十二烷酰肉碱和肉豆蔻酸对小鼠肺泡上皮细胞系MLE-12细胞功能的影响

Effect of dodecanoylcarnitine and myristoleic acid on the cellular function of mouse alveolar epithelial cell line of MLE-12

摘要

目的 探究十二烷酰肉碱（dodecanoylcarnitine,DA）和肉豆蔻酸（myristoleic acid,MA）对小鼠肺泡上皮系MLE-12细胞功能的影响及其作用机制。方法 通过IL-4刺激MLE-12细胞构建炎症模型，采用ELISA检测细胞上清液中DA、MA以及鞘氨醇-1-磷酸（sphingosine-1-phosphate,S1P）表达水平；用DA和MA分别干预MLE-12细胞，RT-PCR、流式细胞术检测炎症因子IL-6和肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)表达变化及细胞内活性氧（reactive oxygen species,ROS）水平，进一步通过Western blot检测p-38 MAPK蛋白激酶（p38 mitogen activated protein kinase,p-38 MAPK）和src同源结构域2的酪氨酸磷酸酶1(src homology 2 domain containing phosphatase 1,SHP-1)等关键蛋白表达情况；使用S1PR2的抑制剂JTE-013预处理MLE-12细胞后重复上述实验，系统评估S1PR2信号通路在DA/MA介导的炎症反应及氧化应激调控中的分子机制。结果 IL-4刺激显著上调MLE-12细胞中DA、MA及S1P水平（P<0.05）。DA/MA干预组炎症因子IL-6、TNF-α表达量较对照组明显升高（P<0.05），同时ROS水平较对照组也有所增加（P<0.05）。Western blot结果显示DA/MA促进SHP-1去磷酸化及p-p38 MAPK活化，而JTE-013预处理可完全逆转上述效应（P<0.05）。结论 哮喘相关代谢物DA和MA通过激活S1PR2受体，促进SHP-1去磷酸化和p-p38 MAPK通路活化，加剧MLE-12细胞的炎症及氧化应激反应，本研究揭示了S1PR2在该通路中的核心调控作用。

关键词

哮喘 / 代谢 / 十二烷酰肉碱(DA) / 肉豆蔻酸(MA) / JTE-013 / 小鼠

Key words

asthma / metabolism / dodecanoylcarnitine （DA） / myristoleic acid （MA） / JTE-013 / mouse

支气管哮喘（简称哮喘）是一种以气道高反应性和可逆性气流受限为特点的慢性气道炎症性疾病，临床表现为反复发作的喘息、气短、胸闷及咳嗽^［1-2］。全球哮喘患病率持续上升，我国成人患病率达4.2%，成为重大公共卫生挑战^［3-4］。代谢组学作为新兴研究手段，通过系统分析哮喘患者与健康人群的代谢物差异，揭示其代谢状态变化规律及发病机制，为哮喘研究提供了新视角^［5］。

本课题组前期通过血清代谢组学分析发现，哮喘患者血清中的肉豆蔻酸（myristoleic acid，MA）和十二烷酰肉碱（dodecanoylcarnitine，DA）水平与健康人群存在显著差异，提示二者可能参与哮喘病理过程^［6］。MA是一种饱和脂肪酸，具有细胞毒性，能够诱导细胞凋亡和坏死^［7］。而DA作为酰基肉碱的一种，参与细胞能量生成和免疫反应，尤其在脂肪酸代谢中扮演关键角色^［8］。考虑到脂质在细胞信号转导和炎症调节中的重要作用^［9-10］，MA和DA可能通过影响这些过程参与哮喘的发病。此外，哮喘患者还存在特征性的鞘氨醇代谢谱改变，尤其是鞘氨醇-1-磷酸（sphingosine-1-phosphate，S1P）水平的异常升高^［6］。S1P作为一种关键的生物活性鞘脂类代谢物，在哮喘的发病过程中发挥着举足轻重的作用^［11］。S1P通过与不同部位的G蛋白耦联受体（S1PR1~S1PR5）结合，影响气道和肺组织内细胞的增殖、凋亡、炎症及免疫调节过程，其中S1PR2在哮喘中发挥着重要作用。在此过程中，S1PR2抑制剂JTE-013对小鼠肺泡上皮细胞系MLE-12的作用机制可能与DA/MA代谢异常密切相关。本研究旨在深入解析这些代谢物在哮喘中的功能网络，不仅有助于揭示疾病本质，更为靶向治疗策略的开发提供潜在分子靶点。

