线粒体DNA突变和拷贝数变异与肿瘤诊治的研究进展

Research progress on mitochondrial DNA mutations and copy number variations in tumor diagnosis and treatment

摘要

线粒体是细胞代谢过程中最重要的细胞器之一，其基因组具有易突变、缺乏损伤修复机制等特点。在肿瘤发生发展的过程中，线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)的突变及拷贝数变异都起到了重要的作用。近年来的研究发现，多种肿瘤疾病中都存在mtDNA的突变及拷贝数变异，而针对肿瘤组织mtDNA，尤其是患者体液中游离mtDNA的检测也有可能成为提示肿瘤疾病的重要方法。本文旨在总结线粒体基因组突变及拷贝数变异与肿瘤疾病及其诊断的相关性，并对其作为肿瘤标志物的研究进展进行综述，从而为肿瘤疾病的临床诊断提供参考。

关键词

线粒体DNA(mtDNA) / 线粒体DNA突变 / 肿瘤诊断 / 拷贝数变异

Key words

mitochondria DNA （mtDNA） / mitochondrial DNA mutations / tumors diagnosis / copy number variation

近年来，肿瘤疾病的发病率与死亡率在逐年升高，肿瘤也早已成为威胁现代人生命安全的重要危险因素^［1］。20世纪20年代奥托·温伯格（Otto Warburg）教授提出“温伯格效应”以来，肿瘤的代谢组学一直是肿瘤疾病研究的热点^［2-3］。线粒体是细胞代谢最重要的细胞器，目前有许多研究都观察到线粒体基因组突变与拷贝数变异参与了肿瘤的发生、发展、转移等过程，但各研究结论之间也有较大差异，且鲜有文章对相关内容进行总结。本文旨在总结线粒体基因组突变及拷贝数变异与肿瘤疾病相关性的研究进展及其作为肿瘤标志物的意义，从而为肿瘤疾病的早期诊断提供参考。

线粒体DNA的特点

线粒体是一种存在于几乎所有真核细胞的细胞质中的双膜结合细胞器，在细胞的有氧代谢过程中起到了极为关键的作用。线粒体能通过氧化磷酸化（oxidative phosphorylation，OXPHOS），将糖类和脂肪酸转化为ATP，此外，线粒体还参与了胞浆钙调节、细胞凋亡、血红素和铁硫簇（iron-sulfur，Fe-S）的生物合成等过程。与其他细胞器不同的是，线粒体具有独立的DNA代谢性细胞器，其基因组包含有16 569个碱基对的双链闭合环状分子，被称为线粒体DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）。其能编码13种氧化磷酸化系统的基本蛋白及22种转运RNA（transfer RNA，tRNA）和2种核糖体RNA（ribosomal RNA，rRNA）^［4］，在每个细胞中有数个乃至上万个不等的线粒体DNA拷贝。与基因组DNA不同的是，mtDNA仅包含一个长度约1 122 bp的非编码调控区D环来控制mtDNA的复制与转录。相比基因组DNA，存在于线粒体基质中的mtDNA相对分子质量更小，又缺乏组蛋白的支持与DNA修复系统的保护，使其更容易受到氧化磷酸化过程中产生的活性氧等致癌因子的损伤；同时，在整个细胞周期中，mtDNA的复制都处于活跃状态，复制频率和次数都较基因组DNA更高，因此mtDNA具有更高的突变率^［5］。

mtDNA的突变具有异质性和阈值效应^［6］，即在mtDNA突变水平较低的情况下会发生线粒体的功能互补，使细胞保持氧化磷酸化的能力，同时细胞可通过激活线粒体的自噬功能避免突变的积累。只有当突变的mtDNA到达某个阈值时，细胞功能的缺陷才会表达出来。对于不同的突变类型与组织，其所能承受的突变阈值也不尽相同^［7］，如m.3243A>G和m.8344A>G等常见的mtDNA致病突变的突变负荷需达到80%~90%，才会导致氧化磷酸化的功能受损；而大规模的mtDNA缺失突变则通常需达到60%的突变阈值，才会引起氧化磷酸化功能的缺失^［8］。目前的研究认为mtDNA的复制独立于核DNA（nuclear DNA，nDNA）的复制及细胞周期发生。在细胞分裂之前，线粒体基因组就必须进行复制以确保有足够的拷贝传递给子代细胞。由于线粒体在有丝分裂时的分离是一个随机过程，如果亲本细胞内存在突变，则子代细胞有可能获得相比亲本细胞更多拷贝的突变。因此，线粒体在有丝分裂的分离过程中可能加速突变克隆的传递^［9］。

