内质网应激抑制剂4-苯基丁酸对脓毒症小鼠心肌损伤的保护作用

Protective effect of the endoplasmic reticulum stress inhibitor 4-phenylbutyric acid against myocardial injury in septic mice

摘要

目的 内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)是脓毒症相关心肌损伤(sepsis-related myocardial injury，SRMI)发生和发展的重要病理生理机制之一。本研究旨在探讨ERS抑制剂4-苯基丁酸(4-phenylbutyric acid，4PBA)对脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)诱导的SRMI的保护作用。 方法 给予C57BL/6J雄性小鼠腹腔注射LPS构建小鼠SRMI模型。在第1组实验中，将小鼠随机分为5组(n=6)：对照(control)组、LPS 6 h组、LPS 12 h组、LPS 24 h组和LPS 48 h组。在第2组实验中，将小鼠随机分为4组(n=6)：control组、LPS组、衣霉素(tunicamycin，TM)组、TM+LPS组。在第3组实验中，将小鼠随机分为4组(n=6)：control组、LPS组、4PBA组、4PBA+LPS组。在第4组实验中，将小鼠随机分为4组(n=8)：LPS组、TM组、TM+LPS组、4PBA+LPS组。在注射LPS前6 h，腹腔注射TM(0.5 mg/kg)，注射LPS前6 h及注射后6 h给予4PBA(10 mg/kg)。采用心脏超声检测评价小鼠心功能，酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)检测小鼠血浆中心肌肌钙蛋白I(cardiac troponin I，cTnI)和肌酸激酶同工酶(creatine kinase-MB，CK-MB)的水平及心脏组织中白细胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)的含量，苏木精-伊红(hematoxylin-eosin，HE)染色观察心肌组织形态学变化，蛋白质印迹法检测心脏组织中ERS相关蛋白质肌醇需求酶1α(inositol-requiring enzyme 1α，IRE1α)、磷酸化蛋白激酶R样内质网激酶(phospho-protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase，p-PERK)、激活转录因子6的剪切形式(cleaved-activating transcription factor 6，cleaved-ATF6)、剪接型X盒结合蛋白1(spliced X-box binding protein 1，XBP1s)、CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CCAAT enhancer binding protein-homologous protein，CHOP)、葡萄糖调节蛋白78(glucose regulated protein 78，GRP78)，以及炎症因子肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)的表达情况。采用LPS处理HL-1小鼠心肌细胞系构建脓毒症细胞模型。分别采用原位末端转移酶标记法(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end labeling，TUNEL)、线粒体膜电位染色评估心肌细胞凋亡及线粒体膜电位的变化。 结果 与control组比较，LPS 6 h组、LPS 12 h组、LPS 24 h组和LPS 48 h组小鼠左室射血分数(ejection fraction，EF)、短轴缩短率(fractional shortening，FS)随时间推移先降低后恢复，血浆cTnI、CK-MB水平和心肌组织IL-1β水平先升高后下降，心脏组织ERS相关蛋白质IRE1α、XBP1s、p-PERK、CHOP、cleaved-ATF6、GRP78均显著升高(均P<0.05)，心肌组织出现明显水肿、肌纤维断裂及血管间隙消失。与LPS组相比，4PBA+LPS组小鼠EF、短轴FS均显著回升，血浆cTnI、CK-MB水平及心肌组织IL-1β水平均显著下降，心肌组织中ERS相关蛋白质及炎症因子TNF-α表达水平均显著下调(均P<0.05)；心肌组织病理损伤明显改善，小鼠的5 d生存率有升高趋势。TM+LPS组则呈现与4PBA+LPS组相反的变化。在LPS处理HL-1小鼠心肌细胞系构建的脓毒症细胞模型中，线粒体膜电位检测结果显示，与LPS组比较，4PBA+LPS组线粒体膜电位改善(均P<0.05)；TUNEL凋亡检测结果显示，与LPS组比较，4PBA+LPS组TUNEL阳性细胞比率显著降低(均P<0.05)。 结论 激活ERS可加重LPS诱导的SRMI，4PBA通过抑制ERS的过度激活，减轻炎症反应，减少心肌细胞凋亡，改善心功能并降低病死率。靶向ERS可能成为脓毒症心肌损伤的潜在治疗策略。

