RNA结合蛋白相分离在激素性股骨头坏死中的作用机制

Mechanisms of RNA-binding protein phase separation in steroid-associated necrosis of the femoral head

摘要

激素性股骨头坏死(steroid-associated necrosis of the femoral head，SANFH)是一种由糖皮质激素诱发的难治性骨关节疾病，其病理机制复杂，临床干预手段有限。近年来研究表明，RNA结合蛋白(RNA binding proteins，RBPs)通过液-液相分离(liquid-liquid phase separation，LLPS)在转录后调控、细胞信号转导及代谢平衡中发挥关键作用。在SANFH的发病机制中，RBPs通过LLPS参与调控骨代谢关键环节，可能成为潜在干预靶点。RBPs的结构域特性、RNA结合状态及三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)微环境等因素可动态调节其相分离行为，进而影响DNA损伤修复、铁死亡、外泌体形成、转化生长因子-β(transforming growth factor-beta，TGF-β)/Sma和Mad相关蛋白7(Sma- and Mad-related protein 7，Smad7)信号通路、炎症小体激活及m⁶A修饰等过程，这些均与SANFH的发生和发展密切相关。靶向调控RBPs相分离，有望通过多途径干预骨代谢失衡、抑制细胞死亡及减轻炎症反应。将RBPs相分离这一前沿细胞生物学机制与SANFH的多阶段、多通路病理进程进行串联，构建了一个新的机制框架，这为SANFH的防治提供新思路。未来需进一步明确RBPs相分离在SANFH中的具体作用机制，并探索基于相分离调控的精准治疗策略。

Abstract

Steroid-associated necrosis of the femoral head (SANFH) is a refractory osteoarticular disease induced by glucocorticoids, characterized by a complex pathogenesis and limited clinical treatment options. Recent studies have demonstrated that RNA-binding proteins (RBPs) play crucial roles in post-transcriptional regulation, cell signal transduction, and metabolic homeostasis through liquid-liquid phase separation (LLPS). In the pathogenesis of SANFH, RBPs participate in the regulation of key processes involved in bone metabolism via LLPS and may represent potential therapeutic targets. The phase-separation behavior of RBPs can be dynamically regulated by factors such as domain characteristics, RNA-binding status, and the adenosine triphosphate (ATP) microenvironment. These regulatory mechanisms subsequently influence DNA damage repair, ferroptosis, exosome biogenesis, the transforming growth factor-beta (TGF-β)/Sma- and Mad-related protein 7 (Smad7) signaling pathway, inflammasome activation, and m6A modification, all of which are closely associated with the initiation and progression of SANFH. Targeted regulation of RBP phase separation may provide a promising strategy to restore bone metabolism homeostasis, inhibit cell death, and alleviate inflammatory responses through multiple mechanisms. By integrating the emerging cell-biological mechanism of RBP phase separation with the multistage and multipathway pathological progression of SANFH, a novel mechanistic framework is proposed, offering new perspectives for the prevention and treatment of SANFH. Further studies are warranted to elucidate the precise roles of RBP phase separation in SANFH and to explore phase separation-based precision therapeutic strategies.

Graphical abstract

关键词

RNA结合蛋白 / 激素性股骨头坏死 / 糖皮质激素 / 相分离 / 外泌体 / m⁶A修饰 / 铁死亡

Key words

RNA-binding protein / steroid-associated necrosis of the femoral head / glucocorticoid / phase separation / exosome / m⁶A modification / ferroptosis

激素性股骨头坏死(steroid-associated necrosis of the femoral head，SANFH)是一种由于长期使用糖皮质激素等原因导致股骨头代谢异常、脂质代谢失衡和血液微循环紊乱，最终引发骨小梁骨折、骨组织坏死塌陷、髋关节功能障碍的难治性骨骼疾病，是最常见的非外伤性股骨头坏死类型^[1]。在临床治疗中，由于风湿性疾病、免疫相关疾病等对高剂量糖皮质激素高度依赖且治疗周期长，SANFH发病率正逐年上升。据统计，中国是股骨头坏死患者数量较多的国家之一，每年需要接受治疗的患者例数超800万^[2]；多中心流行病学研究报告^[3]指出，SANFH约占全部股骨头坏死病例的24.1%。同时，由于糖皮质激素在临床治疗中难以替代，探究SANFH的具体发病机制极为迫切。

RNA结合蛋白(RNA-binding proteins，RBPs)是一种通过与RNA分子结合并参与基因表达调控和转录过程的蛋白质，其在细胞稳态维持和组织发育中起关键作用^[4]。RBPs可通过液-液相分离(liquid-liquid phase separation，LLPS)形成无膜细胞器，这是一种由特定蛋白质和核酸在最优条件和浓度下，在水环境中引发的可逆相变，形成一个密集的液滴，即“凝聚体”^[5]。目前，研究^[6-7]发现LLPS在DNA修复、细胞信号转导、代谢调控等方面起重要作用。SANFH的病理机制聚焦于脂代谢紊乱、氧化应激、血管损伤和细胞凋亡/焦亡等。然而，这些下游事件是否存在一个共同的、更上游的分子调控枢纽，以及RBPs的LLPS是否参与其中，仍需要进一步探索。近年来研究^[8]发现，RBPs通过LLPS形成的无膜细胞器，也是协调基因转录、翻译、信号转导和应激反应的关键空间平台。在多种退行性疾病中，RBPs的异常相分离或是致病的核心环节。因此，糖皮质激素可能通过干扰股骨头关键靶细胞内特定RBPs的相分离稳态，促使其从动态的、功能性的“工作平台”转变为病理性的、功能失调的凝聚体，同时扰乱DNA修复、铁死亡、炎症信号、成骨/破骨分化等多个下游通路，最终协同驱动骨坏死的发生，而药物通过参与调控RBPs的LLPS则具备一定的治疗潜力。

本文旨在通过系统分析糖皮质激素诱导股骨头坏死发生的病理进程，总结RBPs在各领域研究中的最新进展，归纳RBPs通过LLPS在DNA修复、铁死亡调控和外泌体形成、转化生长因子-β(transforming growth factor-beta，TGF-β)/Sma和Mad相关蛋白7(Sma- and Mad-related protein 7，Smad7)信号通路调控、炎症因子调节等环节中的作用机制，对RBPs在SANFH中的治疗作用提出展望，并对潜在靶点的临床转化应用提出合理方向，为靶向RBPs的SANFH治疗策略提供新的思路。

1 RBPs相分离的调控机制

1.1 RBPs上的无序结构域影响LLPS

RBPs上的无序结构域在LLPS中发挥重要推动作用。酵母核糖体生成因子是一种内在无序的RBPs，具有8个重复的带正电荷且无结构的核酸结合基序，这种多个基序的结构能够通过协同作用催化RNA折叠，驱动相分离过程^[9]。严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2型(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2)的核衣壳蛋白能够与转录活性DNA结合蛋白(transactive response DNA-binding protein，TDP-43)形成生物分子凝聚体，这一过程依赖于N蛋白的C末端结构域和TDP-43的内在无序C末端结构域的LLPS，并且在有RNA存在的情况下，这一过程会显著加快^[10]。RBPs多聚腺苷酸结合蛋白核1(polyadenylate-binding protein nuclear 1，PABPN1)通过其N端无序结构域和RNA识别基序的LLPS促进核内多聚腺苷酸结构域的形成^[11](图1)。富含碱性氨基酸的相互作用域蛋白1A包含一个类似朊病毒的结构域，其能够通过液相聚集促进液态聚集体的形成^[12]。肽基脯氨酰异构酶A内的无序区域有助于其与其他蛋白质或核酸相互作用，引发LLPS，提高细胞的抗应激能力^[13]。

RBPs上的无序结构域也可抑制LLPS的发生。细胞质内激活增殖关联蛋白1(cytoplasmic activation/proliferation-associated protein 1，Caprin1)的C端结构域可自发地发生LLPS，而其N端结构域与Ras GTP酶激活蛋白结合蛋白1(Ras GTPase-activating protein-binding protein 1，G3BP1)相互作用抑制G3BP1的LLPS，由此Caprin1通过2个结构域对LLPS发挥双向调控作用^[14]。C端结构域促进自身的LLPS，而N端结构域通过占用G3BP1的核运输因子2(nuclear transport factor 2，NTF2)样结构域从而抑制其LLPS的发生(图2)。RBPs的LLPS过程受到不同结构域的精细调控。

