NPLOC4通过增强Wnt/β-catenin介导的线粒体自噬促进肝细胞癌细胞增殖、侵袭和迁移

NPLOC4 promotes proliferation, invasion, and migration of hepatocellular carcinoma cells via enhancing Wnt/β-catenin-mediated mitophagy

摘要

目的 线粒体自噬失调可导致肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)的发生与发展。核蛋白定位4同源物(nuclear protein localization 4 homolog，NPLOC4)是多种细胞过程中的必需蛋白质，与多种肿瘤有关。研究表明NPLOC4参与线粒体自噬的调节，但其在HCC中的作用仍不清楚。本研究旨在探究NPLOC4在HCC线粒体自噬中的作用及调控机制。 方法 对来源于基因表达综合数据库(Gene Expression Omnibus，GEO)的GSE277232和GSE251942数据集中的RNA测序数据和来源于GeneCards数据库的线粒体自噬相关基因进行分析，筛选出HCC中与线粒体自噬相关的差异表达基因，并对NPLOC4的表达进行分析，同时通过蛋白质印迹法进行验证。采用干扰小RNA(small interfering RNA，siRNA)敲低HCC细胞中NPLOC4的表达以进行功能缺失试验。采用线粒体自噬相关蛋白质表达分析、透射电子显微镜、免疫荧光染色方法来分析线粒体自噬水平。 结果 通过生物信息学筛选发现，NPLOC4是一种关键的线粒体自噬相关差异表达基因。NPLOC4在HCC中显著高表达，并与不良临床预后相关(均P<0.05)。敲低NPLOC4抑制了HCC细胞增殖、迁移、侵袭，并促进了细胞凋亡(均P<0.05)。此外，敲低NPLOC4还抑制了HCC细胞线粒体自噬和Wnt/β-catenin信号通路(均P<0.05)。使用Wnt激动剂BML-284后，NPLOC4敲低对线粒体自噬的抑制作用被抵消(P<0.05)，这表明NPLOC4敲低通过抑制Wnt/β-catenin信号通路调控线粒体自噬。使用线粒体自噬诱导剂羰基氰化物间氯苯腙(carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazone，CCCP)后，也逆转了NPLOC4敲低对HCC细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用(均P<0.05)，这表明NPLOC4敲低通过调节线粒体自噬抑制HCC进程。 结论 NPLOC4在HCC中呈高表达。下调NPLOC4表达可抑制Wnt/β-catenin信号通路的激活，进而抑制线粒体自噬，最终抑制HCC细胞的增殖、迁移和侵袭。NPLOC4可能作为HCC潜在的生物标志物及治疗靶点。

Abstract

Objective Dysregulation of mitophagy contributes to the initiation and progression of hepatocellular carcinoma (HCC). Nuclear protein localization 4 homolog (NPLOC4) is an essential protein involved in various cellular processes and has been implicated in multiple cancers. Recent studies have suggested that NPLOC4 participates in the regulation of mitophagy; however, its role in HCC remains unclear. This study aims to investigate the role of NPLOC4 in mitophagy and its underlying regulatory mechanisms in HCC. Methods RNA sequencing data from the GSE277232 and GSE251942 datasets obtained from the Gene Expression Omnibus (GEO) database were analyzed together with mitophagy-related genes collected from the GeneCards database to identify differentially expressed mitophagy-related genes in HCC. NPLOC4 expression was further analyzed and validated by Western blotting. Small interfering RNA (siRNA)-mediated knockdown of NPLOC4 was performed in HCC cells for functional loss-of-function assays. Mitophagy levels were evaluated by analyzing the expression of mitophagy-related proteins, transmission electron microscopy, and immunofluorescence staining. Results Bioinformatics analysis identified NPLOC4 as a key differentially expressed mitophagy-related gene. NPLOC4 was significantly upregulated in HCC tissues and was associated with poor clinical prognosis (all P<0.05). Knockdown of NPLOC4 inhibited HCC cell proliferation, migration, and invasion, while promoting apoptosis (all P<0.05). In addition, NPLOC4 knockdown suppressed mitophagy and the Wnt/β-catenin signaling pathway in HCC cells (all P<0.05). Treatment with the Wnt agonist BML-284 abolished the inhibitory effect of NPLOC4 knockdown on mitophagy (P<0.05), indicating that NPLOC4 regulates mitophagy through activation of the Wnt/β-catenin pathway. Furthermore, treatment with the mitophagy inducer carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazone (CCCP) reversed the inhibitory effects of NPLOC4 knockdown on HCC cell proliferation, migration, and invasion (all P<0.05), suggesting that NPLOC4 silencing suppresses HCC progression by regulating mitophagy. Conclusion NPLOC4 is highly expressed in HCC. Downregulation of NPLOC4 inhibits activation of the Wnt/β-catenin signaling pathway, thereby inhibiting mitophagy and ultimately inhibiting HCC cell proliferation, migration, and invasion. These findings suggest that NPLOC4 may serve as a potential biomarker and therapeutic target for HCC.