Abstract

Objective Endoplasmic reticulum stress (ERS) is an important pathophysiological mechanism involved in the development and progression of sepsis-related myocardial injury (SRMI). This study aims to investigate the protective effect of the ERS inhibitor 4‑phenylbutyric acid (4PBA) against myocardial injury in lipopolysaccharide (LPS)‑induced SRMI. Methods An SRMI mouse model was established by intraperitoneal injection of LPS in male C57BL/6J mice. In experiment 1, mice were randomly assigned to 5 groups (n=6 per group): Control, LPS 6 h, LPS 12 h, LPS 24 h, and LPS 48 h groups. In experiment 2, mice were randomly assigned to 4 groups (n=6 per group): Control, LPS, tunicamycin (TM), and TM+LPS groups. In experiment 3, mice were randomly assigned to 4 groups (n=6 per group): Control, LPS, 4PBA, and 4PBA+LPS groups. In experiment 4, mice were randomly assigned to 4 groups (n=8 per group): LPS, TM, TM+LPS, and 4PBA+LPS groups. TM (0.5 mg/kg) was administered intraperitoneally 6 h before LPS injection, and 4PBA (10 mg/kg) was administered 6 h before and 6 h after LPS injection. Cardiac function was evaluated by echocardiography. Plasma cardiac troponin I (cTnI) and creatine kinase-MB (CK-MB) levels and cardiac tissue interleukin-1β (IL-1β) levels were measured by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Histopathological changes in myocardial tissue were examined using hematoxylin-eosin (HE) staining. Western blotting was performed to determine the expression of ERS-related proteins, including inositol-requiring enzyme 1α (IRE1α), phosphorylated protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase (p-PERK), cleaved-activating transcription factor 6 (cleaved-ATF6), spliced X-box binding protein 1 (XBP1s), CCAAT enhancer binding protein-homologous protein (CHOP), and glucose-regulated protein 78 (GRP78), as well as the inflammatory factor tumor necrosis factor-α (TNF-α), in cardiac tissue. An in vitro sepsis model was established by treating HL-1 mouse cardiomyocytes with LPS. Cardiomyocyte apoptosis and mitochondrial membrane potential (ΔΨm) were evaluated using terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end labeling (TUNEL) and JC-1 mitochondrial membrane potential assays, respectively. Results Compared with the control group, left ventricular ejection fraction (EF) and fractional shortening (FS) in the LPS 6 h, LPS 12 h, LPS 24 h, and LPS 48 h groups initially decreased and subsequently recovered over time, whereas plasma cTnI and CK-MB levels and myocardial IL-1β levels initially increased and subsequently decreased; these differences were statistically significant (all P<0.05). The expression levels of the ERS-related proteins IRE1α, XBP1s, p-PERK, CHOP, cleaved-ATF6, and GRP78 in cardiac tissues were significantly increased (all P<0.05). Marked myocardial edema, myofibrillar disruption, and loss of vascular spaces were observed. Compared with the LPS group, the 4PBA+LPS group showed significantly increased EF and FS, significantly decreased plasma cTnI and CK-MB levels and myocardial IL-1β level, and significantly reduced expression of ERS-related proteins and the inflammatory factor TNF-α in cardiac tissues (all P<0.05). The 5-day survival rate of mice showed an increasing trend, accompanied by marked amelioration of myocardial histopathological injury. The TM+LPS group showed changes in the opposite direction to those observed in the 4PBA+LPS group. In the LPS-treated HL-1 cardiomyocyte model, mitochondrial membrane potential was significantly improved in the 4PBA+LPS group compared with the LPS group (P<0.05), while the proportion of TUNEL-positive cells was significantly reduced (P<0.05). Conclusion Activation of ERS aggravates LPS-induced SRMI, whereas 4PBA attenuates excessive ERS activation, alleviates the inflammatory response, reduces cardiomyocyte apoptosis, improves cardiac function, and decreases mortality. Targeting ERS may represent a potential therapeutic strategy for sepsis-related myocardial injury.

Graphical abstract

关键词

脓毒症 / 心肌损伤 / 内质网应激 / 4-苯基丁酸 / 脂多糖 / 细胞凋亡

Key words

sepsis / myocardial injury / endoplasmic reticulum stress / 4-phenylbutyric acid / lipopolysaccharide / apoptosis

脓毒症相关心肌损伤(sepsis-related myocardial injury，SRMI)是脓毒症患者常见的并发症之一，在全球范围内，脓毒症患者的SRMI发生率为10%~70%，且合并心肌损伤的脓毒症患者通常预后不良^[1]。内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)是未折叠蛋白、错误蛋白过度累积所导致的内质网功能紊乱。持续的ERS将导致细胞内钙离子代谢障碍、氧化应激损伤、线粒体功能失衡，最终诱发各种类型的细胞死亡。ERS是SRMI发生和发展的重要病理生理机制之一^[2]。