RBPs上的无序结构域通过2种作用力驱动相分离过程：1)疏水相互作用。研究^[15]发现LLPS中稳定疏水相互作用在相分离条件下占主导地位，而不稳定静电作用则处于劣势。朊蛋白第145位酪氨酸处的疾病相关终止密码子突变可通过内在高度无序的N端结构域发生LLPS，而通过1,6-己二醇破坏较弱的疏水相互作用会明显抑制相分离现象，实验中通过在疏水区段将丙氨酸替换为缬氨酸以增加其疏水性，会显著增强发生LLPS的倾向(图1)，这表明疏水相互作用在无序结构域的液态自组装过程中起重要作用^[16]。2)静电相互作用。不含朊病毒结构域的TDP-43具有低电位和相反电位的区域，而盐作用会减弱域间的静电吸引力，抑制LLPS。由于朊病毒结构域带正电荷，具有朊病毒结构域的TDP-43在盐和高pH值的影响下减弱静电排斥作用，促进LLPS(图3)。由此看来，静电相互作用对LLPS的影响有吸引力与排斥力2种不同形式，这取决于RBPs结构域上的不同电位的相互作用及环境对电位的影响^[17]。异质核核糖核蛋白A1(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A1，hnRNP A1)低复杂度结构域(low-complexity domain，LCD)中折叠域的存在相较于单纯LCD驱动相分离的盐依赖性更低，这逆转了LCD以盐依赖的方式促进相分离的机制，而是以一种域内残基的强静电作用的方式驱动相分离过程^[18]。这意味着盐浓度的敏感性在这种无序折叠域的LLPS发生过程中被削弱了，折叠域形成的一种特异的、高亲和力的结合位点通常不容易被盐离子屏蔽，RBPs中的无序折叠域可通过残基间的静电作用促进LLPS。

无序结构域在LLPS的发生过程中占据主导地位。研究^[19]发现，TDP-43的氨基末端和羧基末端结构域与CLIP34(一种重要的RBPs)相关联的相分离和自我调节可能通过N末端结构域的磷酸化得到有效控制。RNA结合蛋白(RNA-binding glycine-rich，RBG)D2和RBGD4在体外进行LLPS，并通过酪氨酸残基阵列在体内形成应激颗粒，从而对抗热胁迫，改变酪氨酸残基阵列会破坏这一聚合过程^[20]。热激蛋白(heat shock protein，HSP)70和HSP90伴侣通过识别TDP-43朊蛋白结构域中的结构元件促进TDP-43的相分离过程；TDP-43朊蛋白中的第2个螺旋元件的甲硫氨酸硫化物的去除则会破坏伴侣识别，影响相分离过程^[21]。

1.2 RNA结合影响LLPS

非编码RNA充当支架促进LLPS。非编码RNA在RBPs的相分离过程中可招募具有内在无序结构域的RBPs触发LLPS的起始事件，从而形成核凝聚体，为基因组的转录和转录后调控提供专门的核内环境，在维持细胞稳态中发挥关键作用^[22](图4)。环状棕榈酰化膜蛋白6作为支架，可促进RNA结合家族成员A与RBPs之间的相互作用，并通过LLPS促使结肠癌细胞表现出更具侵袭性的特性^[23]。非编码环状RNA膜泡关联膜蛋白3来源的环状RNA可作为分子支架，招募Caprin1与G3BP1相结合的复合物，通过LLPS抑制肝细胞癌的增殖和转移^[24]。RNA在RBPs的初始相分离过程中发挥重要作用，非编码RNA可充当支架为初始相分离创造条件。

RNA结合通过影响分子亲和力显著调控RBPs的LLPS。研究^[25]表明，TDP-43的寡聚化受RNA结合的调节，影响RBPs的稳定性、剪接功能、LLPS和亚细胞定位等，TDP-43与RNA结合会使其在细胞质中形成包涵体，而RNA结合缺陷的同型物则在细胞核中聚集。这一现象归因于RNA对分子亲和力的影响，在低至中等浓度下凝聚相模型中，RNA可通过增强凝聚液相的分子连接增强RBPs凝聚体的稳定性。RNA与混合物中较低价态的蛋白质具有更高的亲和力，而与同种较高价态的蛋白质的亲和力较低，促进多组分凝聚体的相分离，这与RNA可以加速相分离的起始阶段密切相关^[26](图4)。一个小型(68个残基)、带正电荷且包含固有无序区域的富含谷氨酸(glutamic acid，E)-精氨酸(arginine，R)-天冬氨酸(aspartic acid，D)-赖氨酸(lysine，K)的短基序的小蛋白质(small ERDK-rich factor，SERF)通过与聚阴离子RNA结合时会减弱SERF内部电荷的排斥，SERF集合体呈现出一定程度的压缩现象，为RNA通过LLPS实现的高阶组装提供了理论依据^[27]。因此，RNA可通过调控分子连接性或静电作用的方式促进LLPS，对LLPS有显著调控作用。

1.3 ATP作用调节LLPS

研究^[28]发现，富含精氨酸-甘氨酸/精氨酸-甘氨酸-甘氨酸的冷诱导RNA结合蛋白(cold-inducible RNA-binding protein，CIRBP)的RNA识别基序及无序结构域会与三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)、二磷酸腺苷、一磷酸腺苷及烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、还原型辅酶Ⅰ、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸和还原型辅酶Ⅱ直接相互作用，其RNA引导的相分离过程会被ATP结合抑制。Aida等^[29]对肉瘤融合蛋白(fused in sarcoma，FUS)进行研究发现，ATP分子可通过其腺嘌呤基团与FUS蛋白上的第22位酪氨酸残基的侧链基团接触，使磷酸基团暴露于外部溶剂中，增加FUS-LC(FUS蛋白的核心区域)的溶解度，抑制FUS蛋白通过LLPS引发的液滴形成(图5)。此外，ATP对聚集物形成的调控不仅限于FUS，在人的眼球晶状体中，也发现了高浓度的ATP，其可以有效地抑制γS-晶状体蛋白质聚集^[30]。综上，ATP作为“生物溶剂”，极可能与ATP对相分离的抑制作用相关。

研究^[31]发现，ATP能够促进固有无序蛋白(basic intrinsically disordered proteins，bIDPs)的相分离，在bIDP-ATP的凝聚体中，ATP分子充当内在无序蛋白链之间的桥梁，通过与内在无序蛋白的精氨酸和赖氨酸侧链形成广泛盐桥和阳离子相互作用，促进相分离(图5)。在RNA结合蛋白Caprin1的羧基末端上，存在带正电的无序区域，当添加带负电的ATP或高浓度的氯化钠时，该区域会发生相分离。其相分离轨迹上的特定残基可以凭借其近表面的静电势影响蛋白质的富集水平和凝聚相机械性能，从而对生物过程进行调节^[32]。ATP对相分离的作用是双向的，ATP对相分离的促进作用更倾向于在低浓度下，ATP减轻了电荷之间的排斥作用，从而促进LLPS的发生。当ATP浓度高于一定值时，蛋白体高度溶解阻止了液态包涵体的形成，抑制LLPS^[33-34]。

2 激素诱导股骨头坏死发生的分子机制与潜在治疗靶点

2.1 启动阶段：糖皮质激素暴露与早期应激

在持续高剂量的糖皮质激素作用下，出现血管内皮细胞损伤与高凝状态、氧化应激及脂代谢紊乱三大早期病理反应。

2.1.1 血管内皮损伤与高凝状态

糖皮质激素通过上调纤溶酶原激活物抑制剂-1活性来抑制纤溶系统，使血液处于相对高凝状态^[35]。这种高凝状态易诱发微血栓形成，直接阻碍股骨头局部血供，构成SANFH的血管性阻碍环节。此外，糖皮质激素还可促进血小板聚集并诱导内皮细胞凋亡，进一步加剧血栓形成。组织病理学相关观察研究^[36]证实，在坏死股骨头区域邻近的骨髓微血管内存在血小板血栓，这是糖皮质激素损伤骨髓内皮细胞后引发的继发性改变(图6)。

2.1.2 氧化应激

大剂量糖皮质激素可诱发细胞氧化应激，导致线粒体功能障碍，进而产生过量活性氧，打破机体氧化-抗氧化平衡^[37]。活性氧的堆积可引起蛋白质、脂质及核酸等生物大分子的氧化损伤。尤为重要的是，糖皮质激素可能损害DNA修复系统功能，阻碍DNA损伤的正常修复，从而显著增加细胞对氧化应激的敏感性^[38](图6)。