Graphical abstract

关键词

肝细胞癌 / NPLOC4 / 线粒体自噬 / 增殖 / 迁移 / 侵袭

Key words

hepatocellular carcinoma / NPLOC4 / mitophagy / proliferation / migration / invasion

原发性肝癌是第六大常见的癌症类型，也是癌症相关死亡的第三大原因^[1]。肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是原发性肝癌的主要组织学类型，在肝癌诊断和死亡病例中占绝大多数。尽管进行了广泛的努力，晚期HCC的治疗选择仍然有限，5年生存率仍然很低^[2]。因此，识别和了解导致肿瘤发生与发展的分子机制至关重要。

线粒体自噬是一种选择性的自噬形式，其通过去除受损的线粒体，从而维持线粒体和细胞的稳态^[3]。近年来，线粒体自噬因其在肿瘤发生和进展中的双重作用而受到更多关注。在癌症的早期阶段，线粒体自噬通过消除受损的线粒体，减少活性氧(reactive oxygen species，ROS)的产生，从而维持细胞内稳态^[4]。例如，PTEN诱导的假定激酶1(PTEN-induced putative kinase 1，PINK1)和Parkin是泛素依赖性线粒体自噬途径中的关键蛋白质^[5]，已被证明在肿瘤抑制中至关重要^[6]。相反，在晚期肿瘤阶段，线粒体自噬通过调节肿瘤微环境中的代谢需求、细胞存活和炎症状态来促进肿瘤侵袭和转移^[4]。例如，铁氧还蛋白1(ferredoxin 1，FDX1)通过下调线粒体自噬和PI3K/Akt信号通路，诱导ROS产生，从而促进HCC进展^[7]。然而，线粒体自噬在HCC中的失调机制尚不完全清楚。

核蛋白定位4同源物(nuclear protein localization 4 homolog，NPLOC4)是多种细胞过程中的必需蛋白质，特别是与内质网相关的细胞过程。它作为含缬酪肽蛋白[valosin-containing protein (p97)，p97/VCP]复合物的辅助因子，通过泛素-蛋白酶体系统对蛋白质的质量控制和降解至关重要^[8]。NPLOC4已被证实与多种肿瘤有关^[9]，还可通过β-catenin/糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase 3β，GSK3β)通路调节线粒体自噬，加重心力衰竭^[10]。此外，Wnt/β-catenin信号通路与细胞功能和疾病进展中的线粒体自噬有着密切关系。例如，沉默驱动蛋白家族成员23(kinesin family member 23，KIF23)通过Wnt/β-catenin通路调节线粒体自噬，抑制甲状腺乳头状癌转移^[11]。然而，关于NPLOC4是否通过Wnt/β-catenin通路调节线粒体自噬参与HCC进展的研究较少。

本研究旨在探究NPLOC4在HCC进程中的关键作用，明确其与线粒体自噬的关联及潜在机制，以期为HCC的诊断和靶向治疗提供新的策略。

1 材料与方法

1.1 数据来源

使用基因表达综合数据库(Gene Expression Omnibus，GEO)中的GSE277232和GSE251942数据集来确定差异表达的mRNA，并分析NPLOC4 mRNA的表达。通过R软件包survminer绘制NPLOC4相关的Kaplan-Meier生存分析曲线。

1.2 细胞培养

本研究使用人正常肝细胞THLE-2(购自长沙艾碧维生物科技有限公司)和HCC细胞HepG2(购自武汉普诺赛生命科技有限公司)、Huh7(购自武汉普诺赛生命科技有限公司)、Huh6(购自武汉普诺赛生命科技有限公司)、MHCC-97H(购自长沙艾碧维生物科技有限公司)。细胞在37 ℃、5% CO₂的细胞培养箱中培养。HepG2、Huh7、Huh6细胞使用含1%抗生素和10%胎牛血清(均购自美国Sigma-Aldrich公司)的DMEM培养基。MHCC-97H细胞使用含1%抗生素和10%胎牛血清的MEM培养基。定期观察细胞生长状态，细胞进入对数生长期后可进行后续实验操作。