ERS由3种内质网跨膜传感器介导，即肌醇需求酶1(inositol-requiring enzyme 1，IRE1)、磷酸化蛋白激酶R样内质网激酶(phospho-protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase，p-PERK)、激活转录因子6(activating transcription factor 6，ATF6)^[3]。这3种信号蛋白质识别氧化应激损伤、细胞内未折叠蛋白质及错误蛋白质持续累积、钙离子失衡等刺激信号后，相继被激活，进而启动下游的未折叠蛋白质应答(unfolded protein response，UPR)^[4]。在适应性阶段，UPR通过抑制蛋白质翻译和减少蛋白质进入内质网以减轻负荷；但若ERS持续存在，UPR则转而加速内质网功能崩溃，最终诱导凋亡等多种细胞死亡途径^[5]。

4-苯基丁酸(4-phenylbutyric acid，4PBA)是一种有效的ERS抑制剂，其通过稳定蛋白质构象、促进内质网内新生肽链的正确折叠、减少未折叠或错误折叠蛋白质的聚集，从而从源头上缓解ERS。已有研究^[6]证实，使用4PBA可显著减轻脓毒症诱导的多器官功能损害，如改善脓毒症诱导的CD4⁺ T细胞凋亡，并在脓毒症脑病小鼠中通过缓解炎症损伤、恢复线粒体动力学及改善认知功能发挥脑保护作用^[7]。然而，4PBA是否对SRMI具有保护效应，以及该效应是否依赖ERS通路，目前尚不清楚。因此，本研究采用脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)诱导小鼠SRMI模型，从ERS视角出发，初步探究4PBA在LPS诱导的心肌损伤中的保护作用，以期为SRMI的防治提供新的实验依据。

1 材料与方法

1.1 伦理声明

本研究已获得中南大学湘雅医院实验动物伦理委员会批准(审批号：XY20240110011)。

1.2 动物与分组

8周龄、体重20~25 g的清洁级C57BL/6J雄性小鼠购自长沙斯莱克生物科技有限公司。所有小鼠饲养于恒温、恒湿环境中，自由进食和饮水。适应性喂养1周后，在第1组实验中，将小鼠随机分为5组(n=6)：对照(control)组，以及LPS 6 h组、LPS 12 h组、LPS 24 h组和LPS 48 h组(分别为注射LPS后6、12、24和48 h)。在第2组实验中，将小鼠随机分为4组(n=6)：control组、LPS组、衣霉素(tunicamycin，TM)组、TM+LPS组。在第3组实验中，将小鼠随机分为4组(n=6)：control组、LPS组、4PBA组、4PBA+LPS组。在第4组实验中，将小鼠随机分为4组(n=8)：LPS组、TM组、TM+LPS组、4PBA+LPS组。

1.3 小鼠SRMI模型的建立及给药方案

给予小鼠腹腔注射LPS(上海阿拉丁生化科技股份有限公司，货号：L386714)建立SRMI模型，给药剂量为15 mg/kg。4PBA给药方案：在LPS注射前6 h及注射后6 h，给予腹腔注射4PBA(美国MCE公司，货号：HY-A0281)，给药剂量为10 mg/kg。预实验已验证该剂量不影响小鼠生存率，且经实时反转录聚合酶链反应(real-time reverse transcription PCR，RT-PCR)验证可显著下调心肌组织中ERS相关基因的转录水平。TM给药方案：于LPS注射前6 h，给予腹腔注射TM(美国MCE公司，货号：HY-A0098)，给药剂量为0.5 mg/kg。预实验已验证该剂量不影响小鼠生存率，且经RT-PCR验证可显著上调心肌组织中ERS相关基因的转录水平。Control组和LPS组小鼠给予腹腔注射等体积生理盐水。

1.4 小鼠心脏超声检测

使用美国GE公司Vivid IQ小动物高分辨超声成像系统对小鼠心脏功能进行检测。小鼠经异氟烷吸入麻醉后，取仰卧位固定，于左心室短轴乳头肌水平采集M型超声图像，连续记录至少10个稳定心动周期。所有测量参数取连续3个心动周期的平均值，分别计算左心室射血分数(ejection fraction，EF)和左心室短轴缩短率(fractional shortening，FS)。

1.5 酶联免疫吸附测定

采集小鼠眼眶静脉丛血液，离心分离血浆，用于检测心肌损伤标志物。分别采用小鼠心肌肌钙蛋白I(cardiac troponin I，cTnI)酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)试剂盒(武汉江莱生物科技有限公司，货号：JL11280)和小鼠肌酸激酶同工酶(creatine kinase-MB，CK-MB)ELISA试剂盒(武汉江莱生物科技有限公司，货号：JL12422)检测血浆中cTnI、CK-MB水平。