材料和方法

试剂

小鼠IL-4重组蛋白、MA和DA（美国MCE公司），JTE-013（上海ambole公司），抗鼠PE-IL-6、抗鼠APC-TNF-α（美国Biolegend公司），抗鼠MAPK P-P38一抗（美国Santa Cruz公司），抗鼠SHP-1一抗（英国Abcam公司），抗鼠MAPK P38一抗、抗鼠P-SHP-1一抗（上海Absin公司），抗鼠GAPDH一抗、山羊抗小鼠二抗IgG（美国Proteintech公司），小鼠S1P-ELISA试剂盒、小鼠DA-ELISA试剂盒、小鼠MA-ELISA试剂盒（上海原鑫生物科技有限公司），活性氧（reactive oxygen species，ROS）检测荧光探针DHE（北京百奥莱博公司）。

细胞培养和处理

MLE-12细胞系购自美国ATCC公司，以含10% FBS和1%青链霉素的DMEM培养基，在37 ℃、5% CO₂条件下培养。细胞密度达70%~80%时进行处理。实验起讫时间为2022年9月至2024年4月。实验分为6组：对照组（无干预）、IL-4组（20 ng/mL IL-4刺激24 h）、DA组（1.5 μmol/L DA干预24 h）、MA组（1.5 μmol/L MA干预24 h）、DA/JTE-013组（10 μmol/L JTE-013预处理1 h+1.5 μmol/L DA干预24 h）、MA/JTE-013组（10 μmol/L JTE-013预处理1 h+1.5 μmol/L MA干预24 h）。

细胞因子检测收集对数生长期的MLE-12细胞，以0.25%不含EDTA的胰蛋白酶消化，用含10%胎牛血清的培养基终止反应。150×g离心5 min后，弃上清，用预冷PBS缓冲液洗涤细胞2次。将细胞重悬于PBS缓冲液，调整浓度至1×10⁶个/mL制成单细胞悬液。依据固定/渗透试剂盒（美国R&D systems公司）说明处理细胞，使其便于抗体结合。之后，将细胞与荧光标记的抗TNF-α和抗IL-6抗体于4 ℃避光孵育30~60 min，再用PBS缓冲液洗涤2次。使用流式细胞仪（美国BD Biosciences公司）检测TNF-α和IL-6表达水平，采用FlowJo软件（10.0版）分析数据。

ELISA检测实验前，将ELISA试剂盒（上海原鑫生物科技有限公司）平衡至室温，准备好实验耗材。收集对数生长期且经处理的MLE-12细胞上清液，3 500×g离心10~15 min去除杂质。按试剂盒说明，先在酶标板孔中加入捕获抗体，37 ℃ 孵育1~2 h，洗涤后加入稀释好的细胞上清液、空白对照和标准品，再次37℃孵育1~2 h。随后依次加入生物素化检测抗体、链霉亲和素-HRP结合物，每次孵育后均洗涤。最后加入3，3’，5，5’–四甲基联苯胺（3，3’，5，5’-tetramethylbenzidine，TMB）底物溶液显色，用硫酸终止反应，在酶标仪450 nm波长下测定吸光度值，通过标准曲线计算样品中S1P、DA和MA的浓度，以此检测其在MLE-12细胞上清液中的表达水平。

定量RT-PCR 按照制造商说明，使用Trizol试剂（上海碧云天生物技术股份有限公司）提取MLE-12细胞总RNA，逆转录为cDNA，并通过SYBR PCR试剂盒（上海翌圣生物科技股份有限公司）进行RT-PCR反应。反应条件：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性5 s、60 ℃退火30 s，共40个循环；最后做熔解曲线分析。利用7500 PCR 仪器软件分析Ct值，以2^-ΔΔCt法计算目的基因相对表达量。以GAPDH作为内参基因，引物序列见表1。