线粒体DNA突变和拷贝数变异与肿瘤的关系

20世纪20年代，温伯格教授提出了“即使在氧气充足的情况下，肿瘤细胞的代谢也会倾向于糖酵解作为主要的能量供应来源”的温伯格效应。虽然糖酵解过程产生腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）的效率远弱于氧化磷酸化，但却能提供更多的糖酵解中间产物参与磷酸戊糖途径、己糖胺合成途径等肿瘤细胞过表达的生物合成过程，从而促进肿瘤的发生与发展^［10］。例如，肿瘤细胞中常常过表达的转录因子myc能通过上调葡萄糖转运蛋白1、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、乳酸脱氢酶、磷酸果糖激酶等糖酵解关键酶，促进肿瘤的生长与增殖。而与温伯格教授的假设相反，有观点认为肿瘤代谢中观察到的有氧糖酵解现象是由线粒体的功能缺陷导致的，有研究^［11］发现在肿瘤组织中，同时存在着“温伯格效应”型细胞和“非温伯格效应”型的保留氧化磷酸化功能的细胞。

线粒体等细胞器在细胞内产生的重要副产物活性氧（reactive oxygen species，ROS）在肿瘤的发生发展中起着重要作用，ROS的积累会导致肿瘤疾病的发生，而肿瘤细胞区别于正常细胞的一个特征就是能够产生更多的活性氧，并增加其对抗氧化系统的依赖。ROS能通过转录因子NF-κB和STAT3、缺氧诱导因子-1α、激酶、生长因子、细胞因子和其他蛋白质以及酶等来调节各种细胞信号通路，这些途径与细胞转化、炎症、肿瘤生存、增殖、侵袭、血管生成和癌症转移有关^［12］。但另一方面，有研究^［13］表明基质分离引发的ROS过度产生会抑制肿瘤的远处转移，而过度的氧化应激还可以通过激活JNK和p38信号通路促进细胞的凋亡，为了迁移和存活，肿瘤细胞必须采用抗氧化机制来消除这种压力，保持ROS促肿瘤和抗肿瘤作用的平衡是肿瘤存活的关键，这也突显了线粒体在肿瘤发生过程中的核心作用。

近几十年的研究发现了mtDNA的突变与肿瘤的发生发展存在关联。在一项分析了TCGA数据库中38种不同癌种的2 658例肿瘤全基因组测序结果的研究中，发现了mtDNA的无义突变在肾癌、结直肠癌和甲状腺癌中显著增多，并发挥了激活下游信号通路导致肿瘤发生的作用^［14］。有研究^［15］通过mtDNA碱基编辑技术，在黑色素瘤小鼠模型中探讨了mtDNA的mt-ND5基因无义突变的作用，发现了mtDNA的突变对肿瘤代谢、肿瘤生物学以及免疫检查点阻断剂的作用效果都具有重要的影响。有一项对于45例嗜酸细胞瘤进行mtDNA分析的研究中更是发现了有26%的患者在MT-ND1、MT-ND2、MT-ND4、MT-ND4L、MTND5、MT-ND6、MT-CYB和MT-ATP6等mtDNA基因中具有高度异质性的突变；有1例同时携带了MT-ATP6和MT-ND5的突变^［16］。而在另一项针对54名原发性脑肿瘤患者的预后研究中，作者运用一代测序发现有29.6%的患者携带有mtDNA上15个位点的19个不同突变，而携带这些mtDNA有害突变的患者，其预后更差，生存期较不携带突变的患者更短^［17］。这些研究都证明了mtDNA突变在肿瘤的发生、发展以及患者的预后中都起到了重要的作用。

mtDNA拷贝数通常被认为是测量生物体线粒体功能最简单的指标，但不同肿瘤类型之间mtDNA拷贝数的变化有所不同。在一项通过二代测序（next generation sequence，NGS）技术对15种不同类型肿瘤mtDNA/nDNA读数的研究^［18］中发现，相较于癌旁的正常组织，膀胱癌、乳腺癌、食道癌、头颈部鳞状细胞癌、透明细胞癌和乳头状肾癌以及肝癌的mtDNA拷贝数降低，而肺腺癌的mtDNA拷贝数显著升高；相反的是，前列腺癌mtDNA的含量与线粒体基因的表达呈负相关；编码干扰素信号传导相关基因的拷贝数与膀胱癌、乳腺癌、食管头颈部鳞状细胞癌和肾透明细胞癌等肿瘤的mtDNA拷贝数呈负相关。在另一项针对肾细胞癌血浆外泌体及mtDNA的研究^［19］中，更是发现了血浆游离mtDNA的拷贝数变异与肾细胞癌侵袭性具有明显的相关性，且其具有作为肿瘤发展标志物的重要潜力。但也有观点认为mtDNA拷贝数的改变与肿瘤携带的突变类型及肿瘤本身的类型相关，在某些肿瘤中，mtDNA拷贝数的变化可能是继发于突变效应的适应性反应，从而使这一类型的肿瘤获得生长优势^［20］。