另取小鼠心肌组织(每只约取20 mg，去除血液)，充分研磨匀浆后离心，取上清液，采用小鼠白细胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)ELISA试剂盒(武汉凡科维生物技术有限公司，货号：F2040-A)检测组织中IL-1β的含量。

1.6 心肌组织病理学观察

处死小鼠后迅速取出心脏，经4%多聚甲醛固定、石蜡包埋后，制备厚度为5 μm的连续切片。行苏木素-伊红(hematoxylin-eosin，HE)染色，于光学显微镜下观察心肌组织的形态学改变，包括心肌细胞排列、间质水肿及炎症细胞浸润等情况。

1.7 蛋白质印迹法

提取小鼠心脏组织的总蛋白质，采用BCA法测定蛋白质浓度。取等量蛋白质行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(浓缩胶恒压80 V，30 min；分离胶恒压120 V)，待溴酚蓝指示剂到达凝胶底部，经湿转法(恒流250 mA，90 min)转移至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜。转膜完毕后，用5%的脱脂奶粉在室温下封闭1 h，分别加入一抗(稀释比及来源见表1)，于4 ℃孵育过夜。次日洗膜后，加入辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)标记的山羊抗兔IgG二抗(武汉三鹰生物技术有限公司，货号为RGAR001，稀释比1꞉5 000)，于室温下孵育1 h。采用增强化学发光(enhanced chemiluminescence，ECL)法显影，使用ImageJ软件分析条带灰度值，以微管蛋白(tubulin)为内参，计算目的蛋白质的相对表达量。

1.8 细胞实验

1.8.1 细胞培养与处理

HL-1小鼠心肌细胞系购自浙江美森细胞科技有限公司。细胞培养于含10%胎牛血清、1%青链霉素的专用培养基(配方为Claycomb培养基、0.1 mmol/L去甲肾上腺素、2 mmol/L L-谷氨酰胺等)，置于37 ℃、5% CO₂培养箱中。预实验采用不同浓度(1、2、5、10 μg/mL)LPS刺激HL-1细胞，通过检测ERS相关基因及炎症因子的转录水平，确定后续实验中LPS浓度为5 μg/mL。以同样的方式确定4PBA的浓度为2 mmol/L。

1.8.2 细胞凋亡检测

各组细胞处理结束后，以4%多聚甲醛固定，参照原位末端转移酶标记法(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end labeling，TUNEL)凋亡检测试剂盒说明书操作。采用DAPI复染细胞核后，于荧光显微镜下观察，并计数TUNEL阳性细胞的比例。

1.8.3 线粒体膜电位检测

采用JC-1荧光探针检测线粒体膜电位。细胞处理结束后，加入JC-1工作液，在避光条件下孵育30 min，洗涤后于荧光显微镜下观察红色聚集态(J-aggregates)和绿色单体态(monomer)的荧光强度，以红/绿荧光比值反映线粒体膜电位变化。

1.9 生存率观察

LPS注射后连续观察小鼠5 d，记录各组死亡例数及死亡时间。

1.10 统计学处理

采用GraphPad Prism 9.0软件进行数据分析。符合正态分布的计量资料以均数±标准差表示；2组间比较采用Student’s t检验；多组间比较采用单因素方差分析，若总体差异有统计学意义，则进一步采用Tukey检验进行两两比较；P<0.05为差异有统计学意义。生存曲线采用Kaplan-Meier法绘制，使用log-rank检验进行全局比较，再进行多重比较，并采用Bonferroni法进行校正，校正后的P<0.012 5为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 LPS致小鼠心功能障碍与血浆心肌损伤标志物水平升高

注射LPS后小鼠出现随时间依赖的心功能下降，B型超声显示，左心室腔逐渐缩小、心内膜边界模糊、室壁搏动减弱；M型超声同步显示室壁运动幅度明显降低(图1A)。定量结果进一步证实，LPS 6 h、LPS 12 h及LPS 24 h组小鼠的左心室EF(图1B)和左心室短轴FS(图1C)均显著低于control组(均P<0.05)，LPS 48 h组回升至接近control组水平。

ELISA结果显示，LPS 6 h、LPS 12 h及LPS 24 h组小鼠血浆心肌损伤标志物CK-MB(图1D)和cTnI(图1E)的水平，以及心肌组织炎症因子IL-1β含量(图1F)均较control组显著升高(均P<0.05)，且LPS 12 h组升高最明显，LPS 24 h组和LPS 48 h组逐渐回落。