Western blot

去除MLE-12细胞培养基，加入预冷的RIPA裂解液（含蛋白酶抑制剂），冰浴条件下充分裂解30 min。收集裂解液，离心（12 000×g，15 min），取上清液测定总蛋白浓度（BCA法）。将蛋白样品经SDS-PAGE（8%~12%分离胶）进行电泳，到达合适位置时切断凝胶，转至PVDF膜（湿法转移）。转膜完成后，用5%BSA封闭PVDF膜（室温，1 h）。封闭结束后，依次加入一抗（目标蛋白及GAPDH内参，稀释比例按说明书调整），4 ℃过夜孵育。次日弃去一抗，加入HRP标记的二抗，室温孵育1 h。PBST洗涤3次后，采用ECL化学发光试剂盒显影，用ImageLab软件（6.1.0版本）分析条带灰度值。

ROS检测

MLE-12细胞长至约80%密度时，替换培养基为含20 μmol/L二氯二氢荧光素二乙酸酯（dichloro-dihydro fluorescein diacetate，DCFH-DA）荧光探针的新鲜培养基。在37 ℃、5% CO²条件下避光孵育1 h，使探针转化为DCFH。孵育后，用新培养基洗去未进细胞探针。随后，收集细胞至流式细胞仪样品管，以488 nm激发波长和525 nm发射波长检测二氯二氢荧光素（dichloro-dihydro fluorescein，DCF）荧光。荧光强度反映MLE-12细胞内ROS水平，二者成正比。

统计学分析所有数据以x±s表示。采用Student t检验或单因素方差分析比较不同组别间的差异。利用GraphPad Prism软件进行图形绘制和分析，P<0.05为差异有统计学意义。

结果

成功构建IL-4诱导的MLE-12细胞炎症模型

为构建细胞炎症模型，本研究将MLE-12细胞分为IL-4组和对照组。在干预24 h后，对两组细胞中IL-6和TNF-α的表达情况进行对比分析。通过流式细胞术检测发现，IL-4组中IL-6和TNF-α的蛋白表达水平均显著高于对照组（图1），差异具有统计学意义（P<0.05）。同时，利用定量RT-PCR技术检测IL-6和TNF-α的mRNA表达水平，结果显示IL-4组的mRNA表达水平同样显著高于对照组（图1E、1F），差异具有统计学意义（P<0.05）。上述一系列结果表明，本研究成功构建了IL-4诱导的MLE-12细胞炎症模型。

IL-4促进MLE-12细胞分泌DA、MA和S1P

IL-4组和对照组培养24 h后，使用ELISA检测两组细胞的MA、DA和S1P表达。结果显示，IL-4组中MA、S1P、DA的表达水平相较于对照组均显著升高（图2），差异有统计学意义（P<0.05）。这一结果明确表明，IL-4能够有效地诱导MLE-12细胞分泌DA、MA和S1P。

JTE-013有效抑制DA和MA诱导的MLE-12细胞S1PR2表达实验设置对照组、DA组、MA组、DA+ JTE-013组和MA+ JTE-013组，各干预组的MLE-12培养24 h后，对各组细胞中S1PR2的表达情况进行检测。通过流式细胞术检测及定量RT-PCR检测发现，DA组和MA组中S1PR2的表达相较于对照组均明显上升（P<0.05，图3），表明DA和MA均能够促进S1PR2的表达。在DA和MA处理的同时加入JTE-013后，DA/MA+ JTE-013组中S1PR2的表达水平较DA组和MA组均显著降低（P<0.05，图3）。这提示S1PR2在DA和MA的作用机制中可能起着关键的调节作用。