因此，mtDNA的突变及拷贝数变异可能是某些类型肿瘤生长的关键因素。mtDNA拷贝数也可能因携带的mtDNA突变不同而改变，它可以补偿由于mtDNA突变而导致的电子传递链功能的降低，或者可以调节mtDNA拷贝数以应对更多ROS的产生。因此mtDNA的突变及拷贝数变异可能可以作为肿瘤发生发展及治疗靶点的重要标志物。

线粒体DNA作为肿瘤相关标志物的意义

以往的研究已表明，mtDNA的拷贝数、突变都和肿瘤的发生发展有着密切的联系，这也提示了针对mtDNA的检测具有重要的临床意义。在现有的临床研究中，针对mtDNA突变的检测方法与常规检测DNA一级结构的方法相同，一般采用一代测序或荧光定量PCR的方法进行^［21］。在一项针对102例结直肠癌患者血浆游离mtDNA的研究^［22］中，作者通过实时荧光定量PCR（quantitive real time-polymerase chain reaction，qRT-PCR）得到了外周血游离线粒体DNA（cell-free mitochondrial DNA，cf-mtDNA）的含量可能可以作为结直肠癌筛查标志物的结论。在另一项针对肝细胞肝癌患者的研究^［23］中，作者通过基于长片段PCR扩增的多重引物捕获杂交，建立了针对mtDNA拷贝数、突变及片段组学的联合检测，结果显示肝细胞肝癌患者的外周血cf-mtDNA拷贝数显著低于组织中的拷贝数，且cf-mtDNA中存在大量肿瘤特异性mtDNA突变。与血浆cf-mtDNA相比，尿液cf-mtDNA拷贝数更多、片段大小分布更广，在一项针对肾细胞癌和结直肠癌患者及健康对照患者尿液和血浆cf-mtDNA的研究^［24］发现，肿瘤患者尿液cf-mtDNA碎片化更强，肿瘤患者尿液cf-mtDNA的异常碎片及突变特点具有一定诊断价值。除了结直肠癌、肝细胞肝癌及肾细胞癌，后续的许多研究也发现了cf-mtDNA在子宫内膜癌、乳腺癌、前列腺癌、尤文氏肉瘤等肿瘤疾病中的拷贝数升高^［25］，这些研究都提示cf-mtDNA的突变与拷贝数变异作为肿瘤诊断及预后标志物的潜力。

运用荧光定量PCR技术针对mtDNA突变和拷贝数变异的检测可能无法精准检测mtDNA的突变负荷。随着测序技术和检测技术的发展，微滴式数字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）和NGS技术在cf-mtDNA突变和拷贝数变异检测中的应用能更好地捕捉到少量的mtDNA并反映mtDNA突变的全貌。一项运用ddPCR技术对胶质母细胞瘤原位移植异种移植模型鼠的游离DNA进行检测的研究结果表明，血浆中肿瘤来源的cf-mtDNA可以替代肿瘤cf-nDNA作为胶质母细胞瘤更敏感的监测肿瘤负荷的方法^［26］。这一方法也能应用于尿液、脑脊液等其他体液样本。另一项研究应用NGS技术对20例肾癌患者尿液样本进行mtDNA检测，也认为mtDNA拷贝数及其第72位点的突变或可作为肾癌特异性肿瘤生物学指标^［27］。此外，有研究建立了运用ddPCR对不同细胞中mtDNA的拷贝数变异进行检测的方法，并运用这一方法揭示了在肿瘤、衰老等不同生理环境下单细胞mtDNA拷贝数的变化情况^［28］。这些研究都表明在ddPCR、NGS等新型检测技术的运用下，mtDNA尤其是cf-mtDNA在肿瘤疾病的早期诊断中的重要价值。

结语

线粒体是细胞代谢的重要细胞器，mtDNA的点突变及拷贝数变异在肿瘤的发生发展中都扮演了重要的角色。越来越多的研究表明，针对mtDNA的检测，尤其是针对cf-mtDNA的检测在肿瘤的早期诊断及预后中具有一定的潜力。但mtDNA片段较短、拷贝数较多的特点对检测方法的准确性和精密度也有较高的要求。相信随着NGS、ddPCR等技术在临床实践中的进一步应用，基于mtDNA的标志物在肿瘤中检测的技术也会不断完善。在未来的临床实践中，围绕mtDNA突变及拷贝数变异为核心的基因组学、蛋白组学及线粒体代谢产物的代谢组学等多组学的联合检测将在肿瘤疾病的诊断与预后中发挥更重要的作用。

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