2.2 LPS诱导小鼠发生心肌形态及ERS标志物的改变

HE染色结果(图2A)显示，在低倍镜(×5)下，control组小鼠心室壁肌间间隔清晰，心肌肌束排列整齐，血管周围存在间隙；与control组比较，LPS 12 h组小鼠心室乳头肌平面室壁增厚及间质水肿。在高倍镜(×20)下，心肌细胞肿胀、肌间间隙明显增宽，部分心肌纤维断裂、排列紊乱，血管周围间隙消失。

蛋白质印迹法(图2B、2C)结果显示，与control组比较，LPS可显著上调IRE1α、剪接型X 盒结合蛋白1(spliced X-box binding protein 1，XBP1s)、p-PERK、CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CCAAT enhancer binding protein-homologous protein，CHOP)、激活转录因子6的剪切形式(cleaved-activating transcription factor 6，cleaved-ATF6)及其下游蛋白质葡萄糖调节蛋白78(glucose regulated protein 78，GRP78)的表达(均P<0.05)。提示LPS诱导的心肌损伤伴随3条ERS通路的共同激活。

2.3 TM加重LPS诱导的小鼠ERS、心肌损伤及心功能障碍

蛋白质印迹法(图3)结果显示，TM+LPS组小鼠心肌组织ERS相关蛋白质IRE1α、p-PERK、CHOP、GRP78及cleaved-ATF6的表达水平均较LPS组进一步升高(均P<0.05)。

心脏超声检查结果显示，与LPS组比较，TM+LPS组小鼠左心室EF及左心室短轴FS进一步下降(均P<0.05，图4A~4C)。ELISA检测结果显示，TM+LPS组小鼠心肌组织IL-1β含量亦显著高于LPS组(P<0.05，图4D)。

2.4 4PBA对LPS诱导的小鼠心功能障碍及心肌损伤的改善作用

4PBA+LPS组小鼠心功能较LPS组显著改善。B型超声显示，左心室腔扩大、心内膜水肿减轻、室壁搏动增强；M型超声显示，心脏舒缩功能显著改善(图5A)。定量结果显示，左心室EF及左心室短轴FS较LPS组显著改善(均P<0.05，图5B、5C)。此外，4PBA+LPS组小鼠血浆心肌损伤标志物CK-MB及cTnI较LPS组小鼠也明显下降(均P<0.05，图5D、5E)。

HE染色结果(图6)显示，Control组和4PBA组小鼠的心肌组织形态正常，血管间隙清晰，肌节完整。与LPS组相比，4PBA+LPS组心肌肿胀显著改善，血管间隙恢复。提示4PBA对LPS诱导的心肌形态损伤具有保护作用。

Kaplan-Meier生存曲线(图7)显示，TM组与LPS组相比，5 d 生存率的差异具有统计学意义(均P<0.001)。4PBA+LPS组和TM+LPS组分别与LPS组相比，在经严格校正后均未达到显著性阈值(均P>0.012 5)，但2组呈现出明确的相反生存趋势，即4PBA+LPS组生存率升高，TM+LPS组生存率降低。4PBA+LPS组与TM+LPS组小鼠的5 d生存率差异有统计学意义(P<0.012 5)。

2.5 4PBA减轻LPS诱导的小鼠心肌炎症反应及凋亡

蛋白质印迹法结果显示，与control组比较，LPS组小鼠心肌组织凋亡相关蛋白B细胞淋巴瘤2(B-cell lymphoma 2，Bcl-2)/Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2-associated X protein，Bax)比值显著下降，心肌组织炎症因子肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)表达水平显著上调；与LPS组比较，4PBA+LPS组小鼠心肌组织凋亡相关蛋白Bcl-2/Bax比值显著增加，心肌组织炎症因子TNF-α表达水平显著下调(均P<0.05，图8A)。ELISA结果显示，与control组比较，LPS组小鼠心肌组织IL-1β含量显著增加；与LPS组比较，4PBA+LPS组小鼠心肌组织IL-1β含量显著减少(均P<0.05，图8B)。

在LPS处理HL-1小鼠心肌细胞系构建的脓毒症细胞模型中，线粒体膜电位检测结果显示，与LPS组比较，4PBA+LPS组线粒体膜电位改善(P<0.05，图9)；TUNEL凋亡检测结果显示，与LPS组比较，4PBA+LPS组TUNEL阳性细胞比率显著降低(P<0.05，图10)。

2.6 4PBA改善LPS诱导的小鼠心肌ERS的发生

蛋白质印迹法结果(图11)显示，与control组比较，LPS组小鼠心肌组织ERS相关蛋白质(IRE1α、p-PERK、cleaved-ATF6、CHOP、GRP78)的表达显著上调；与LPS组比较，4PBA+LPS组小鼠心肌组织ERS相关蛋白质(IRE1α、p-PERK、cleaved-ATF6、CHOP、GRP78)的表达显著下调，差异均有统计学意义(均P<0.05)。Control组和4PBA组上述ERS相关蛋白质的表达水平的差异无统计学意义(均P>0.05)。