JTE-013抑制DA和MA诱导的MLE-12细胞的炎症分泌

实验设置为对照组、DA组、MA组、DA+ JTE-013组和MA+ JTE-013组，各干预组的MLE-12培养24 h后，对炎症因子的表达进行检测。流式细胞术和RT-PCR检测结果均显示，DA组和MA组中IL-6和TNF-α的水平较对照组明显升高（P<0.05，图4），表明DA和MA均会促进炎症因子IL-6和TNF-α的表达。然而，当在DA和MA处理的同时加入JTE-013后，DA/MA+ JTE-013组中IL-6和TNF-α的表达水平较DA组和MA组均显著降低（P<0.05，图4）。这表明DA和MA均会促进炎症因子IL-6和TNF-α的表达，而加入S1PR2的抑制剂JTE-013后，能够有效抑制DA和MA促进MLE-12细胞的炎症分泌（图4）。

JTE-013抑制DA和MA诱导的MLE-12细胞氧化应激通过流式细胞术检测各组细胞内ROS水平，以此评估细胞的氧化应激状态。检测结果显示，DA组和MA组较对照组中MLE-12细胞的ROS+细胞比例显著上升（P<0.05，图5），表明DA和MA能够增强MLE-12细胞的氧化应激反应。然而，加入JTE-013后，DA和MA诱导的氧化应激反应受到明显抑制，ROS+细胞比例显著降低（P<0.05，图5），表明JTE-013能够有效地抑制DA和MA促进的MLE-12细胞氧化应激（图5）。

DA和MA通过调控S1PR2影响SHP-1和p38 MAPK通路来调节MLE-12细胞功能 Western blot对各组相关蛋白表达进行分析。结果发现，与对照组相比，DA组和MA组的p-SHP-1表达下调（P<0.05），而p-p38的表达上调（P<0.05，图6、图7）。表明DA和MA通过调控SHP-1和p38 MAPK通路来影响MLE-12细胞功能。进一步研究显示，这一调控作用是通过S1PR2介导的。在DA处理的同时加入JTE-013后，DA+ JTE-013组中p-SHP-1表达水平较DA组显著降低（P<0.05，图6B），而p-p38表达变化无统计学差异（图6C）。在MA处理的同时加入JTE-013后，MA+ JTE-013组中p-SHP-1表达水平较MA组降低（P<0.05，图7B），而p-p38表达水平较MA组升高（P<0.05，图7C）。JTE-013预处理可恢复SHP-1磷酸化水平，并抑制p-p38表达（图6、图7）。这表明S1PR2通过双向调控SHP-1磷酸化和p38活化参与了DA/MA的病理作用，从而影响MLE-12细胞的功能。

讨论

DA和MA干预MLE-12后，RT-PCR与流式细胞术的检测结果均表明IL-6、TNF-α等炎症因子表达上升，并加重MLE-12的氧化应激。本研究发现DA和MA高表达促进小鼠肺泡上皮细胞系炎症与氧化应激。S1PR2抑制剂JTE-013可抑制DA和MA的促炎与促氧化应激作用。DA和MA通过S1PR2调控SHP-1和p38 MAPK信号通路，影响细胞炎症与氧化应激表型。

脂质代谢与炎症的紧密关系不仅体现在多种疾病的发生发展中，更在哮喘这一呼吸系统疾病中扮演重要角色^［12］。脂质代谢紊乱常引发心血管疾病等健康问题，而炎症作为身体对刺激的防御反应，常与脂质代谢相互影响。哮喘作为一种气道炎症性疾病，其发病机制中脂质代谢的作用尤为关键。研究还表明，除了细胞因子，脂肪酸也在炎症中发挥重要作用，进一步证实了脂质代谢与炎症之间的紧密联系^［13-15］。MA是从肉豆蔻科植物种子中提取的ω-5单不饱和脂肪酸，通过硬脂酰辅酶A去饱和酶-1生物合成。这种脂肪酸在人体脂肪组织、牛奶、黄油及人造黄油中均存在^［16-17］。研究揭示，MA具有破骨细胞抑制、抗肥胖及抗癌等多重功效^［18-21］。DA则负责将脂肪酸和有机酸从细胞质转运至线粒体，以进行β-氧化反应，这是能量生成的关键步骤。肉碱在哮喘的发病与发展中扮演重要角色，其缺乏会导致线粒体游离辅酶A减少和酰基辅酶A增加，与进行性肺气肿有关^［8，22］。重度哮喘患者体内DA代谢较低，脂肪酸代谢障碍和痰液中DA转运蛋白SLC22A5水平降低，进一步表明哮喘患者存在肉碱和能量代谢失调^［8］。

