离体时间和冻存时间对生物样本库乳腺癌和食管癌冰冻组织样本RNA质量的影响

Impact of ischemia time and storage periods on RNA quality of fresh-frozen breast cancer and esophageal cancer tissue samples in biobank

摘要

目的 探讨离体时间和冻存时间对乳腺癌和食管癌冰冻组织样本RNA质量影响，为生物样本库建立科学规范的样本处理流程和质量控制标准提供理论依据。方法 采集6例乳腺癌患者和6例食管癌患者的肿瘤组织及其配对正常组织样本，冷冻保存于汕头市中心医院生物样本库。同时采集镜像组织制备石蜡切片进行形态学分析。根据样本离体时间分为<15 min组和15～30 min组，在冻存8～10个月（T₁）、14～16个月（T₂）、26～28个月（T₃）和38～40个月（T₄）4个时间点对样本进行RNA质量分析。结果 共检测96份组织样本，RNA完整性指数（RNA integrity number,RIN）≥6的高质量样本占93.8%（90/96），乳腺癌组高质量样本占89.6%（43/48），食管癌组高质量样本占97.9%（47/48）。乳腺癌组与食管癌组样本RIN值的差异有显著统计学意义（8.050 vs.8.600,P=0.009）。在食管癌组样本中，RIN值与RNA产量显著负相关（P<0.001），且肿瘤组织与正常组织RIN值的差异有显著统计学意义（7.550 vs.9.000,P<0.001），而乳腺癌组样本中肿瘤组织与正常组织RIN值的差异无统计学意义（8.200 vs.7.700,P=0.348）。RIN值与28S/18S显著正相关（P<0.001），其与肿瘤细胞百分比（P=0.676）和坏死细胞百分比（P=0.055）不相关。离体时间（<15 min和15～30 min:8.200 vs.8.300,P=0.932）和冻存时间（T₁～T₄:8.400、7.700、8.450和8.600,P=0.163）均不会对组织样本RIN值产生影响。结论 不同器官来源和不同组织类型的冰冻组织样本RNA质量存在差异性，有限的离体时间（≤30 min）和中长期冻存（38～40个月）对乳腺癌和食管癌冰冻组织样本RNA质量不会产生不利影响。

关键词

生物样本库 / RNA质量 / 离体时间 / 冻存时间 / 乳腺癌 / 食管癌

Key words

biobank / RNA quality / ischemia time / storage periods / breast cancer / esophageal cancer

生物样本库又称生物银行（biobank），主要是指标准化收集、处理、储存和应用健康或疾病生物体的生物大分子、细胞、组织和器官等样本，包括人体器官组织、全血、血浆、血清、生物体液或经处理过的生物样本（DNA、RNA和蛋白等）以及与这些生物样本相关的知情同意、临床、治疗、随访和病理等资料及其质量控制、信息管理与应用系统^［1］。标准化、规范化的生物样本库是精准医疗研究的重要支撑，也是开展生物医药研究和创新的重要基础。

我国生物样本库在近十年进入快速发展阶段，但仍面临标准化程度不足、质量控制体系不完善等问题^［2-3］。根据美国病理学家协会发布的《生物样本库认证项目检视清单》和国际生物和环境样本库协会（ISBER）颁布的《2023生物样本库最佳实践规范（第五版）》，在样本的采集、分装、入库、出库及检测过程中存在很多质控点，需利用各种分析技术对样本的质量进行评估^［4］。分析前变量是影响生物样本质量的重要因素^［5-6］，包括采集前和采集后两个阶段。采集前阶段的手术方法、用药情况、饮食和生活习惯等都可能会影响生物样本的细胞完整性和基因表达谱^［7-9］。采集前变量由于临床治疗的不确定性，无法得到很好的控制。相反，采集后阶段的离体时间、采集温度、冻存时间和运输温度等因素可以得到有效控制和标准化。如何减少样本采集后变量的干扰，建立科学规范的样本处理流程和质量管理体系，已成为生物样本库亟需解决的问题。

RNA完整性是评估生物样本质量的核心指标。组织样本RNA存在器官差异性，肝脏样本的RNA质量最高，而乳腺、胰腺、胃、结肠、直肠和脑样本的RNA质量较低^［10-12］，同一器官来源的肿瘤组织与正常组织的RNA质量也可能存在差异^［10］，而且不同组织类型样本的RNA对采集和保存条件的耐受性不同^［13］。离体时间和冻存时间也是影响样本RNA质量的重要因素。离体时间是手术切除组织和快速冷冻之间的间隔时间。随着离体时间的延长，组织内不稳定的活性生物分子逐渐降解，基因表达和蛋白质磷酸化模式也可能发生改变，从而影响后续生物实验结果的准确性^［14］。安德森癌症中心的指南建议冷缺血时间间隔10 min^［15］，美国临床肿瘤学会（ASCO）和美国病理学家学会（CAP）的相关指南建议组织的离体时间<20 min^［6］。长期冻存也会对组织样本RNA质量产生不利影响。随着样本冻存时间的延长，RNA质量逐年下降，相比其他器官组织样本，大脑、乳腺和胃组织样本的RNA降解速度更快，建议冻存时间≤5年^［10］。前瞻性冻存的组织样本的有效期限也是生物样本库面临的问题之一。