2.1.3 脂代谢紊乱

糖皮质激素可导致脂肪细胞肿胀、坏死，并增加骨细胞内脂质沉积，引发高脂血症、脂肪栓塞、骨髓基质细胞成脂分化及骨髓脂肪浸润。这些变化引起骨内静脉瘀滞，导致骨内微循环中断，进一步减少股骨头血供^[38]。在分子层面，糖皮质激素可下调成骨关键调控因子Runt相关转录因子2(Runt-related transcription factor 2，Runx2)的表达，同时上调脂肪分化核心因子过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferator-activated receptor，PPAR)γ-2的表达，最终导致脂肪分化增强、脂代谢异常与成骨分化受抑制^[39](图6)。

2.2 进展阶段：细胞功能障碍与程序性死亡

在缺血、缺氧及氧化应激的病理微环境下，股骨头内骨细胞功能严重受损，并启动多种形式的程序性死亡，其中炎症与免疫失衡、细胞凋亡与自噬失调是此阶段的核心病理机制。

2.2.1 炎症与免疫失衡

骨代谢稳态本质上是一种受精密调控的炎症反应，多种炎症细胞与因子参与其中。SANFH的重要特征之一是存在异常、持续的慢性炎症^[40]。例如，在SANFH病程中，关键线粒体自噬因子UNC‑51样自噬激活激酶1的缺失会削弱线粒体清除能力，从而激活NOD 样受体蛋白3(NOD-like receptor protein 3，NLRP3)炎症小体，进而促进破骨细胞分化与成熟^[41]；同时也会出现促炎的M1型巨噬细胞与抗炎/修复的M2型巨噬细胞的比例失衡，导致持续性炎症与组织损伤加剧。因此，针对特定炎症信号通路或巨噬细胞极化状态的免疫调节治疗，有望减轻炎症、促进修复并延缓疾病进展^[38](图7)。

2.2.2 细胞凋亡与自噬失调

2.2.2.1 自噬抑制

在高剂量糖皮质激素的SANFH模型中，线粒体功能障碍及自噬水平普遍降低。糖皮质激素通过下调自噬及线粒体自噬标志物的表达，抑制成骨细胞分化与矿化^[42]；同时，其可过度表达线粒体自噬关键调节蛋白帕金森病相关蛋白2，进而促进破骨细胞形成^[43]。此外，过量的活性氧累积也会导致骨细胞自噬活性降低^[44]。这提示自噬失调可能与早期氧化应激失衡密切相关。值得关注的是，有研究^[45]指出通过沉默调节蛋白3/BCL2相互作用蛋白3(sirtuin 3 /BCL2 interacting protein 3，SIRT3/BNIP3)通路调节的线粒体自噬可对抗铁死亡，而柚皮素等化合物通过靶向SIRT3对SANFH产生显著保护作用，这为SANFH的治疗提供了新思路(图7)。

2.2.2.2 细胞凋亡

糖皮质激素可直接诱导成骨细胞凋亡，同时增强破骨细胞活性、抑制成骨细胞功能，从而驱动SANFH发展^[46]。在间接层面上，累积的氧化应激会降低骨髓间充质干细胞活性，加速其衰老并诱导凋亡^[47]。糖皮质激素可通过抑制单酰甘油脂肪酶，阻碍抗氧化Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1/核因子E2相关因子2(Kelch-like ECH-associated protein 1/nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Keap1/Nrf2)信号通路的激活，导致骨髓间充质干细胞内产生高水平氧化应激，最终引发细胞死亡^[48](图7)。

2.3 失代偿阶段：骨代谢稳态的破坏

失代偿阶段核心事件是骨形成与骨吸收的动态平衡被彻底打破，导致净骨量持续丢失。累积的氧化应激直接损害骨髓间充质干细胞、成骨细胞及破骨细胞的功能，是骨代谢失衡的关键推手^[49]。

2.3.1 骨形成抑制

高剂量糖皮质激素损害骨髓间充质干细胞与成骨细胞的线粒体功能，导致活性氧水平升高、抗氧化能力下降，进而抑制Wnt/β-连环蛋白(Wnt/β- catenin)信号通路和丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)通路等经典成骨信号通路，最终损害细胞功能与活力^[48]。同时，骨髓间充质干细胞中衰老相关蛋白(如P21、P16)表达显著增加，呈现应激性衰老。活性氧也会减缓细胞周期，削弱骨髓间充质干细胞的增殖能力^[50]，最终导致骨形成抑制(图8)。

2.3.2 骨吸收增强

糖皮质激素可显著上调核因子κB受体激活因子配体(receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL)及组织蛋白酶K等破骨相关蛋白的表达，促进破骨细胞分化与活化，从而导致骨吸收增加、大量骨丢失^[51](图8)。反之，通过干预手段减少活性氧生成，可降低碳酸酐酶Ⅱ、基质金属蛋白酶9及抗酒石酸酸性磷酸酶等破骨细胞相关基因的表达，从而导致破骨细胞形成受损，抑制其骨吸收功能^[52]。

2.4 潜在治疗靶点

利用外泌体递送特定微RNA(miRNA)来修复SANFH已取得显著进展。miR-378-ASCs外泌体通过靶向融合和激活声波信号通路增强成骨分化和血管生成^[53]；miR-26a-CD34外泌体则通过促进血管生成和成骨分化来保护股骨头免受糖皮质激素损伤^[54]，这表明外泌体在治疗SANFH中的潜力。此外，circ-0058792可通过TGF-β/Smad7通路与miR-181a-5p的相互作用调节成骨与破骨细胞之间的平衡^[55]。表观遗传学研究^[56]显示，DNA甲基化可抑制骨保护素基因的表达，特定胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤(cytosine-phosphate-guanine，CpG)位点的高甲基化会增加SANFH风险。尽管N⁶-甲基腺嘌呤(N⁶-methyladenine，m⁶A)修饰在SANFH中的作用尚未被充分阐明，但作为甲基化修饰的一种重要形式，其与SANFH病理机制可能存在密切关联(图8)。调控外泌体生成、m⁶A表观遗传修饰及TGF-β/Smad7通路，成为干预SANFH病理网络、恢复骨代谢稳态的具有前景的治疗方向。

3 RBPs相分离通过调节骨代谢参与SANFH治疗

3.1 RBPs相分离调控DNA损伤修复

DNA损伤在骨骼疾病中起至关重要的作用^[57]。随着年龄的增长，DNA修复功能缺失的小鼠骨小梁和骨皮质的密度下降得更早，会出现骨膜增生减少、骨强度降低的现象，且DNA损伤的积累会干扰正常的骨骼维护，从而引起正常骨重塑的成骨前体细胞数量减少，导致骨骼结构和强度的丧失。这表明DNA修复对于维持骨骼的正常状态起重要调控作用^[58]。活性氧物质正逐渐成为细胞内的DNA损伤因子，高水平的活性氧可能会导致氧化性DNA损伤水平增加^[59]。研究^[60]表明，在糖皮质激素的诱导下，活性氧还可激活c-Jun氨基末端激酶/c-Jun(c-Jun N-terminal kinase/c-Jun signaling pathway，JNK/c-Jun)信号通路，引起成骨细胞凋亡，造成骨破坏。SANFH作为一种由糖皮质激素诱导的主要骨科疾病，以活性氧积累为主要特征，DNA损伤是SANFH的重要病理机制。

RBPs正逐渐成为细胞DNA损伤的重要效应因子。RBPs可在体外经历可逆的LLPS过程参与DNA修复^[61]。在体内，LLPS同样会在DNA损伤部位发生^[62-63]。例如，融合性肉瘤蛋白的LLPS过程会招募具有类似朊病毒结构域的RNA结合蛋白(splicing factor proline- and glutamine-rich，SFPQ)，从而参与染色质重塑和DNA损伤修复的蛋白质结合过程^[64]。一种具有超过70个潜在miR-7结合位点的环状RNA ciRS-7，是miRNA诱导的沉默复合体组装和DNA修复的促进因子。过表达ciRS-7会显著增强DNA重组修复蛋白RAD51的募集并促进LLPS过程，促进由辐射引起的DNA损伤修复过程^[65](表1)。因此，RBPs引发的LLPS可成为SANFH导致的DNA损伤病理机制中的一个潜在治疗靶点(图6)。