1.3 细胞处理

采用干扰小RNA(small interfering RNA，siRNA)敲低HCC细胞中NPLOC4的表达以进行功能缺失试验。使用Lipofectamine 2000转染试剂(购自美国Thermofisher公司)，严格按照说明书操作流程，将靶向敲低NPLOC4的质粒(si-NPLOC4)及其空白对照质粒(si-NC)转染至Huh7和MHCC-97H细胞。si-NPLOC4的具体序列如下：si-NPLOC4#1，5'-GACA-ATATCATGTTTGAGAAT-3'；si-NPLOC4#2，5'-GA-GCTTCTTGAGGATCCAAAA-3'；si-NPLOC4#3，5'- GACACCTATTTCCTAAGTTCA-3'。

为探究Wnt/β-catenin信号通路是否介导NPLOC4对线粒体自噬的调控作用，在Huh7和MHCC-97H细胞中转染si-NPLOC4后加入0.5 µmol/L BML-284(Wnt激动剂，购自美国MedChemExpress公司)处理24 h^[12]。

为探究线粒体自噬是否介导NPLOC4的促HCC作用，在Huh7和MHCC-97H细胞中加入10 µmol/L羰基氰化物间氯苯腙(carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazone，CCCP；线粒体自噬诱导剂，购自美国MedChemExpress公司)处理6 h^[13]后转染si-NPLOC4。

1.4 细胞转染

将5 μL si-NPLOC4或200 nmol/L si-NC与5 μL Lipofectamine 2000分别加入含有95 μL无血清DMEM/F12培养基的试管中。轻轻混匀内容物，室温孵育5 min。随后，小心合并2管内容物，总体积约为200 μL。将混合液在室温下再静置20 min。最后，将混合液均匀加入第3代Huh7和MHCC-97H细胞中。细胞在培养箱中于37 ℃孵育6 h后，更换为新鲜的完全培养基。

1.5 蛋白质印迹法

使用放射免疫沉淀测定(radioimmunoprecipitation assay，RIPA)裂解液(购自长沙艾碧维生物科技有限公司)从上述处理细胞中提取蛋白质。通过BCA蛋白质检测试剂盒(购自长沙艾碧维生物科技有限公司)进行蛋白质定量。经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate‑polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)分离后，将蛋白质通过电转移至硝酸纤维素膜上。将膜与一抗一起孵育，于4 ℃中过夜，随后用辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)标记的二抗处理，与膜共同室温孵育90 min。最后使用增强化学发光(enhanced chemiluminescence，ECL)液与膜孵育1 min，用滤纸吸尽液体，用塑封膜将膜包裹，凝胶成像系统成像。定量归一化采用β-actin作为内参。抗体的详细信息见表1。

1.6 实时荧光定量PCR

使用TRIzol试剂(购自美国Thermofisher公司)提取总RNA。随后，使用HiFiScript试剂盒(购自江苏泰州康为世纪公司)将分离出的RNA转化为cDNA(complementary DNA，cDNA)。选用反转录试剂盒(购自江苏泰州康为世纪公司)进行mRNA反转录。采用ABI Prism 7900HT序列检测系统对定量实时PCR结果进行分析，使用β-actin作为内参。通过2^-ΔΔCt方法对基因表达水平进行量化。引物序列详情见表2。

1.7 细胞活力检测

采用细胞计数试剂盒-8(cell counting kit-8，CCK-8)检测细胞活性。将处于对数生长期的细胞用完全培养基调整密度至1×10⁴个/mL，以每孔300 μL的体积接种于24孔细胞培养板。将培养板置于37 ℃、5% CO₂的恒温培养箱中预培养24 h，待细胞完全贴壁后，按照上述方法对细胞进行处理，去除含药培养基，每孔加入300 μL含有CCK-8的培养基，将培养板放回培养箱继续孵育4 h后，在450 nm波长处测定吸光度值，通过吸光度值变化反映细胞活性的改变。