本研究发现DA和MA通过S1PR2调控SHP-1和p38 MAPK通路，进而影响小鼠MLE-12细胞的功能。作为一种负调控因子，SHP-1与多种细胞因子和生长因子受体及免疫受体密切相关，其磷酸化和激活对于终止信号传导至关重要^［23-24］。在SHP-1表达缺失或降低的情况下，细胞因子/生长因子信号通路可能过度活跃，导致异常或病理反应^［23-24］。我们的实验数据表明，当加入DA和MA时，SHP-1去磷酸化，导致细胞内炎症因子IL-6和TNF-α水平升高。而S1PR2的抑制剂JTE-013能有效抑制DA和MA的这种作用，降低炎症因子的水平。此外，小鼠哮喘模型的研究也支持SHP-1在调节过敏反应中的关键作用，SHP-1磷酸酶活性的降低会增强Th2反应和气道高反应性^［25］。

在哮喘患者中，氧化应激的增加和抗氧化能力的降低尤为明显。既往研究^［26］表明，这种氧化应激和慢性炎症与脂质代谢紊乱的增加有关，SHP-1的抑制与气道炎症的发展有关，并增加ROS水平，在氧化应激下SHP-1缺陷细胞中，p-p38 MAPK和总p38 MAPK之间的比率显著增加^［26］。在我们的实验中，DA和MA干预MLE-12细胞后，p-SHP-1水平降低，p-p38 MAPK水平升高，ROS增加，从而促进MLE-12细胞的氧化应激。

综上所述，本研究发现了哮喘相关代谢物DA和MA通过激活S1PR2受体，促进SHP-1去磷酸化和p-p38 MAPK通路活化，加剧小鼠MLE-12细胞的炎症及氧化应激反应。本研究揭示了S1PR2在该通路中的核心调控作用，为哮喘靶向治疗提供了新策略。

参考文献

[1] PAPI A， BRIGHTLING C， PEDERSEN SE，et al ．Asthma［J］.Lancet，2018，391（10122）：783-800.

[2] WANG G， MCDONALD VM.Contemporary concise review 2020：asthma［J］.Respirology，2021，26（8）：804-811.

[3] Global burden of chronic respiratory diseases and risk factors，1990-2019：an update from the Global Burden of Disease Study 2019［J］.EClinicalMedicine，2023，59：101936.

[4] 周新，张旻.中国支气管哮喘防治指南（2020年版）解读［J］.诊断学理论与实践，2021，20（2）：138-143.

[5] CRESTANI E， HARB H， CHARBONNIER LM，et al.Untargeted metabolomic profiling identifies disease-specific signatures in food allergy and asthma［J］.J Allergy Clin Immunol，2020，145（3）：897-906.

[6] ZHU T， MA Y， WANG J，et al.Serum metabolomics reveals metabolomic profile and potential biomarkers in asthma［J］.Allergy Asthma Immunol Res，2024，16（3）：235-252.

[7] IGUCHI K， OKUMURA N， USUI S，et al.Myristoleic acid，a cytotoxic component in the extract from Serenoa repens，induces apoptosis and necrosis in human prostatic LNCaP cells［J］.Prostate，2001，47（1）：59-65.

[8] REINKE SN，NAZ S， CHALECKIS R，et al.Urinary metabotype of severe asthma evidences decreased carnitine metabolism independent of oral corticosteroid treatment in the U-BIOPRED study［J］.Eur Respir J，2022，59（6）：2101733.