3.2 RBPs相分离调节铁死亡过程

在SANFH中，糖皮质激素可通过肿瘤蛋白p53/溶质载体家族7成员11/谷胱甘肽过氧化物酶4信号轴(P53/solutecarrier family 7 member 11/glutathione peroxidase 4，P53/SLC7A11/GPX4)诱导铁死亡发生^[66]，这表明脂质过氧化会驱动铁代谢失衡，从而驱动骨细胞死亡，这是SANFH发病过程中的重要机制。实验^[67]发现，染色质相关环状RNA(chromatin-associated circular RNA SCN8A，ca-circSCN8A)会募集E1A结合蛋白p300(E1A binding protein p300，EP300)，促进FUS的乳酰化作用，从而推动LLPS介导的ca-circSCN8A/FUS/EP300复合物的形成，在这一过程中，ca-circSCN8A会与铁死亡相关基因SLC7A11启动子形成R环，并通过LLPS过程维持R环的稳定性，从而进一步导致氧化还原平衡的破坏，诱导铁死亡过程。铁死亡抑制蛋白1(ferroptosis suppressor protein 1，FSPI)会被FSP1抑制剂作用，触发其在细胞膜上的重新定位与聚集，并通过LLPS形成具有类似液滴特性的FSP1胶体，导致FSP1功能丧失，促进铁死亡^[68](表1)。LLPS的调控可能成为SANFH治疗中调节铁死亡过程的重要靶点(图7)。目前的研究仍支持RBPs的LLPS对铁死亡的促进作用。

3.3 RBPs相分离影响外泌体形成

外泌体可将蛋白质和核酸运输到邻近细胞，从而介导细胞间的通讯。一些蛋白质和RNA在外泌体中含量显著增加。近年来，关于外泌体给药治疗骨科疾病的研究逐渐深入，例如在骨关节炎中，过表达miRNA-155-5p的外泌体能够增强骨关节炎软骨细胞的增殖和转移，并抑制其凋亡；此外，外泌体还能通过Runx2进一步促进细胞外基质的分泌，有效预防骨关节炎的进展^[69]。在SANFH中，由锂离子刺激的骨髓间充质干细胞分泌的外泌体能够促进巨噬细胞向M2型极化，并且在水凝胶载体的介入下，能显著促进股骨头成骨和血管生成^[70]。因此，外泌体给药的方式治疗SANFH在未来将有广阔的应用前景。

RBPs的LLPS在外泌体形成中发挥重要作用。例如异质核核糖核蛋白A2B1作为一种RBPs，参与了miRNA、长链非编码核糖核酸和环状核糖核酸的外泌体分类过程，其亦可作为RNA颗粒的组成部分参与LLPS过程，因此LLPS可能有助于外泌体形成^[71]。Liu等^[72]的研究表明，Y箭头蛋白1在体外和细胞中会发生LLPS，从而选择性地招募miRNA-223，促进miRNA-223分配到外泌体中；而抑制Y箭头蛋白1相分离的点会干扰这一过程(表1)。这说明LLPS在外泌体的形成中发挥不可忽视的作用。其中，miRNA-223是小的非编码RNAs，这些多种类的微核糖核酸已被发现对骨重塑有重要的调节作用，正如miRNA-27a的表达可降低小鼠胚胎成骨细胞前体细胞中凋亡蛋白的表达，促进成骨细胞分化^[73]。然而在破骨细胞中，Yang等^[74]证明破骨细胞来源的外泌体可通过携带miRNA-23a-5p抑制Runx2和促进Yes相关蛋白1介导的金属硫蛋白1D伪基因的表达来抑制成骨细胞分化。而作为外泌体的内容物之一，miRNA可通过外泌体在细胞间转移，在未来将有很大的可能运用于SANFH的治疗当中，而RBPs的LLPS在此过程中必将发挥重要的调控作用(图8)。

3.4 RBPs相分离调控TGF-β/Smad通路

RBPs的LLPS可调控TGF-β/Smad通路的活性。SANFH的早期发生与TGF-β/Smad通路的异常密不可分。TGF-β与TGF-β膜受体结合可激活Smad信号，引起Runx2表达水平的增加，这能够促进骨髓间充质干细胞的成骨分化过程^[75]。反之，TGF-β/Smad通路的异常则可能会导致SANFH早期骨量的丢失，引起SANFH。因此，TGF-β/Smad信号通路在调控SANFH的骨代谢失衡中有重要作用。

SANFH与TGF-β/Smad通路失调存在关联。Hao等^[76]发现，在糖皮质激素处理的骨髓间充质干细胞中，Smad2/3与促凋亡蛋白水平被显著激活，而Smad7水平则受到抑制，这可佐证TGF-β/Smad信号通路在SANFH病理机制中有重要作用。其中，通过促进环状RNA PVT1的表达可促进TGF-β/Smad7通路的激活，从而改善糖皮质激素诱导的骨髓间充质干细胞的凋亡，延缓SANFH进展^[76]。此外，miRNA-27a也可通过激活TGF-β/Smad7信号通路调节骨代谢及成骨分化过程，实现对SANFH的治疗作用^[73]。这说明TGF-β/Smad7通路的激活在未来极有可能应用于SANFH的治疗。

LLPS可对TGF-β/Smad通路起重要调控作用。SFPQ上一种类似朊病毒的结构域会导致LLPS的发生，其凝聚物会将Smad4从Smad复合物中分离出来，从而在功能上抑制Smad相关的转录反应，抑制TGF-β的信号转导^[77]。与之相反，Li等^[78]发现，TGF-β信号通路可通过TGF-β与转化生长因子β受体(transforming growth factor-beta receptor，TβR)Ⅱ结合而激活，这一过程可磷酸化TβRⅠ，并磷酸化Smad2和Smad3，最终磷酸化的Smad2和Smad3可与Smad4形成异二聚体和三聚体复合物Smad2/3/4，这一复合物可在细胞核中通过LLPS激活酪氨酸氨基转移酶转录，促进凋亡因子的表达，其中，LLPS促进TGF-β/Smad下游信号转导(表1)。LLPS在TGF-β/Smad信号通路中起重要调控作用，其可在通路中对TGF-β/Smad信号进行抑制，也可在Smad2和Smad3的下游促进凋亡的发生。LLPS在TGF-β/Smad信号转导中发挥“双刃剑”的作用，RBPs通过LLPS在TGF-β/Smad通路上游既可抑制Smad4信号转导，又可潜在促进拮抗因子Smad7的表达(图8)，这有益于SANFH的治疗。

3.5 RBPs相分离影响NLRP3等炎症小体的激活

糖皮质激素可诱发NLRP3等炎症小体激活。糖皮质激素可增加糖基化终产物受体和Toll样受体4下游的核因子κB促进核苷酸结合寡聚化结构域样受体的形成，增加NLRP3炎症小体的数量^[79]。不仅如此，大量使用糖皮质激素还可能会激活骨髓间充质干细胞焦亡，而炎症小体和细胞因子激活炎症级联反应导致的细胞焦亡会对不同程度的SANFH发挥关键作用^[80]，NLRP3炎症小体能介导骨髓间充质干细胞的细胞焦亡，并触发成骨细胞和破骨细胞的分化失衡^[81]。因此，NLRP3等炎症小体与糖皮质激素引起的SANFH的骨代谢失衡有密切联系。NLRP3等炎症小体的调控会成为治疗SANFH的一个潜在方向。

LLPS在NLRP3等炎症小体的调控中发挥重要作用。过敏原会增强YTH结构域蛋白1的LLPS，并驱动由二聚体YTH结构域蛋白1和CLOCK mRNA构成的复合物的形成，该复合物被分布到应激颗粒中，使得YTH结构域蛋白1强烈激活NLRP3炎症小体的产生和白细胞介素-1β的分泌^[82]。Schmacke等^[83]认为NLRP3在棕榈酰化修饰后，可能会解除自身抑制，并且能够通过LLPS组装成一个炎症小体盘状结构，从而驱动炎症小体的激活(表1)。不仅如此，NLRP3自身具有发生LLPS的条件，NLRP3的炎症小体感应关联结构域上的无序结构域与疏水残基在NLRP3的LLPS激活过程中发挥重要作用，而棕榈酰化修饰会一定程度上降低其溶解度，降低NLRP3相分离发生的阈值^[84]。这表明LLPS的发生与NLRP3等炎症小体的产生与激活密切相关，在上游的相关RBPs的LLPS也可促使NLRP3的产生；而对于NLRP3自身，也存在通过LLPS激活的条件。LLPS可直接或间接地激活炎症反应，而RBPs参与的上游调控过程可影响SANFH的骨代谢，这提示LLPS的抑制对SANFH中炎症反应的潜在治疗效用(图7)。