乳腺癌是女性常见恶性肿瘤，食管癌是粤东地区高发恶性肿瘤，目前评估离体时间和冻存时间对乳腺癌和食管癌冰冻组织样本RNA质量影响的研究有限^{［12， 16］}。本研究旨在探讨离体时间和中长期低温保存对乳腺癌和食管癌样本RNA质量的影响，以期为生物样本库建立科学规范的样本处理流程和质量控制标准提供理论依据。

资料和方法

组织样本来源

收集汕头市中心医院6例非特殊型浸润性乳腺癌患者根治术切除标本和6例食管鳞癌患者腹腔镜切除标本，于2019年2—10月冷冻保存于汕头市中心医院生物样本库。术前获得患者知情同意。采集样本的保存和使用经汕头市中心医院伦理委员会批准（批准号：〔2023〕科研022号）。

组织样本采集

按离体时间<15 min和15~30 min分组，每组6例，包括3例非特殊型浸润性乳腺癌标本和3例食管鳞癌标本，每例标本采集肿瘤组织（T）及其配对正常组织样本（N）。采集样本严格遵守汕头市中心医院生物样本库标准作业程序。手术标本离体前由手术医师通知生物样本库，离体组织先行大体摄像，再切割取材。先切割正常组织（距离肿瘤3 cm以上），再切割肿瘤组织，每例标本分割为4块，每块大小约2 mm×2 mm×2 mm，共计96份样本。用0.1%的DEPC水溶液洗净样本，迅速放入2 mL冻存管内，冻存管中预加4 mL的RNA later保存液。冻存管于4 ℃ 冰箱过夜，次日转移到-80 ℃超低温冰箱保存。使用朗珈生物样本库信息管理系统对样本信息进行登记，包括取材时间和离体时间。同时对镜像组织进行取材，用于制备福尔马林固定石蜡包埋（formalin-fixed paraffin-embedded，FFPE）样本，每块组织大小约20 mm×20 mm×3 mm，装入写有样本编号的塑料包埋框中，用中性福尔马林液预固定。

组织形态学分析

组织在中性缓冲福尔马林中固定过夜，梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片厚度3~5 μm，HE染色。由2名经验丰富的病理科医师评估组织中肿瘤细胞和坏死细胞的比例。

RNA质量分析

样本于-80 ℃ 冻存至设定时间进行RNA质量分析，冻存时间分别为8~10个月（T₁）、14~16个月（T₂）、26~28个月（T₃）和38~40个月（T₄）。由中国医药生物技术协会组织生物样本库分会和上海芯超生物科技有限公司提供第三方质控服务，采用安捷伦4200生物分析仪对样本进行分析，得到RNA产量、RNA完整性指数（RNA integrity number，RIN）、28S/18S等数据。RIN能客观反映RNA质量，是评价RNA质量的金标准：10为RNA完整性最好，0为RNA降解程度最高。

统计学分析

采用GraphPad Prism 9.5软件进行统计学分析。采用Spearman分析RIN值与RNA产量、28S/18S、肿瘤组织中肿瘤细胞和坏死细胞百分比的相关性。采用MannWhitney检验对乳腺癌组与食管癌组样本的RIN值进行分析，探讨不同器官来源的组织样本间RNA质量是否存在差异。采用Wilcoxon检验分析肿瘤组织及其配对正常组织之间的RIN值，探讨不同组织类型的样本间RNA质量是否存在差异。采用MannWhitney检验对比不同离体时间的组织样本RIN值。采用Kruskal-wallis检验对比不同冻存时间的组织样本RIN值。P<0.05为差异有统计学意义。

结果

样本形态学分析

对乳腺癌和食管癌的肿瘤组织及其配对正常组织的石蜡切片进行形态学评估，所有受检组织的细胞形态良好，染色清晰（图1）。TCGA（The Cancer Genome Atlas）数据库建议使用肿瘤细胞超过60%的样本，以确保基因表达结果能够反映肿瘤细胞，而不是基质细胞。通过坏死程度评估生物样本的质量，TCGA建议坏死细胞百分比<20%^［17-18］。肿瘤组织切片中，肿瘤细胞比例均>60%，坏死细胞比例均<20%，正常组织切片中无肿瘤细胞，因此认为所采集的组织样本具有代表性。