[9] LOCHNER M， BEROD L， SPARWASSER T.Fatty acid metabolism in the regulation of T cell function［J］.Trends Immunol，2015，36（2）：81-91.

[10] CHIURCHIÙ V， LEUTI A， MACCARRONE M.Bioactive lipids and chronic inflammation：managing the fire within［J］.Front Immunol，2018，9（1）：38.

[11] PARK SJ，IM DS.Blockage of sphingosine-1-phosphate receptor 2 （S1P 2） attenuates allergic asthma in mice［J］.Brit J Pharmacol，2019，176（7）：938-949.

[12] 蒋艳，张韶泽，曾丹，1-磷酸鞘氨醇在呼吸系统疾病中的研究进展［J］.中国医师杂志，2021，23（12）：5.

[13] BROUWERS H， VON HEGEDUS J， TOES R，et al.Lipid mediators of inflammation in rheumatoid arthritis and osteoarthritis［J］.Best Pract Res Clin Rheumatol，2015，29（6）：741-755.

[14] FROMMER KW， SCHÄFFLER A， REHART S，et al.Free fatty acids：potential proinflammatory mediators in rheumatic diseases［J］.Ann Rheum Dis 2015，74（1）：303-310.

[15] FROMMER KW， HASSELI R， SCHÄFFLER A，et al.Free fatty acids in bone pathophysiology of rheumatic diseases［J］.Front Immunol，2019，10：2757.

[16] JIANG J， WOLK A， VESSBY B.Relation between the intake of milk fat and the occurrence of conjugated linoleic acid in human adipose tissue［J］.Am J Clin Nutr，1999，70（1）：21-27.

[17] COUVREUR S， HURTAUD C， LOPEZ C，et al.The linear relationship between the proportion of fresh grass in the cow diet，milk fatty acid composition，and butter properties［J］.J Dairy Sci，2006，89（6）：1956-1969.

[18] REINKE SN，NAZ S， CHALECKIS R，et al.Urinary metabotype of severe asthma evidences decreased carnitine metabolism independent of oral corticosteroid treatment in the U-BIOPRED study［J］.Eur Respir J，2022，59（6）：2101733.

[19] IGUCHI K， OKUMURA N， USUI S，et al.Myristoleic acid，a cytotoxic component in the extract from Serenoa repens，induces apoptosis and necrosis in human prostatic LNCaP cells［J］.Prostate，2001，47（1）：59-65.

[20] KWON JO， JIN WJ， KIM B，et al.Myristoleic acid inhibits osteoclast formation and bone resorption by suppressing the RANKL activation of Src and Pyk2［J］.Eur J Pharmacol，2015，768：189-198.

[21] QUAN LH， ZHANG C， DONG M，et al.Myristoleic acid produced by enterococci reduces obesity through brown adipose tissue activation［J］.Gut，2020，69（7）：1239-1247.

[22] FUJIOGI M， CAMARGO CA，JR， RAITA Y，et al.Integrated associations of nasopharyngeal and serum metabolome with bronchiolitis severity and asthma：a multicenter prospective cohort study［J］.Pediatr Allergy Immunol，2021，32（5）：905-916.

[23] ZHANG J， SOMANI AK， SIMINOVITCH KA.Roles of the SHP-1 tyrosine phosphatase in the negative regulation of cell signalling［J］.Semin Immunol，2000，12（4）：361-378.

[24] LIPAO， BADOUR K， SIMINOVITCH KA，et al.Nonreceptor protein-tyrosine phosphatases in immune cell signaling［J］.Annu Rev Immunol，2007，25（1）：473-523.

[25] KAMATA T， YAMASHITA M， KIMURA M，et al.src homology 2 domain-containing tyrosine phosphatase SHP-1 controls the development of allergic airway inflammation［J］.J Clin Invest，2003，111（1）：109-119.

[26] JANG MK， KIM SH， LEE KY，et al.The tyrosine phosphatase，SHP-1，is involved in bronchial mucin production during oxidative stress［J］.Biochem Biophys Res Commun，2010，393（1）：137-143.

基金资助

国家自然科学基金(82270026)