3.6 LLPS可能通过影响m⁶A水平调控骨代谢

m⁶A修饰在骨代谢的调控中起重要作用。在骨髓间充质干细胞的成骨分化过程中，Runx2的表达显著增加，而YTH N6-甲基腺苷RNA结合蛋白C2(YTH N6-methyladenosine RNA binding protein C2，YTHDC2)的表达减少，这提示YTHDC2与Runx2存在负相关，YTHDC2可通过m⁶A的修饰加速甲基化Runx2 mRNA的降解，并抑制骨髓间充质干细胞的成骨分化，m⁶A修饰的YTHDC2可能成为调节骨髓间充质干细胞分化有前景的分子靶点^[85]。m⁶A相关基因是SANFH的潜在生物标志物之一^[86]，DNA甲基化可抑制骨保护素基因的表达，从而增加SANFH发生的风险。而m⁶A修饰作为甲基化修饰的一种重要形式，在SANFH的发生和发展中也可能发挥重要作用。

RBPs相分离可调控m⁶A修饰。m⁶A是分布最广泛的动态转录后修饰，其会改变修饰RNA的电荷、构象和RBPs的锚定作用，从而对LLPS过程起调节作用^[87]。在肌萎缩侧索硬化症中，m⁶A修饰的RNA会增强YTH结构域家族蛋白的浓缩并引导其到达应激颗粒，从而有助于应激颗粒中的mRNA分配，促进LLPS的发生^[88](表1)。在糖尿病性心脏纤维化模型小鼠中，Notch同源蛋白1 mRNA中升高的m⁶A水平显著提升了YTH结构域蛋白2的相分离作用，增加了YTH结构域蛋白2对Notch同源蛋白1 mRNA中m⁶A基因残基的识别能力，并导致Notch同源蛋白1的降解^[89]。此外，由于m⁶A是YTHDC1进行LLPS形成核YTHDC1-m⁶A聚集体所必需的，因此m⁶A也是形成相分离介导的核体所必需的，该核体能够维持mRNA稳定性，控制癌细胞的存活与分化^[90](表1)。m⁶A修饰在RBPs相分离的作用机制中充当着“动态调控开关”的角色，能改变RNA-蛋白质相互作用的强度和特异性，从而对相分离起到调控作用。然而Ge等^[91]的研究发现，相分离过程亦可反向影响m⁶A修饰的动态调控，如Wilms肿瘤1相关蛋白(一种“书写者”复合物的关键组成部分)的过度表达容易促使相分离的发生，并促使“书写者复合物”聚集到核小体上，促使m⁶A修饰水平的增加，从而加速促炎反应。这为SANFH的治疗中通过相分离作用影响m⁶A修饰提供了参考(图8)。m⁶A修饰在相分离中起显著的调控作用，且RBPs的相分离作用也可调控m⁶A水平，通过修饰RNA影响骨代谢过程，从而对SANFH起到潜在治疗作用。因此相分离与m⁶A的相互作用在SANFH的治疗中有巨大潜力，这似乎是值得继续深入探索的方向之一。

4 瓶颈与临床转化方向

4.1 诊断标志物

未来转化研究的聚焦于：1)液体活检。验证外泌体中特异性RNA及血浆中m⁶A修饰酶的水平是否能在临床队列中区分SANFH的不同阶段，并预测疾病进展速度，如8种差异脂质代谢物与SANFH的疾病分期密切相关^[92]。相较于传统的影像学检查，这有助于实现真正的“早期预警”。2)功能活性评估。开发检测关键RBPs在患者骨髓单个核细胞中相分离倾向的实验方法，可从功能层面评估疾病活动度，为个性化治疗提供依据。

4.2 靶向治疗策略

针对已鉴定的核心调控节点，可发展以下靶向策略：1)靶向“书写者”或“擦除者”复合物的相分离。利用反义寡核苷酸或小干扰RNA，特异性降解或抑制驱动病理性相分离的RNA，如促铁死亡的环状RNA ca-circSCN8A，或靶向结合特定RBPs的内在无序区域，改变其相分离性质，从而调控SANFH的病理进程。2)调控炎症相关RBPs的相分离。针对YTH结构域家族蛋白1等RBPs，其异常相分离可驱动应激颗粒形成并强烈激活NLRP3炎症小体。开发小分子抑制剂特异性干扰此类RBPs的相分离过程，从而从上游抑制炎症小体的异常组装与激活，为减轻SANFH中的慢性炎症提供新策略，为抑制SANFH中的慢性炎症和细胞焦亡提供新途径；针对在DNA损伤位点通过相分离发挥修复功能的关键RBPs，如肉瘤融合蛋白，可开发小分子调节剂。在SANFH早期氧化应激阶段，稳定FUS等功能性修复凝聚体的形成，增强骨细胞对糖皮质激素诱导的DNA损伤的修复能力，从源头上延缓细胞功能障碍的发生，从而对SANFH的病理性进展起调控作用。

4.3 药物递送

药物递送是临床转化的核心瓶颈，任何针对RNA代谢或相分离的干预手段，必须解决“如何将药物高效、特异地递送至股骨头的靶细胞”这一难题。目前针对SANFH药物递送存在以下问题：1)局部血管缺血导致递送系统难以通过血液循环进入病灶区域；2)缺氧和酸性微环境会影响递送载体的稳定性和药物释放行为；3)缺乏能在股骨头内部长期留存且受控释放的递送平台。针对此类问题，目前可行的策略有：1)骨靶向载体。利用双膦酸盐、天冬氨酸六肽等对骨组织/骨细胞有高亲和力的分子修饰脂质纳米粒、聚合物纳米粒或外泌体，实现药物在骨组织的富集。2)微环境响应性释放。针对坏死股骨头缺血、缺氧、酸性的独特微环境，设计智能响应型水凝胶或纳米载体，实现药物在病灶部位的“按需释放”，提高局部浓度，减少全身不良反应。3)细胞特异性递送。通过对载体进行表面修饰，如连接靶向成骨细胞、破骨细胞或血管内皮细胞的特异性抗体或配体，实现对特定细胞群体的精准干预。

4.4 现有药物的LLPS

部分已应用于临床或处于研发阶段的药物，其作用机制可能涉及调节相分离，这为快速临床转化提供了捷径。例如，SIRT3激动剂(如柚皮素及其衍生物)可通过SIRT3/BNIP3通路保护线粒体自噬、对抗铁死亡。未来可探究其是否通过稳定SIRT3蛋白的相分离稳态来发挥作用，并评估其治疗SANFH的临床潜力。NLRP3抑制剂(如MCC950、CY-09等)可直接抑制NLRP3炎症小体的组装。NLRP3通过相分离激活的机制，可进一步评估这些药物是否可通过干扰NLRP3的LLPS来发挥效应，从而为老药新用提供理论基础。

从机制到临床的跨越，需要建立“靶点验证-药物开发-递送优化-临床评价”的完整闭环。揭示的RBPs相分离调控网络可为开发针对SANFH的新型诊断工具和治疗药物提供新的靶点。然而，真正的突破有赖于多学科交叉合作，特别是材料科学与药剂学的深度介入，以解决靶向递送这一瓶颈问题。将相分离理论应用于骨科退行性疾病的诊疗，不仅有望改变SANFH的临床实践，更可能为其他骨代谢疾病的治疗范式带来积极影响。

5 结 语

RBPs的LLPS作为一种新兴的细胞功能组织形式，在SANFH的调控网络中可能扮演着核心而复杂的“调控枢纽”角色。在生理状态下，RBPs可通过功能性的LLPS高效组织DNA修复、mRNA代谢、应激反应等过程，维持骨细胞的稳态。然而，在糖皮质激素诱导的病理条件下，RBPs的LLPS可能发生广泛失调，其作用亦呈现出多面性。例如，在DNA损伤修复中，FUS蛋白的正常LLPS可募集修复因子对抗早期氧化损伤，保护骨细胞；但在铁死亡通路中，FUS又可被异常RNA募集，通过LLPS形成促铁死亡复合物，加剧骨破坏。在炎症调控中，YTH结构域蛋白1的异常LLPS可驱动NLRP3炎症小体产生，放大炎症；而在外泌体介导的细胞间通讯中，Y框结合蛋白1的LLPS则选择性分选保护性微核糖核酸进入外泌体，潜在促进骨修复。在TGF-β/Smad通路中，SFPQ蛋白的LLPS隔离Smad4，与之拮抗的Smad7得到激活，从而促进成骨和血管修复；不仅如此，Smad2/3/4复合物自身的LLPS却可激活促凋亡程序，引起细胞凋亡。

RBPs的LLPS对SANFH的生理与病理起着不同作用，这种矛盾性深刻揭示了RBPs的LLPS功能具有高度的阶段依赖性和微环境特异性。在SANFH早期，细胞可能通过激活保护性LLPS来应对糖皮质激素应激；随着损伤累积和微环境恶化，这些LLPS过程可能从动态、功能性的“液滴”失控转变为病理性、固化的“凝胶”，从而加速疾病进展。同时，其作用也因结合的RNA分子、共调节因子及所处的亚细胞区域而异，从而对同一病理环节产生截然不同的作用，因此药物通过调控RBPs的LLPS参与其中则有着巨大的临床应用潜力。在临床转化层面，筛选出包括TGF-β/Smad7通路、NLRP3、外泌体及m⁶A修饰酶在内的多个潜在靶点，并指出通过干预RNA结合蛋白相分离稳态以恢复RNA代谢平衡，有望成为区别于传统疗法的新兴治疗策略，为开发靶向RNA结合蛋白的精准诊疗方案提供了理论依据和创新思路。

参考文献

[1] 朱正杰, 彭昊. 成骨细胞在激素性股骨头坏死发病机制中的作用研究进展[J]. 生物骨科材料与临床研究, 2025, 22(1): 76-81.

