁死亡作为一种新型的细胞程序性死亡方式，与多种疾病相关^[17]，并已被证实是以肾小管损伤为主要特征的AKI的重要机制之一^[18]，可能成为围手术期肾保护研究的新靶点。

Erastin可通过抑制胱氨酸/谷氨酸反向转运体(cystine/glutamate antiporter system，System Xc)阻断胱氨酸的摄取，导致细胞内GSH合成受阻，最终诱发铁死亡。本研究参照文献[11]的方法，采用Erastin诱导铁死亡并建立体外和体内AKI模型，发现Erastin诱导铁死亡后，在体内外模型中，ROS和MDA水平均显著升高且GSH水平显著降低，同时AKI小鼠的SCr和BUN水平均显著升高，提示Erastin成功诱导了AKI。

GPX4和FSP1构成了铁死亡的两大主要防御系统^{[6, 8]}。GPX4通过特异性清除磷脂过氧化氢阻止铁死亡的发生^[19]。FSP1是与GPX4平行发挥铁死亡抑制作用的关键蛋白质^[20-21]，其机制在于能够再生还原型辅酶Q10(coenzyme Q10，CoQ10)，通过清除脂质过氧化物中间体来实现细胞内抗氧化效应^[22]，且能独立于GPX4途径保护细胞免受铁死亡诱导剂的损伤^[23]。本研究发现，Erastin干预后HK-2细胞的ROS、MDA及Fe²⁺水平显著升高，GPX4、FSP1的mRNA和蛋白质表达水平同步下调，提示2条GPX4与FSP1相关通路均被抑制，导致细胞抗氧化能力丧失，最终导致铁死亡的发生，这也再次明确了Erastin能诱导铁死亡相关AKI。

SESN2作为应激诱导蛋白，具有抗氧化及调节代谢的功能，已被证实可通过调控自噬、抑制氧化应激等改善AKI及糖尿病肾病^[24]。然而，SESN2在铁死亡相关AKI中是否具有类似保护作用尚待阐明。本研究发现，SESN2过表达可显著降低体内外模型中LDH、IL-6及TNF-α水平，升高GSH水平，同时上调Nrf2、GPX4及FSP1的表达水平，减少细胞凋亡及ROS蓄积。结合既往研究^[9]，SESN2可能通过激活Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1(Kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1)-Nrf2-抗氧化反应元件(antioxidant response element，ARE)通路，促进Nrf2核转位，进而上调GPX4的表达水平，协同增强细胞抗铁死亡的能力。这与SESN2调控脓毒症相关铁死亡的研究^[25]结论相符。同时，Nrf2的表达水平与铁死亡的敏感性直接相关，Nrf2表达量增加也可以抑制铁死亡的发生^[26-27]。在本研究中，随着铁死亡的发生，细胞内源性的SESN2蛋白表达被激活，同时Nrf2的表达水平也随之上升，与以往研究^[28]的结论一致。

本研究也存在不足之处。本研究所用的ICR小鼠和HK-2细胞模型虽为肾损伤研究的经典模型，但与临床实际的慢性肾病或其他复杂病因引起的AKI仍存在差异。未来需要在更多的疾病模型(如缺血再灌注损伤模型、糖尿病肾病模型、特定基因敲除模型)中验证SESN2的保护作用及作用机制。

综上所述，SESN2可通过激活Nrf2信号通路，上调铁死亡分子相关GPX4和FSP1的表达，抑制氧化应激、脂质过氧化及炎症反应，从而减轻Erastin诱导的肾小管细胞铁死亡，对铁死亡相关AKI产生保护作用。

参考文献

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基金资助

贵州省科技计划项目(黔科合重大〔2025〕008┫。This work was supported by the Guizhou Provincial Major Science and Technology Special Project)

贵州省科技计划项目(China (Qiankehe Zhongda 〔2025〕008).)

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