样本RNA质量分析

96份样本在4个冻存时间进行RNA质量分析，RIN值平均为7.360±1.680，RNA产量平均为（20.530±20.770） μg，28S/18S值平均为1.500±0.500。高质量样本（RIN≥6）占93.8%（90/96），其中乳腺癌组高质量样本占89.6%（43/48），食管癌组高质量样本占97.9%（47/48）。在RIN<6的6份样本中，3份乳腺癌正常组织样本检测不到RIN值（其中2份来源于同一标本，图2A），另有2份乳腺癌肿瘤组织样本（来源于同一乳腺癌标本，图2B）和1份食管癌肿瘤组织样本RIN值略低于6，分别为5.5、5.9和5.9，RNA有部分降解。

RIN值与RNA产量、28S/18S、组织学形态的相关性

乳腺癌组样本RIN值与RNA产量不相关（r=-0.152，P=0.301，图3A），食管癌组样本RIN值与RNA产量显著负相关（r=-0.489，P<0.001，图3B），所有组织样本RIN值与RNA产量不相关（r=-0.174，P=0.090，图3C）。RIN值与28S/18S正相关（r=0.437，P<0.001，图4A）。RIN值与肿瘤组织中肿瘤细胞百分比（r=-0.062，P=0.676，图4B）和坏死细胞百分比（r=-0.279，P=0.055，图4C）均不相关。

乳腺癌与食管癌样本RIN值对比

乳腺癌组正常组织的RIN值中位数为8.200，明显低于食管癌组正常组织的9.000（P<0.001，图5A）；乳腺癌组和食管癌组肿瘤组织RIN值中位数分别为7.700和7.550（P=0.613，图5B）；乳腺癌组样本的RIN值中位数为8.050，明显低于食管癌组的8.600（P=0.009，图5C）。

肿瘤组织与正常组织样本RIN值对比

乳腺癌组肿瘤组织和正常组织的RIN值中位数分别是8.200和7.700（P=0.348，图6A）。食管癌组肿瘤组织的RIN值中位数为7.550，明显低于正常组织的9.000（P<0.001，图6B）。

离体时间对样本RNA质量的影响

离体时间<15 min组和15~30 min组，每组包括3例非特殊型浸润性乳腺癌标本和3例食管鳞癌标本。<15 min组和15~30 min组乳腺癌样本RIN值中位数分别为8.200和7.700（P=0.239，图7A）。<15 min组和15~30 min组食管癌样本RIN值中位数分别为8.500和8.700（P=0.163，图7B）。<15 min组和15~30 min组样本RIN值中位数分别为8.200和8.300（P=0.932，图7C）。离体时间≤30 min对乳腺癌和食管癌样本的RNA质量均无影响。

冻存时间对样本RNA质量的影响

在T₁、T₂、T₃和T₄时，乳腺癌组样本RIN值中位数分别为8.300、7.600、8.050和8.300（P=0.142，图8A），食管癌组样本RIN值中位数分别为8.600、8.450、8.950和8.700（P=0.406，图8B），所有组织样本RIN值中位数分别为8.400、7.700、8.450和8.600（P=0.163，图8C）。不同冻存时间的乳腺癌和食管癌样本RIN值差异无统计学意义，有限的冻存时间对样本RNA质量无影响。

讨论

高质量的生物样本库对生命科学研究至关重要，分析前变量可能会影响组织样本RNA质量和科研数据可靠性。本研究选取6例非特殊型浸润性乳腺癌标本和6例食管鳞癌标本的肿瘤组织及其配对正常组织作为研究对象，探讨离体时间和冻存时间对组织样本RNA质量的影响。采用安捷伦4200生物分析仪对组织样本的RNA质量进行分析，仪器分析结果中的RIN值是被广泛认可的RNA完整性测量指标，比传统的通过28S/18S比值来判断RNA质量更优^［19］。RIN<5不适用于下游分析，5≤RIN<6适用于RT-qPCR，6≤RIN<8适用于基因阵列分析，RIN≥8适用于所有下游技术^［20］。普遍认为RIN≥6的样本可视为RNA完整，适用于多种基因表达的研究^［21］。