[2] ZHU Zhengjie, PENG Hao. Research progress on the role of osteoblasts in the pathogenesis of steroid-induced osteonecrosis of the femoral head[J]. Orthopaedic Biomechanics Materials and Clinical Study, 2025, 22(1): 76-81.

[3] Li L, Zhao S, Leng Z, et al. Pathological mechanisms and related markers of steroid-induced osteonecrosis of the femoral head[J]. Ann Med, 2024, 56(1): 2416070.

[4] Cui L, Zhuang Q, Lin J, et al. Multicentric epidemiologic study on six thousand three hundred and ninety five cases of femoral head osteonecrosis in China[J]. Int Orthop, 2016, 40(2): 267-276.

[5] Swahn H, Olmer M, Lotz MK. RNA-binding proteins that are highly expressed and enriched in healthy cartilage but suppressed in osteoarthritis[J]. Front Cell Dev Biol, 2023, 11: 1208315.

[6] Scott-Hewitt N, Mahoney M, Huang YT, et al. Microglial-derived C1q integrates into neuronal ribonucleoprotein complexes and impacts protein homeostasis in the aging brain[J]. Cell, 2024, 187(16): 4193-4212.

[7] 梁婷婷, 曾雷. 液-液相分离在基因转录调控中功能机制的研究进展[J]. 吉林大学学报(医学版), 2022, 48(6): 1629-1634.

[8] LIANG Tinging, ZENG Lei. Research progress in functional mechanism of liquid-liquid phase separation in gene transcription regulation[J]. Journal of Jilin University. Medicine Edition, 2022, 48(6): 1629-1634.

[9] 王丽, 王拥军, 万兵, 等. 液-液相分离: 细胞内的调控机制和疾病发展[J]. 激光生物学报, 2024, 33(2): 97-107.

[10] WANG Li, WANG Yongjun, WAN Bing, et al. Liquid-liquid phase separation: intracellular regulatory mechanisms and disease development[J]. Acta Laser Biology Sinica, 2024, 33(2): 97-107.

[11] Fierro-Monti I. RBPs: an RNA editor’s choice[J]. Front Mol Biosci, 2024, 11: 1454241.

[12] Niedner-Boblenz A, Monecke T, Hennig J, et al. Intrinsically disordered RNA-binding motifs cooperate to catalyze RNA folding and drive phase separation[J]. Nucleic Acids Res, 2024, 52(22): 14205-14228.

[13] Strong MJ, McLellan C, Kaplanis B, et al. Phase separation of SARS-CoV-2 nucleocapsid protein with TDP-43 is dependent on C-terminus domains[J]. Int J Mol Sci, 2024, 25(16): 8779.

[14] Dai XX, Pi SB, Zhao LW, et al. PABPN1 functions as a hub in the assembly of nuclear poly(A) domains that are essential for mouse oocyte development[J/OL]. Sci Adv, 2022, 8(43): eabn9016[2025-10-15].

[15] Kim YR, Joo J, Lee HJ, et al. Prion-like domain mediated phase separation of ARID1A promotes oncogenic potential of Ewing’s sarcoma[J]. Nat Commun, 2024, 15(1): 6569.

[16] Maneix L, Iakova P, Lee CG, et al. Cyclophilin A supports translation of intrinsically disordered proteins and affects haematopoietic stem cell ageing[J]. Nat Cell Biol, 2024, 26(4): 593-603.

[17] Song D, Kuang LS, Yang L, et al. Yin and Yang regulation of stress granules by Caprin-1[J/OL]. Proc Natl Acad Sci USA, 2022, 119(44): e2207975119[2025-10-15].

[18] Pakravan D, Michiels E, Bratek-Skicki A, et al. Liquid-liquid phase separation enhances TDP-43 LCD aggregation but delays seeded aggregation[J]. Biomolecules, 2021, 11(4): 548.

[19] Agarwal A, Rai SK, Avni A, et al. An intrinsically disordered pathological prion variant Y145Stop converts into self-seeding amyloids via liquid-liquid phase separation[J/OL]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2021, 118(45): e2100968118[2025-10-15].

[20] Staderini T, Bigi A, Lagrève C, et al. Biophysical characterization of the phase separation of TDP-43 devoid of the C-terminal domain[J]. Cell Mol Biol Lett, 2024, 29(1): 104.

[21] Martin EW, Thomasen FE, Milkovic NM, et al. Interplay of folded domains and the disordered low-complexity domain in mediating hnRNPA1 phase separation[J]. Nucleic Acids Res, 2021, 49(5): 2931-2945.

[22] Koehler LC, Grese ZR, Bastos ACS, et al. TDP-43 oligomerization and phase separation properties are necessary for autoregulation[J]. Front Neurosci, 2022, 16: 818655.

[23] Zhu S, Gu J, Yao J, et al. Liquid-liquid phase separation of RBGD2/4 is required for heat stress resistance in Arabidopsis [J]. Dev Cell, 2022, 57(5): 583-597.

[24] Carrasco J, Antón R, Valbuena A, et al. Metamorphism in TDP-43 prion-like domain determines chaperone recognition[J]. Nat Commun, 2023, 14: 466.

[25] Ku D, Yang Y, Kim Y. RNA-associated nuclear condensates: Where the nucleus keeps its RNAs in check[J]. Mol Cells, 2025, 48(8): 100240.

[26] Chen RX, Xu SD, Deng MH, et al. Mex-3 RNA binding family member A (MEX3A)/circMPP6 complex promotes colorectal cancer progression by inhibiting autophagy[J]. Sig Transduct Target Ther, 2024, 9(1): 80.

[27] Chen S, Cao X, Zhang J, et al. circVAMP3 drives CAPRIN1 phase separation and inhibits hepatocellular carcinoma by suppressing c-myc translation[J]. Adv Sci, 2022, 9(8): 2103817.

[28] Pérez-Berlanga M, Wiersma VI, Zbinden A, et al. Loss of TDP-43 oligomerization or RNA binding elicits distinct aggregation patterns[J/OL]. EMBO J, 2023, 42(17): e111719[2025-10-15].

[29] Joseph JA, Espinosa JR, Sanchez-Burgos I, et al. Thermodynamics and kinetics of phase separation of protein-RNA mixtures by a minimal model[J]. Biophys J, 2021, 120(7): 1219-1230.

[30] Mitra R, Usher ET, Dedeoğlu S, et al. Molecular insights into the interaction between a disordered protein and a folded RNA[J/OL]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2024, 121(49): e2409139121[2025-10-15].

[31] Zhou Q, Usluer S, Zhang F, et al. ATP regulates RNA-driven cold inducible RNA binding protein phase separation[J]. Protein Sci, 2021, 30(7): 1438-1453.

[32] Aida H, Shigeta Y, Harada R. The role of ATP in solubilizing RNA-binding protein fused in sarcoma[J]. Proteins Struct Funct Bioinform, 2022, 90(8): 1606-1612.

[33] He Y, Kang J, Song J. ATP antagonizes the crowding-induced destabilization of the human eye-lens protein γS-crystallin[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2020, 526(4): 1112-1117.

[34] Kota D, Prasad R, Zhou HX. ATP mediates phase separation of disordered basic proteins by bridging intermolecular interaction Networks[J]. BioRxiv, 2023, 20: 2023.08.20.554035.

[35] Toyama Y, Rangadurai AK, Forman-Kay JD, et al. Surface electrostatics dictate RNA-binding protein CAPRIN1 condensate concentration and hydrodynamic properties[J]. J Biol Chem, 2023, 299(1): 102776.