3 讨 论

随着临床检测技术及床旁超声的发展，SRMI的检出率逐年提高。本研究结果显示，腹腔注射LPS可诱导小鼠出现时间依赖性的心功能障碍，心脏超声结果及心肌损伤标志物结果提示LPS能够诱导SRMI模型。该模型呈现先加重后缓解的“双相改变”特征^[8]，与临床脓毒症心肌抑制的可逆性特点一致^[9]。

ERS是细胞内蛋白质稳态调节的核心网络，由3条(IRE1、PERK和ATF6)通路组成^[10]。本研究结果提示，LPS诱导小鼠心肌组织发生ERS，3条ERS通路蛋白质均显著激活，提示其共同参与LPS诱导的心肌损伤。更为重要的是，在LPS心肌损伤模型中利用ERS激动剂TM进行功能增益实验，发现进一步激活ERS后，加重了小鼠心功能恶化和炎症反应。这一结果从“功能获得”角度直接证实了增强ERS的促损伤作用。ERS可通过启动凋亡程序、扰乱自噬和线粒体功能、影响钙离子流等机制损害心肌收缩功能^[11-12]。目前，已有多项研究^[13-14]聚焦于改善ERS从而减轻脓毒症所致的器官功能障碍。以上结果为靶向ERS干预SRMI提供了理论依据。

4PBA是一种低分子量脂肪酸，其能够直接协助内质网腔中新生肽链的正确折叠，稳定已合成蛋白质的空间构象，还可以通过减少新生蛋白的合成进入内质网，有效减轻蛋白质折叠负荷，从而缓解ERS^[15]。实验中，4PBA预处理改善了LPS诱导的心功能障碍、心肌酶升高、心肌水肿及生存率下降。机制层面，4PBA确实显著抑制了IRE1、p-PERK和cleaved-ATF6通路蛋白质及其下游XBP1s、CHOP、GRP78的表达，降低了TNF-α和IL-1β水平，改善了HL-1心肌细胞的线粒体膜电位和凋亡率。重要的是，在ERS受抑制的状态下，4PBA产生了对心功能和生存率的保护效应。结合TM通过“功能增强”加重ERS从而造成小鼠心肌损伤加重，而4PBA从“功能缺失”角度反向验证了其作用确实与ERS抑制相关。这些结果共同表明，ERS是LPS诱导心肌损伤的环节之一，4PBA抑制ERS的作用对SRMI具有保护作用，这与既往研究结果一致。既往研究^[16-17]发现，4PBA对其他脏器损伤也具有一定的保护作用。此外，4PBA单独处理组的心脏组织ERS相关蛋白和炎症因子表达与对照组无显著差异，心肌结构保持正常，提示生理状态下使用4PBA不会干扰心肌细胞正常的内质网功能，具有良好的安全性^[18]。

既往研究^[19]多认为4PBA可通过改善蛋白质折叠环境、减少错误折叠蛋白积聚，从而缓解ERS。然而，近期研究^[20]提示，4PBA还可能作为一种较弱的蛋白质翻译抑制剂发挥作用，通过减少新生蛋白质进入内质网降低蛋白质负荷。此外，4PBA还是一种弱的组蛋白去乙酰化酶( histone deacetylase，HDAC)抑制剂^[21]。但这3种机制各自的贡献还未被清晰阐述。Mimori等^[22]通过合成衍生物比较发现，4PBA的ERS抑制活性是其神经保护作用的主导机制，HDAC抑制活性较弱。结果提示4PBA不仅降低了IRE1α、p-PERK和cleaved-ATF6等通路信号蛋白质的表达水平，还降低了CHOP、XBP1s和GRP78等下游通路蛋白质的表达，这意味着4PBA至少是从某一途径整体改善ERS通路信号发挥作用。此外，4PBA的作用还包括对炎症因子TNF-α和IL-1β的抑制，以及对心肌细胞凋亡的抑制。线粒体膜电位(JC-1)检测反映了凋亡启动阶段的线粒体功能障碍，Bcl-2/Bax蛋白比值反映了凋亡调控阶段的平衡状态，而TUNEL染色则检测了凋亡末期的DNA断裂。上述3项指标从“上游启动—中游调控—下游执行”3个层面共同验证了4PBA对LPS诱导心肌细胞凋亡的全程抑制作用。以上研究提示4PBA对心肌炎症和凋亡的抑制可能是其缓解ERS后产生的下游保护效应。因此，4PBA对ERS的抑制效应可能是化学伴侣效应和蛋白质翻译抑制效应的叠加作用。此外，前文通过ERS激动剂TM提示ERS在LPS致死过程中发挥有害作用，而4PBA至少部分通过其缓解ERS的功能改善了小鼠的生存结局。后续研究可使用特异性ERS通路抑制剂(如IRE1抑制剂KIRA6)或HDAC抑制剂(如SAHA)进行平行比较，以进一步厘清主次。