1.8 细胞凋亡检测

将经以上处理的细胞使用不含乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA)的胰酶消化收集后，用磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)洗涤2次(每次以1 500 r/min离心5 min)，随后加入500 μL Binding buffer悬浮细胞，并依次加入5 μL 别藻蓝蛋白标记的膜联蛋白V(Annexin V APC)与 5 μL碘化丙啶混匀，于室温避光条件下反应10 min，在1 h内采用流式细胞仪进行观测分析。

1.9 细胞侵袭试验

实验于操作前一天将无菌枪头、EP管、人工基膜(Matrigel)及Transwell小室置于4 ℃预冷；正式实验时，每孔加入100 μL预冷的无血清DMEM培养基稀释的Matrigel(终浓度200 μg/孔)，于37 ℃孵育 30 min后吸弃上清，并在小室下层加入500 μL含10%胎牛血清的完全培养基。随后，将前述处理的细胞经胰酶消化为单细胞悬液，用无血清培养基重悬至浓度为2×10⁶个细胞/mL，每孔加入100 μL细胞悬液，置于37 ℃培养箱中培养48 h。培养结束后，取出小室移至装有PBS的新孔中，使用PBS清洗上室3遍，用棉球轻轻擦净上室内表面细胞。接着用4%多聚甲醛固定20 min，取出Transwell膜，以0.1%结晶紫染色5 min并水洗5次。最后，将膜置于载玻片上，于倒置显微镜下观察上室外表面侵袭的细胞，随机选取3个视野进行计数分析。

1.10 细胞迁移试验

Transwell小室下层加入500 μL含10% Gibco胎牛血清的完全培养基后，将上述处理的细胞用胰酶消化为单细胞悬液，以无血清培养基重悬至密度为2×10⁶个/mL，取100 μL细胞悬液加入上室，置于37 ℃培养箱中培养48 h。余下步骤同细胞侵袭试验。最后于倒置显微镜下观察上室外表面迁移的细胞，随机选取3个视野进行计数分析。

1.11 透射电子显微镜

样本采用双重固定法处理：首先使用2.5%的戊二醛进行初步固定，随后通过四氧化锇蒸汽进行二次固定。采用超薄切片机将样本切成50~70 nm的超薄切片，之后使用醋酸铀和柠檬酸铅溶液进行重金属染色。染色后的载网需用三蒸水冲洗，随后置于铜网上进行支撑固定。采用Tecnai G2 Spirit型透射电子显微镜(transmission electron microscope，TEM；购自美国FEI公司)进行形态学评估，在80 kV电压下操作，成像放大倍数范围为5 000至10 000倍。病理医师通过数字图像分析，对病理特征进行标注，包括线粒体嵴断裂和双层膜自噬泡等。

1.12 免疫荧光染色

将细胞样本用4%的多聚甲醛固定30 min，再用0.3%的曲拉通于37 ℃处理30 min。随后，加入3%过氧化氢溶液，室温避光孵育15 min。用5%牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)溶液37 ℃封闭60 min。加入一抗微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3；购自美国Proteintech公司)，于4 ℃过夜，并于37 ℃孵育2 h。加入50 μL HRP二抗，于37 ℃孵育30 min。加入第一种520荧光染料反应10 min。滴加适量完全溶解的抗体洗脱液覆盖样本，于37 ℃放置10 min。再次依次加入3%过氧化氢溶液和5% BSA溶液处理相应时间，孵育一抗线粒体外膜转位酶20(translocase of outer mitochondrial membrane 20，TOM20；购自美国Proteintech公司)及二抗。然后用另一种620荧光染料反应10 min。最后，用4’, 6-二脒基-2-苯基吲哚(4’, 6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)对细胞核进行染色。用缓冲甘油封片，在荧光显微镜下观察。

1.13 统计学处理

使用GraphPad 8.0软件进行统计与分析。实验重复≥3次。实验结果均以均数±标准差表示。2组间比较采用非配对或配对双尾Student t检验；多组间比较采用单因素方差分析或双因素方差分析。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 NPLOC4在HCC中高表达且与不良预后有关