[36] Kang J, Lim L, Song J. ATP enhances at low concentrations but dissolves at high concentrations liquid-liquid phase separation (LLPS) of ALS/FTD-causing FUS[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2018, 504(2): 545-551.

[37] Hautke A, Ebbinghaus S. The emerging role of ATP as a cosolute for biomolecular processes[J]. Biol Chem, 2023, 404(10): 897-908.

[38] Okada K, Okamoto T, Okumoto K, et al. PAI-1 is involved in delayed bone repair induced by glucocorticoids in mice[J]. Bone, 2020, 134: 115310.

[39] Liverani E, Banerjee S, Roberts W, et al. Prednisolone exerts exquisite inhibitory properties on platelet functions[J]. Biochem Pharmacol, 2012, 83(10): 1364-1373.

[40] Ding LZ, Teng X, Zhang ZB, et al. Mangiferin inhibits apoptosis and oxidative stress via BMP2/Smad-1 signaling in dexamethasone-induced MC3T3-E1 cells[J]. Int J Mol Med, 2018, 41(5): 2517-2526.

[41] Zhang J, Cao JZ, Liu YF, et al. Advances in the pathogenesis of steroid-associated osteonecrosis of the femoral head[J]. Biomolecules, 2024, 14(6): 667.

[42] Yang W, Li HY, Wu YF, et al. ac4C acetylation of RUNX2 catalyzed by NAT10 spurs osteogenesis of BMSCs and prevents ovariectomy-induced bone loss[J]. Mol Ther Nucleic Acids, 2021, 26: 135-147.

[43] Ma M, Tan Z, Li W, et al. Osteoimmunology and osteonecrosis of the femoral head[J]. Bone Joint Res, 2022, 11(1): 26-28.

[44] Deng R, Zhang HL, Huang JH, et al. MAPK1/3 kinase-dependent ULK1 degradation attenuates mitophagy and promotes breast cancer bone metastasis[J]. Autophagy, 2021, 17(10): 3011-3029.

[45] Chen L, Shi X, Weng SJ, et al. Vitamin K2 can rescue the dexamethasone-induced downregulation of osteoblast autophagy and mitophagy thereby restoring osteoblast function in vitro and in vivo[J]. Front Pharmacol, 2020, 11: 1209.

[46] Hong SJ, Jung S, Jang JS, et al. PARK2 induces osteoclastogenesis through activation of the NF-κB pathway[J]. Mol Cells, 2022, 45(10): 749-760.

[47] Kar R, Riquelme MA, Hua R, et al. Glucocorticoid-induced autophagy protects osteocytes against oxidative stress through activation of MAPK/ERK signaling[J/OL]. JBMR Plus, 2019, 3(4): e10077[2025-10-15].

[48] Fan Y, Chen Z, Wang H, et al. Isovitexin targets SIRT3 to prevent steroid-induced osteonecrosis of the femoral head by modulating mitophagy-mediated ferroptosis[J]. Bone Res, 2025, 13(1): 18.

[49] Schepper JD, Collins F, Rios-Arce ND, et al. Involvement of the gut microbiota and barrier function in glucocorticoid-induced osteoporosis[J]. J Bone Miner Res, 2020, 35(4): 801-820.

[50] Wei H, Li Z, Hu S, et al. Apoptosis of mesenchymal stem cells induced by hydrogen peroxide concerns both endoplasmic reticulum stress and mitochondrial death pathway through regulation of caspases, p38 and JNK[J]. J Cell Biochem, 2010, 111(4): 967-978.

[51] Yang N, Sun H, Xue Y, et al. Inhibition of MAGL activates the Keap1/Nrf2 pathway to attenuate glucocorticoid-induced osteonecrosis of the femoral head[J/OL]. Clin Transl Med, 2021, 11(6): e447[2025-10-15].

[52] Kubo Y, Drescher W, Fragoulis A, et al. Adverse effects of oxidative stress on bone and vasculature in corticosteroid-associated osteonecrosis: potential role of nuclear factor erythroid 2-related factor 2 in cytoprotection[J]. Antioxid Redox Signal, 2021, 35(5): 357-376.

[53] Sun LY, Pang CY, Li DK, et al. Antioxidants cause rapid expansion of human adipose-derived mesenchymal stem cells via CDK and CDK inhibitor regulation[J]. J Biomed Sci, 2013, 20(1): 53.

[54] Okada H, Okabe K, Tanaka S. Finely-tuned calcium oscillations in osteoclast differentiation and bone resorption[J]. Int J Mol Sci, 2020, 22(1): 180.

[55] An J, Hao D, Zhang Q, et al. Natural products for treatment of bone erosive diseases: The effects and mechanisms on inhibiting osteoclastogenesis and bone resorption[J]. Int Immunopharmacol, 2016, 36: 118-131.

[56] Nan K, Zhang Y, Zhang X, et al. Exosomes from miRNA-378-modified adipose-derived stem cells prevent glucocorticoid-induced osteonecrosis of the femoral head by enhancing angiogenesis and osteogenesis via targeting miR-378 negatively regulated suppressor of fused (Sufu)[J]. Stem Cell Res Ther, 2021, 12(1): 331.

[57] Zuo R, Kong L, Wang M, et al. Exosomes derived from human CD34⁺ stem cells transfected with miR-26a prevent glucocorticoid-induced osteonecrosis of the femoral head by promoting angiogenesis and osteogenesis[J]. Stem Cell Res Ther, 2019, 10(1): 321.

[58] Han N, Qian F, Niu X, et al. Circ_0058792 regulates osteogenic differentiation through miR-181a-5p/Smad7 axis in steroid-induced osteonecrosis of the femoral head[J]. Bioengineered, 2022, 13(5): 12807-12822.

[59] He MC, Zhang J, Chen XJ, et al. Osteoclastic activity was associated with the development of steroid-induced osteonecrosis of femoral head[J]. Artif Cells Nanomed Biotechnol, 2020, 48(1): 1036-1046.

[60] Usategui-Martín R, Gutiérrez-Cerrajero C, Jiménez-Vázquez S, et al. Polymorphisms in genes implicated in base excision repair (BER) pathway are associated with susceptibility to Paget’s disease of bone[J]. Bone, 2018, 112: 19-23.

[61] Nicolaije C, Diderich KE, Botter SM, et al. Age-related skeletal dynamics and decrease in bone strength in DNA repair deficient male trichothiodystrophy mice[J/OL]. PLoS One, 2012, 7(4): e35246[2025-10-15].

[62] Botter SM, Zar M, van Osch GJ, et al. Analysis of osteoarthritis in a mouse model of the progeroid human DNA repair syndrome trichothiodystrophy[J]. Age (Dordr), 2011, 33(3): 247-260.

[63] Peng P, Nie Z, Sun F, et al. Glucocorticoids induce femoral head necrosis in rats through the ROS/JNK/c-Jun pathway[J]. FEBS Open Bio, 2021, 11(1): 312-321.

[64] Levone BR, Lenzken SC, Antonaci M, et al. FUS-dependent liquid-liquid phase separation is important for DNA repair initiation[J/OL]. J Cell Biol, 2021, 220(5): e202008030[2025-10-15].

[65] Kilic S, Lezaja A, Gatti M, et al. Phase separation of 53BP1 determines liquid-like behavior of DNA repair compartments[J/OL]. EMBO J, 2019, 38(16): e101379[2025-10-15].

[66] Pessina F, Giavazzi F, Yin Y, et al. Functional transcription promoters at DNA double-strand breaks mediate RNA-driven phase separation of damage-response factors[J]. Nat Cell Biol, 2019, 21(10): 1286-1299.

[67] Reber S, Jutzi D, Lindsay H, et al. The phase separation-dependent FUS interactome reveals nuclear and cytoplasmic function of liquid-liquid phase separation[J]. Nucleic Acids Res, 2021, 49(13): 7713-7731.

[68] Wang YL, Feng LL, Shi J, et al. CiRS-7 enhances the liquid-liquid phase separation of miRISC and promotes DNA damage repair[J]. Nucleus, 2023, 14(1): 2293599.

[69] Sun F, Zhou JL, Liu ZL, et al. Dexamethasone induces ferroptosis via P53/SLC7A11/GPX4 pathway in glucocorticoid-induced osteonecrosis of the femoral head[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2022, 602: 149-155.

[70] Li M, Hao Y, Song X, et al. Ca-circSCN8A promotes HPASMCs ferroptosis via LLPS initiated R-loop[J/OL]. Hypertension, 2025, 82(7): e114-e128[2025-10-15].

[71] Nakamura T, Hipp C, Santos Dias Mourão A, et al. Phase separation of FSP1 promotes ferroptosis[J]. Nature, 2023, 619(7969): 371-377.