本研究仍然存在局限性。首先，在脓毒症模型的选择上，小鼠LPS腹腔注射模型具有技术操作简便、可重复性高、剂量效应明确、对小鼠超声检测影响较小等突出优点。LPS模型是目前研究炎症信号通路和初步筛选候选药物的常用模型，适合侧重于探索内毒素激活的炎症通路及药物干预的相关研究。然而，该模型不能完全代表真正意义上的多菌性脓毒症，无法模拟感染病灶的动态演变。后续有必要在盲肠结扎穿刺多菌性脓毒症模型中进一步验证4PBA的心肌保护作用，以增强其临床转化意义。其次，机制方面，仅使用药理学干预，未结合基因敲除或特异性ERS通路抑制剂，尚不能将4PBA的保护效应完全归因于ERS抑制，因此在未来探索中，还需结合基因敲除、小干扰RNA沉默或更具特异性的ERS通路抑制剂(如p-PERK抑制剂、IRE1抑制剂)对4PBA保护作用进行精确定位和深入探索。再者，还缺乏对ERS影响心肌细胞功能的下游功能性评估。因此，该研究仅能反映ERS通路在蛋白质表达水平上的“激活倾向”，尚不能充分证明各通路的功能性激活及其在心肌损伤中的因果作用。尽管如此，通过功能增益和功能缺失双向验证，可以为靶向ERS治疗SRMI提供较可靠的动物和细胞实验证据。

综上所述，ERS是SRMI的重要病理机制之一，4PBA具有抑制ERS过度激活的效应，该效应与心肌细胞凋亡及炎症反应的减轻相关，且应用4PBA显著改善了脓毒症小鼠的心功能并降低了病死率，提示靶向ERS可能成为SRMI的潜在治疗策略。

参考文献

[1] Hollenberg SM, Singer M. Pathophysiology of sepsis-induced cardiomyopathy[J]. Nat Rev Cardiol, 2021, 18(6): 424-434.

[2] Zhang W, Jiang H, Wu G, et al. The pathogenesis and potential therapeutic targets in sepsis[J/OL]. MedComm, 2023, 4(6): e418[2026-05-01].

[3] Ren J, Bi Y, Sowers JR, et al. Endoplasmic reticulum stress and unfolded protein response in cardiovascular diseases[J]. Nat Rev Cardiol, 2021, 18(7): 499-521.

[4] Chen X, Shi C, He M, et al. Endoplasmic reticulum stress: molecular mechanism and therapeutic targets[J]. Sig Transduct Target Ther, 2023, 8(1): 352.

[5] Shreya S, Grosset CF, Jain BP. Unfolded protein response signaling in liver disorders: a 2023 updated review[J]. Int J Mol Sci, 2023, 24(18): 14066.

[6] Lu G, Li Q, Liu J, et al. Inhibition of endoplasmic reticulum stress and the downstream pathways protects CD4⁺ T cells against apoptosis and immune dysregulation in sepsis[J]. IUBMB Life, 2022, 74(11): 1070-1080.

[7] Xiong F, Wang C, Lu J, et al. 4-PBA exerts brain-protective effects against sepsis-associated encephalopathy in a mouse model of sepsis[J]. Exp Neurol, 2024, 375: 114738.

[8] Rehman A, Baloch N, Morrow JP, et al. Targeting of G-protein coupled receptors in sepsis[J]. Pharmacol Ther, 2020, 211: 107529.

[9] Zhang SZ, Li QY, Peng ZY, et al. Sepsis-induced cardiomyopathy: a comprehensive review of pathogenic mechanism and therapeutic strategies[J]. Ageing Res Rev, 2026, 115: 103025.

[10] Huang M, Cai S, Su J. The pathogenesis of sepsis and potential therapeutic targets[J]. Int J Mol Sci, 2019, 20(21): 5376.

[11] Jiang Z, Wen X, Mao Q, et al. 13-Methylpalmatine improves myocardial infarction injury by inhibiting CHOP-mediated cross-talk between endoplasmic reticulum and mitochondria[J]. Biomed Pharmacother, 2024, 179: 117342.