对GSE277232和GSE251942队列中HCC患者的肿瘤组织与邻近的慢性肝病组织的全基因组RNA测序数据进行分析，筛选出了差异表达的基因(图1A)。GSE277232队列的结果显示，804个基因在HCC中上调，1 971个基因下调。GSE251942队列的结果显示，5 510个基因在HCC中上调，1 591个基因下调。对GeneCards数据库中的线粒体自噬相关基因进一步分析显示，820个线粒体自噬相关基因在HCC中上调，1 439个线粒体自噬相关基因在HCC中下调。对GSE277232、GSE251942、HCC中上调的线粒体自噬相关基因取交集，得到17个共有差异基因：SQSTM1、FASN、USP36、HSPA1A、NPLOC4、FZD5、UGDH、TCHP、RPTOR、SCD、IKBKG、MOV10、SMAD3、AGO2、PUS1、RANGAP1、TRMU(图1B)。本研究选择NPLOC4作为重点研究对象。NPLOC4在GSE277232和GSE251942队列中的HCC患者肿瘤组织中均显著高表达(均P<0.05，图1C)。Kaplan-Meier生存分析表明NPLOC4高表达与HCC不良预后有关(P<0.001，图1D)。此外，蛋白质印迹法结果也显示，与人正常肝细胞THLE-2相比，NPLOC4在HCC细胞HepG2、Huh7、MHCC-97H、Huh6中表达均显著上调(均P<0.05)，且在Huh7和MHCC-97H细胞中表达最高(图1E)。这些结果表明，NPLOC4在HCC中高表达，且与不良预后有关。

2.2 敲低 NPLOC4 可抑制HCC细胞增殖、迁移、侵袭并促进细胞凋亡

向Huh7和MHCC-97H细胞转染si-NPLOC4质粒构建了NPLOC4敲低的HCC细胞系，其中si-NPLOC4#1的敲低效率最高，因此用于后续实验(图2A)。随后检测了NPLOC4敲低后对HCC细胞功能的影响，CCK-8结果显示，si-NPLOC4处理明显降低了HCC细胞的细胞活力(均P<0.05，图2B)。同时，si-NPLOC4还提高了HCC细胞的凋亡率(均P<0.05，图2C)。此外，敲低NPLOC4后，HCC细胞的侵袭和迁移能力减弱(均P<0.05，图2D和2E)。综上，敲低NPLOC4抑制了HCC细胞增殖、迁移、侵袭并促进细胞凋亡。

2.3 敲低 NPLOC4 可抑制HCC细胞线粒体自噬和Wnt/β-catenin信号通路

与si-NC组相比，si-NPLOC4组中线粒体自噬相关蛋白PINK1、Parkin、p-Parkin、LC3 Ⅱ/Ⅰ的表达下调，p62的表达均上调(均P<0.05，图3A)。同时，敲低NPLOC4后HCC细胞的自噬体数量也明显减少(均P<0.05，图3B)。si-NPLOC4组显示出较少的LC3/TOM20共定位(图3C)。这表明敲低NPLOC4抑制了HCC细胞线粒体自噬。敲低NPLOC4后，β-catenin和c-Myc的表达均下调(均P<0.05，图3D)，表明Wnt/β-catenin通路被抑制。综上，敲低NPLOC4抑制了HCC细胞线粒体自噬和Wnt/β-catenin信号通路。

2.4 敲低 NPLOC4 通过抑制Wnt/β-catenin信号通路调控线粒体自噬

蛋白质印迹法结果显示，敲低NPLOC4抑制了Wnt/β-catenin信号通路，而BML-284重新激活了Wnt/β-catenin信号通路(均P<0.05，图4A)。与si-NPLOC4组相比，si-NPLOC4+BML-284组中线粒体自噬相关蛋白PINK1、Parkin、p-Parkin、LC3 Ⅱ/Ⅰ的表达均上调，p62的表达下调(均P<0.05，图4B)。同时，应用BML-284后HCC细胞的自噬体数量也明显增加(均P<0.05，图4C)。此外，与si-NPLOC4组相比，si-NPLOC4+BML-284组显示出较多的LC3/TOM20共定位(图4D)。综上，敲低NPLOC4可通过阻断Wnt/β-catenin 信号通路来抑制线粒体自噬。

2.5 敲低 NPLOC4 通过抑制线粒体自噬进而抑制 HCC细胞增殖、迁移、侵袭并促进凋亡

CCK-8结果显示，CCCP处理明显增加了HCC细胞的细胞活力(均P<0.05，图5A)。同时，CCCP还降低了HCC细胞的凋亡率(均P<0.05，图5B)。应用CCCP后，HCC细胞的侵袭和迁移能力增强(均P<0.05，图5C和5D)。综上，敲低NPLOC4通过阻断线粒体自噬，进而抑制HCC细胞的增殖。