[72] Wang Z, Yan K, Ge G, et al. Exosomes derived from miR-155-5p-overexpressing synovial mesenchymal stem cells prevent osteoarthritis via enhancing proliferation and migration, attenuating apoptosis, and modulating extracellular matrix secretion in chondrocytes[J]. Cell Biol Toxicol, 2021, 37(1): 85-96.

[73] Chen C, Fu L, Luo Y, et al. Engineered exosome-functionalized extracellular matrix-mimicking hydrogel for promoting bone repair in glucocorticoid-induced osteonecrosis of the femoral head[J]. ACS Appl Mater Interfaces, 2023, 15(24): 28891-28906.

[74] Ryan VH, Dignon GL, Zerze GH, et al. Mechanistic view of hnRNPA2 low-complexity domain structure, interactions, and phase separation altered by mutation and arginine methylation[J]. Mol Cell, 2018, 69(3): 465-479.

[75] Liu XM, Ma L, Schekman R. Selective sorting of microRNAs into exosomes by phase-separated YBX1 condensates[J/OL]. eLife, 2021, 10: e71982[2025-10-15].

[76] Bai Y, Liu Y, Jin S, et al. Expression of microRNA-27a in a rat model of osteonecrosis of the femoral head and its association with TGF-β/Smad7 signalling in osteoblasts[J]. Int J Mol Med, 2019, 43(2): 850-860.

[77] Yang JX, Xie P, Li YS, et al. Osteoclast-derived miR-23a-5p-containing exosomes inhibit osteogenic differentiation by regulating Runx2[J]. Cell Signal, 2020, 70: 109504.

[78] Fang SH, Chen L, Chen HH, et al. miR-15b ameliorates SONFH by targeting Smad7 and inhibiting osteogenic differentiation of BMSCs[J]. Eur Rev Med Pharmacol Sci, 2019, 23(22): 9761-9771.

[79] Hao Y, Lu C, Zhang B, et al. CircPVT1 up-regulation attenuates steroid-induced osteonecrosis of the femoral head through regulating miR-21-5p-mediated Smad7/TGFβ signalling pathway[J]. J Cell Mol Med, 2021, 25(10): 4608-4622.

[80] Xiao M, Wang F, Chen N, et al. Smad4 sequestered in SFPQ condensates prevents TGF-β tumor-suppressive signaling[J]. Dev Cell, 2024, 59(1): 48-63.

[81] Li J, Wang W, Li S, et al. Smad2/3/4 complex could undergo liquid liquid phase separation and induce apoptosis through TAT in hepatocellular carcinoma[J]. Cancer Cell Int, 2024, 24(1): 176.

[82] Oh S, Yang J, Park C, et al. Dieckol attenuated glucocorticoid-induced muscle atrophy by decreasing NLRP3 inflammasome and pyroptosis[J]. Int J Mol Sci, 2021, 22(15): 8057.

[83] 王多贤, 曹林忠, 蒋玮, 等. 激素性股骨头坏死中的炎症小体激活与细胞焦亡[J]. 生命的化学, 2021, 41(8): 1733-1739.

[84] WANG Duoxian, CAO Linzhong, JIANG Wei, et al. Inflammasome activation and pyrolysis in hormone-induced femoral head necrosis[J]. Chemistry of Life, 2021, 41(8): 1733-1739.

[85] Shahzad K, Bock F, Al-Dabet MM, et al. Caspase-1, but not caspase-3, promotes diabetic nephropathy[J]. J Am Soc Nephrol, 2016, 27(8): 2270-2275.

[86] Wang J, Zhou Y, Zhang M, et al. YTHDF1-CLOCK axis contributes to pathogenesis of allergic airway inflammation through LLPS[J]. Cell Rep, 2024, 43(3): 113947.

[87] Schmacke NA, Hornung V. Decoding NLRP3: Phase separation enters the scene[J]. Cell Res, 2025, 35(6): 391-392.

[88] Zou G, Tang Y, Yang J, et al. Signal-induced NLRP3 phase separation initiates inflammasome activation[J]. Cell Res, 2025, 35(6): 437-452.

[89] Ma B, Cao P, Zhang L, et al. YTHDC2 inhibits rat bone mesenchymal stem cells osteogenic differentiation by accelerating RUNX2 mRNA degradation via M6A methylation[J/OL]. Heliyon, 2023, 9(8): e18876[2025-10-15].

[90] 原天祎, 刘洪江, 杨增强, 等. 激素性股骨头坏死中m6A相关基因差异性的鉴定[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(14): 2159-2165.

[91] YUAN Tianyi, LIU Hongjiang, YANG Zengqiang, et al. Identification of differences in N6-methyladenosine-related genes in steroid-induced femoral head necrosis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(14): 2159-2165.

[92] Su Y, Maimaitiyiming Y, Wang L, et al. Modulation of phase separation by RNA: a glimpse on N⁶-methyladenosine modification[J]. Front Cell Dev Biol, 2021, 9: 786454.

[93] Park J, Wu Y, Shao W, et al. Poly(GR) interacts with key stress granule factors promoting its assembly into cytoplasmic inclusions[J]. Cell Rep, 2023, 42(8): 112822.

[94] Liu ZY, Lin LC, Liu ZY, et al. N⁶-Methyladenosine-mediated phase separation suppresses NOTCH1 expression and promotes mitochondrial fission in diabetic cardiac fibrosis[J]. Cardiovasc Diabetol, 2024, 23(1): 347.

[95] Cheng Y, Xie W, Pickering BF, et al. N6-Methyladenosine on mRNA facilitates a phase-separated nuclear body that suppresses myeloid leukemic differentiation[J]. Cancer Cell, 2021, 39(7): 958-972.

[96] Ge Y, Chen R, Ling T, et al. Elevated WTAP promotes hyperinflammation by increasing M6A modification in inflammatory disease models[J/OL]. J Clin Invest, 2024, 134(14): e177932[2025-10-15].

[97] 闫玉珠, 于燕, 刘俊叶, 等. 酒精性和激素性股骨头坏死的外周血脂质组学分析[J]. 中南大学学报(医学版), 2022, 47(7): 872-880.

[98] YAN Yuzhu, YU Yan, LIU Junye, et al. Lipid metabolism analysis for peripheral blood in patients with alcohol-induced and steroid-induced osteonecrosis of the femoral head[J]. Journal of Central South University.Medical Science, 2022, 47(7): 872-880.

基金资助

国家自然科学基金(82260858)

国家自然科学基金(82460872)

广西高水平中医药重点学科建设试点项目(桂中医药科教发[2023]13号)

广西中医药重点研究室建设项目{桂中医药科教发[2023]9号}

广西青年岐黄学者培养项目{桂中医药科教发[2022]13号}

广西中医药大学“岐黄工程”高层次人才团队培育项目{桂中医大党[2024]3号}。This work was supported by the National Natural Science Foundation of China(82260858)

广西中医药大学“岐黄工程”高层次人才团队培育项目{桂中医大党[2024]3号}。This work was supported by the National Natural Science Foundation of China(82460872)

the Pilot project of the Construction of high-level Key disciplines of Traditional Chinese Medicine in Guangxi(GTYKEF[2023]13)

the Guangxi Key Research Office of Traditional Chinese Medicine Construction Project {GTYKEF[2023]9}, the Guangxi Youth Qhuang Scholars Training Project {GTYKEF [2022]13}, and the “Qhuang Project” high-level talent team Cultivation Project of Guangxi University of Traditional Chinese Medicine {[2024]3}, China.开放获取(Open access)：本文遵循知识共享许可协议，允许第三方用户按照署名-非商业性使用-禁止演绎4.0(CC BY-NC-ND 4.0┫的方式)

the Guangxi Key Research Office of Traditional Chinese Medicine Construction Project {GTYKEF[2023]9}, the Guangxi Youth Qhuang Scholars Training Project {GTYKEF [2022]13}, and the “Qhuang Project” high-level talent team Cultivation Project of Guangxi University of Traditional Chinese Medicine {[2024]3}, China.开放获取(Open access)：本文遵循知识共享许可协议，允许第三方用户按照署名-非商业性使用-禁止演绎4.0(在任何媒介以任何形式复制、传播本作品┣https://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/)

RIGHTS & PERMISSIONS

开放获取(Open access)：本文遵循知识共享许可协议，允许第三方用户按照署名-非商业性使用-禁止演绎4.0(CC BY-NC-ND 4.0)的方式，在任何媒介以任何形式复制、传播本作品(https://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/)。