[12] Liu M, Dudley SC. The role of the unfolded protein response in arrhythmias[J]. Channels (Austin), 2018, 12(1): 335-345.

[13] 裴明欣, 邓可, 陈燕玲. 内质网应激和NLRP3炎症小体在急性肾损伤中的作用及其机制[J]. 中南大学学报(医学版), 2024, 49(3): 367-376.

[14] Pei Mingxin, Deng Ke, Chen Yanling. Role and mechanism of endoplasmic reticulum stress and NLRP3 inflammasome in acute kidney injury[J]. Journal of Central South University. Medical Science, 2024, 49(3): 367-376.

[15] 刘丹丹, 刘文佳, 谢利华, 等. 内质网应激抑制剂对脂多糖诱导的小鼠认知损伤的改善作用及其机制[J]. 中南大学学报(医学版), 2025, 50(6): 986-994.

[16] Liu Dandan, Liu Wenjia, Xie Lihua, et al. Ameliorative effects and mechanisms of an integrated endoplasmic reticulum stress inhibitor on lipopolysaccharide-induced cognitive impairment in mice[J]. Journal of Central South University. Medical Science, 2025, 50(6): 986-994.

[17] Basseri S, Lhoták Š, Sharma AM, et al. The chemical chaperone 4-phenylbutyrate inhibits adipogenesis by modulating the unfolded protein response[J]. J Lipid Res, 2009, 50(12): 2486-2501.

[18] 朱娱, 刘良明, 张杰, 等. 4-苯基丁酸早期处理对脓毒症大鼠血管通透性的保护作用[J]. 创伤外科杂志, 2020, 22(1): 37-41.

[19] Zhu Yu, Liu Liangming, Zhang Jie, et al. The protective effect of 4-phenylbutyric acid (PBA) pretreatment on vascular permeability of sepsis rats[J]. Journal of Traumatic Surgery, 2020, 22(1): 37-41.

[20] Ahmad F, Sinha A, Karim A, et al. ER stress inhibitor 4PBA attenuates hindlimb unloading-induced cardiac mitochondrial and metabolic dysfunction[J]. Pflugers Arch, 2025, 478(1): 11.

[21] 厉冰, 尚华, 梅孝臣, 等. 4-苯基丁酸对创伤性失血休克大鼠肝损伤的保护作用[J]. 中华实验外科杂志, 2021, 38(8): 1499-1502.

[22] Li Bing, Shang Hua, Mei Xiaochen, et al. Protective effect of 4-phenylbutyric acid on liver injury in rats with traumatic hemorrhagic shock[J]. Chinese Journal of Experimental Surgery, 2021, 38(8): 1499-1502.

[23] Zhang H, Mu Y, Li H, et al. Unfolded protein response in endoplasmic reticulum stress associated with retinal degenerative diseases: A promising therapeutic target[J]. Neural Regen Res, 2026, 21(4): 1339-1352.

[24] Stein D, Slobodnik Z, Tam B, et al. 4-phenylbutyric acid: Identity crisis; can it act as a translation inhibitor?[J/OL]. Aging Cell, 2022, 21(12): e13738[2026-05-01].

[25] Shimozono K, Kim Y, Hata T, et al. 4-phenylbutyric acid improves gait ability of UBAP1-related spastic paraplegia mouse model: therapeutic potential for SPG80[J]. Int J Mol Sci, 2025, 26(19): 9779.

[26] Mimori S, Ohtaka H, Koshikawa Y, et al. 4-Phenylbutyric acid protects against neuronal cell death by primarily acting as a chemical chaperone rather than histone deacetylase inhibitor[J]. Bioorganic Med Chem Lett, 2013, 23(21): 6015-6018.

基金资助

芙蓉实验室科研攻关项目(湖南省科学技术厅项目)(2025PT5001┫。This work was supported by the Scientific Research Program of Furong Laboratory (the Program of the Department of Science and Technology of Hunan Province))

芙蓉实验室科研攻关项目(湖南省科学技术厅项目)(China ┣2025PT5001)

开放获取(Open access)：本文遵循知识共享许可协议，允许第三方用户按照署名-非商业性使用-禁止演绎4.0(CC BY-NC-ND 4.0┫的方式)

开放获取(Open access)：本文遵循知识共享许可协议，允许第三方用户按照署名-非商业性使用-禁止演绎4.0(在任何媒介以任何形式复制、传播本作品┣https://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/)

RIGHTS & PERMISSIONS

开放获取(Open access)：本文遵循知识共享许可协议，允许第三方用户按照署名-非商业性使用-禁止演绎4.0(CC BY-NC-ND 4.0)的方式，在任何媒介以任何形式复制、传播本作品(https://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/)。