3 讨 论

HCC是人类最常见的恶性肿瘤之一，且患者预后不佳，迫切需要新的HCC治疗策略^[14]。本研究表明，NPLOC4在HCC的发展过程中起促癌作用。从机制上讲，NPLOC4可通过激活Wnt/β-catenin通路增强线粒体自噬。更重要的是，通过向HCC细胞转染si-NPLOC4抑制NPLOC4，可抑制HCC细胞增殖、迁移、侵袭并促进细胞凋亡，这为治疗HCC的新策略提供了依据。

线粒体的灵活性有助于HCC细胞在面对诸如缺氧、饥饿以及持续的化疗和靶向治疗等不利环境条件时维持生存^[15]。线粒体自噬导致的线粒体清除是对线粒体损伤的一种反应，有助于细胞适应微环境中的压力变化。该过程的失调已被证实是肿瘤进展的重要介导因素^[16]。因此，迫切需要深入理解HCC发展中调节线粒体自噬的因素。本研究通过生物信息分析筛选出了线粒体自噬相关的HCC差异表达基因NPLOC4。研究^[9]表明，NPLOC4与肿瘤的更高恶性潜能密切相关。在既往研究^[17]中NPLOC4已被证实在HCC中上调，且与肿瘤免疫微环境有关。类似地，本研究在HCC和正常肝细胞系中的表达验证，证明了NPLOC4在HCC中高表达，是一个独立的预后预测因子。敲低NPLOC4显著抑制了HCC的生长和侵袭。此外，敲低NPLOC4还抑制了HCC细胞线粒体自噬。并通过应用线粒体自噬诱导剂CCCP，证实了线粒体自噬介导了NPLOC4的促癌功能。值得注意的是，既往研究^[10]表明，敲低NPLOC4可通过调节β-catenin/GSK3β通路增强线粒体动力学和线粒体自噬，这与本研究中NPLOC4敲低抑制HCC细胞线粒体自噬的结论相反。这一差异可能源于以下原因：首先，细胞类型与疾病背景不同，既往研究^[10]基于血管紧张素II诱导的H9c2心肌细胞模型，而本研究聚焦于HCC。其次，下游作用靶点可能存在差异。尽管均涉及β-catenin通路，但不同细胞背景下NPLOC4调控的具体下游分子(如PINK1/Parkin轴或其他自噬相关基因)及信号交互网络可能截然不同，从而导致NPLOC4敲低对线粒体自噬产生相反调控效应。除线粒体自噬外，NPLOC4敲低还被发现增加内质网氧还酶1α(ERO1-like protein alpha，ERO1α)表达并破坏线粒体相关膜(mitochondria-associated membranes，MAMs)^[10]，而MAMs是调控线粒体形态、钙信号及动力学的重要结构平台，进一步支持其与分裂/融合过程的关联^[18]。

Wnt/β-catenin信号通路是一种在进化上具有高度保守性的通路，它在胚胎发育以及组织稳态的维持中起着关键作用^[19]。Wnt/β-catenin信号通路的失调与多种严重疾病的发生与发展有关，包括各种恶性肿瘤。例如，跨膜4L六家族成员1(transmembrane 4 L six family member 1，TM4SF1)通过上调Wnt/β-catenin信号通路来维持肿瘤干细胞特性并促进上皮-间充质转化，从而提高结直肠癌的复发和转移率^[20]。丝氨酸蛋白酶抑制剂家族H成员1(serpin family H member 1，SERPINH1)通过激活该通路来促进胃癌细胞的增殖和转移^[21]。在HCC中，Wnt/β-catenin通路被异常激活，以促进HCC细胞的增殖和迁移，并重塑肿瘤微环境，从而通过重编程肿瘤代谢来驱动HCC的进展^[22-23]。此外，在肿瘤微环境中，Wnt/β-catenin通路的异常激活不仅促进肿瘤发生，还通过诱导线粒体生物合成和调控线粒体功能影响细胞代谢。研究^[24]指出，非磷酸化β-catenin可驱动Wnt信号传导并引发代偿性线粒体生物发生，同时与线粒体自噬过程相联系，提示Wnt/β-catenin通路可能通过协调线粒体生成与清除来维持细胞能量稳态。例如，百里香酚酮能够调节Wnt/β-catenin信号通路，并通过其对线粒体自噬相关机制的影响，影响人类结肠癌HT-29细胞的生长动态^[25]。Wnt/β-catenin通路对线粒体自噬的调节作用也可能涉及β-catenin进入细胞核后对下游靶基因的转录激活，从而影响线粒体质量监控系统。例如，高表达Wnt/β-catenin通路下游靶基因c-Myc显著增强了线粒体的分裂和p62的聚集，从而促进了线粒体自噬^[26]。本研究发现，在HCC细胞中沉默NPLOC4会导致Wnt/β-catenin通路相关蛋白质(包括 β-catenin和c-Myc)的表达下调。值得注意的是，使用Wnt激动剂能够逆转NPLOC4基因敲除所导致的线粒体自噬标志物表达的增加。此外，加入线粒体自噬诱导剂CCCP能够部分恢复NPLOC4基因敲除所引起的HCC细胞增殖、迁移和侵袭能力的下降。这些研究结果表明，NPLOC4可能通过调节线粒体自噬，并借助Wnt/β-catenin信号通路，来影响HCC的形成。