本研究的96份组织样本中高质量样本达到93.8%（90/96），只有6份组织样本RIN<6。研究发现RIN与28S/18S呈显著相关性，RIN值与传统的28S/18S判断RNA质量具有一致性。有3份乳腺癌正常组织样本检测不到RIN值和28S/18S，可能是由于乳腺癌正常组织中脂肪含量较高而影响到RNA的提取^［23］，提示我们在样本采集时尽量选取乳腺导管组织，减少样本分析前变量的干扰。另有3份肿瘤组织样本RNA有部分降解，RIN值分别为5.5、5.9和5.9，未达到高质量样本的标准。也有研究表明，5≤RIN<6的组织样本仍适合用于进一步的微阵列分析和长扩增子的qRT-PCR分析^［22-23］。建议在将样本将用于RNA相关实验之前，应进行适当的“适用”检测，评估样本中目标片段完整性再进行后续实验^［24］。在既往研究中RIN值与RNA产量的相关性存在争议，伊拉斯谟医学中心组织库提出RNA产量与质量的相关性在不同形态学组织中结果有所差异。具有高细胞含量和相对少量的脂肪、坏死或纤维组织成分的组织有较高的RNA产量和质量。但在一些情况下，优异的形态和高细胞含量与高RNA产量不相关，比如鳞状细胞在RNA提取过程中细胞难以破坏，导致RNA产量低，但RNA完整性较高^［20］。本研究同样发现，低RNA产量的食管组织样本反而具有更高的RNA完整性，提示在进行生物样本库质控时RNA产量不能单独作为RNA质量的判定标准。

不同器官来源的组织样本RNA质量可存在差异，肝脏样本的RNA质量高于乳腺、胰腺、胃、结肠、直肠和脑样本^［10-12］。本研究发现食管癌组与乳腺癌组样本RIN值呈现显著性差异，这一现象在食管癌正常组织与乳腺癌正常组织中尤为明显。富含结缔组织或脂肪组织的器官通常表现出较低的RNA完整性^［18］。因此，我们推测食管癌组与乳腺癌组间的RIN值差异可能与不同的组织构成有关。同种器官来源的组织样本中，肿瘤组织及其配对正常组织RNA质量研究结果也不尽相同。部分研究在乳腺癌、胃癌和肺癌中观察到肿瘤组织RIN值高于配对正常组织，而在结直肠癌和肝癌中则无差异^［16］。然而，也有研究发现结直肠癌和肝癌肿瘤组织RNA质量优于正常组织^［25-27］。本研究在食管癌组中观察到肿瘤组织及其配对正常组织RIN值的差异有显著统计学意义，但在乳腺癌组中未观察到统计学差异。本研究发现食管癌正常组织样本RNA质量优于肿瘤组织样本，这在文献中未见报道。Zhang等^［28］发现肝癌肿瘤细胞代谢异常，肿瘤细胞中一些代谢酶不仅参与代谢过程，还可作为RNA结合蛋白促进RNA的降解。食管癌肿瘤组织中可能也存在相关的RNA降解机制从而影响RNA质量，因此不同组织类型间RNA质量差异仍需进一步研究。

多项研究表明，组织离体时间是影响RNA完整性的关键变量。Spruessel等^［29］发现，结肠切除后5~8 min即可检测到基因和蛋白表达谱的早期改变。对需要采用高质量RNA样本的研究，离体时间应控制在15 min内^［27］，对于普通RNA的研究离体时间应控制在30 min内^［23］。然而，对包括乳腺癌和食管癌在内的多种肿瘤组织样本进行研究发现，离体1 h内处理的样本仍能保持RNA的完整性^{［12，16］}，离体时间超过2 h可能会增加细胞应激反应途径导致RNA降解^［30］。本研究发现离体时间<15 min或延长至15~30 min对乳腺癌和食管癌组织样本的RNA质量均无影响，这与一项针对乳腺癌组织RNA质量评估的研究结果相符^［31］。除了离体时间，样本冻存时间延长可能与RNA质量下降相关，也是生物样本库面临的主要问题。有研究发现，随着样本冻存时间的延长RNA质量逐年下降，相比其他器官组织样本，大脑、乳腺和胃组织样本的RNA表现出更快的降解速度^［10］。然而，也有研究发现中长期的冻存时间对RNA质量不会产生不利影响^{［18，20，32-34］}。导致研究结果差异的原因可能是不同器官组织样本RNA对冻存时间的耐受性不同。本研究评估了4个不同冻存时间的组织样本RNA质量，结果表明长达38~40个月的冻存时间对乳腺癌和食管癌组织样本均无影响。本研究存在一定局限性：（1）仅评价离体30 min内的乳腺癌和食管癌组织样本RNA质量，对于更多的肿瘤类型、更长的离体时间和冻存时间仍需进一步研究；（2）样本量较少，没有对RNA进行详细的分子分析，无法揭示表达谱的变化。未来可通过RT-PCR等多种方法学进一步验证样本中的RNA质量。

综上所述，本研究发现乳腺癌和食管癌组织样本RIN值存在显著性差异，食管癌标本中肿瘤组织及其配对正常组织之间呈极显著差异，提示不同器官来源和不同组织类型的冰冻组织样本RNA质量存在差异。有限的离体时间（≤30 min）和中长期冻存（38~40个月）对乳腺癌和食管癌组织样本RNA质量不会产生影响。研究结果可为生物样本库标准化流程和质量控制提供理论依据。

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