然而，本研究仍存在一定局限性。目前的结论主要基于体外细胞实验，尚未在动物模型中验证NPLOC4对HCC肿瘤生长及转移的体内调控作用，也缺乏基于临床组织样本的回顾性或前瞻性队列分析。此外，NPLOC4与线粒体自噬之间的上下游因果关系及具体分子互作机制有待进一步阐明。未来研究将构建体内移植瘤及基因敲除动物模型，并结合临床HCC组织芯片进行验证，以推动NPLOC4从基础发现向临床应用的转化。

综上所述，在HCC的发生与发展过程中，NPLOC4基因的异常高表达通过介导线粒体自噬失调，促进HCC细胞的增殖、侵袭及转移。其潜在机制与Wnt/β-catenin信号通路的激活密切相关。在临床转化方面，NPLOC4在HCC组织中的显著高表达提示其具有作为液体活检标志物的潜力。由于NPLOC4的表达变化可通过外周血外泌体或循环肿瘤DNA等非侵入性手段检测，未来有望将其开发为HCC早期筛查及术后复发监测的辅助指标。此外，鉴于NPLOC4在驱动HCC恶性表型中的关键作用，靶向NPLOC4或其下游Wnt/β-catenin通路的小分子抑制剂研发具有可行性，可为晚期HCC患者提供新的治疗策略。

参考文献

[1] Sung H, Ferlay J, Siegel RL, et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries[J]. CA Cancer J Clin, 2021, 71(3): 209-249.

[2] Llovet JM, Kelley RK, Villanueva A, et al. Hepatocellular carcinoma[J]. Nat Rev Dis Primers, 2021, 7: 6.

[3] Rugarli EI, Langer T. Mitochondrial quality control: a matter of life and death for neurons[J]. EMBO J, 2012, 31(6): 1336-1349.

[4] Panigrahi DP, Praharaj PP, Bhol CS, et al. The emerging, multifaceted role of mitophagy in cancer and cancer therapeutics[J]. Semin Cancer Biol, 2020, 66: 45-58.

[5] 许允, 李异. PINK1/Parkin介导的线粒体自噬在异烟肼诱导的肝细胞损伤中的作用[J]. 中南大学学报(医学版), 2022, 47(9): 1200-1207.

[6] Xu Yun, Li Yi. Regulatory effect of PINK1/Parkin axis on mitophagy in isoniazide-induced hepatocellular injury[J]. Journal of Central South University. Medical Science, 2022, 47(9): 1200-1207.

[7] Drake LE, Springer MZ, Poole LP, et al. Expanding perspectives on the significance of mitophagy in cancer[J]. Semin Cancer Biol, 2017, 47: 110-124.

[8] Sun B, Ding P, Song Y, et al. FDX1 downregulation activates mitophagy and the PI3K/AKT signaling pathway to promote hepatocellular carcinoma progression by inducing ROS production[J]. Redox Biol, 2024, 75: 103302.

[9] Körner M, Müller P, Das H, et al. p97/VCP is required for piecemeal autophagy of aggresomes[J]. Nat Commun, 2025, 16: 4243.

[10] Wang N, Zhu D, Liu Y, et al. NPLOC4 is a potential target and a poor prognostic signature in lung squamous cell carcinoma[J]. Sci Rep, 2023, 13: 20430.

[11] Ren K, Luan Y, Sun Y, et al. NPLOC4 aggravates heart failure by regulating ROS and mitochondrial function[J]. Int Immunopharmacol, 2024, 142: 113199.

[12] Liu Y, Zhang J, Chen Y, et al. KIF23 silencing suppresses papillary thyroid carcinoma metastasis by regulating mitophagy via Wnt/β-catenin pathway[J/OL]. Endocr Connect, 2025, 14(10): e250090[2026-04-02].

[13] Wei J, Zheng X, Li W, et al. Sestrin2 reduces cancer stemness via Wnt/β-catenin signal--ing in colorectal cancer[J]. Cancer Cell Int, 2022, 22(1): 75.

[14] Park YS, Choi SE, Koh HC. PGAM5 regulates PINK1/Parkin-mediated mitophagy via DRP1 in CCCP-induced mitochondrial dysfunction[J]. Toxicol Lett, 2018, 284: 120-128.

[15] Llovet JM, Pinyol R, Yarchoan M, et al. Adjuvant and neoadjuvant immunotherapies in hepatocellular carcinoma[J]. Nat Rev Clin Oncol, 2024, 21(4): 294-311.

[16] Zong W, Rabinowitz JD, White E. Mitochondria and cancer[J]. Mol Cell, 2016, 61(5): 667-676.

[17] Chourasia AH, Boland ML, MacLeod KF. Mitophagy and cancer[J]. Cancer Metab, 2015, 3(1): 4.

[18] Zhang W, Liu C, Zhou X. NPLOC4 constructs tumor immunosuppressive microenvironment in pan-cancer and hepatocellular carcinoma[J/OL]. Curr Med Chem(2025-06-17)[2026-04-18].

[19] Liu J, Song X, Yan Y, et al. Role of GTPase-dependent mitochondrial dynamins in heart diseases[J]. Front Cardiovasc Med, 2021, 8: 720085.

[20] Liu J, Xiao Q, Xiao J, et al. Wnt/β-catenin signalling: function, biological mechanisms, and therapeutic opportunities[J]. Signal Transduct Target Ther, 2022, 7(1): 3.

[21] Tang Q, Chen J, Di Z, et al. TM4SF1 promotes EMT and cancer stemness via the Wnt/β-catenin/SOX2 pathway in colorectal cancer[J]. J Exp Clin Cancer Res, 2020, 39(1): 232.

[22] Tian S, Peng P, Li J, et al. SERPINH1 regulates EMT and gastric cancer metastasis via the Wnt/β-catenin signaling pathway[J]. Aging, 2020, 12(4): 3574-3593.

[23] Tian W, Li J, Wang Z, et al. HYD-PEP06 suppresses hepatocellular carcinoma metastasis, epithelial-mesenchymal transition and cancer stem cell-like properties by inhibiting PI3K/AKT and WNT/β-catenin signaling activation[J]. Acta Pharm Sin B, 2021, 11(6): 1592-1606.

[24] Huang Y, Sheng H, Xiao Y, et al. Wnt/β-catenin inhibitor ICG-001 enhances the antitumor efficacy of radiotherapy by increasing radiation-induced DNA damage and improving tumor immune microenvironment in hepatocellular carcinoma[J]. Radiother Oncol, 2021, 162: 34-44.

[25] Denk D, Petrocelli V, Conche C, et al. Expansion of T memory stem cells with superior anti-tumor immunity by Urolithin A-induced mitophagy[J]. Immunity, 2022, 55(11): 2059-2073.

[26] Moulana MS, Haiaty S, Bazmani A, et al. Tumoricidal properties of thymoquinone on human colorectal adenocarcinoma cells via the modulation of autophagy[J]. BMC Complement Med Ther, 2024, 24(1): 132.

[27] Yang K, Zhang X, Yang K, et al. Overexpression of c-Myc triggers p62 aggregation-mediated mitochondrial mitophagy in cabozantinib resistance of hepatocellular carcinoma[J]. Mol Med, 2025, 31(1): 209.

基金资助

湖南省自然科学基金(2023JJ30910)

湖南省自然科学基金(2025JJ90293┫。This work was supported by the Natural Science Foundation of Hunan Province)

湖南省自然科学基金(China ┣2023JJ30910)

湖南省自然科学基金(2025JJ90293)

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