3D打印丝素蛋白支架结构对支气管上皮细胞体外生长的影响

Influence of surface structure of 3D-printed silk fibroin-based scaffolds on bronchial epithelial cells growth in vitro

摘要

目的 探讨3D打印丝素蛋白（silk fibroin，SF）/羟丙基羧甲基纤维素（hydroxypropyl methylcellulose，HPMC）支架结构对体外气管上皮细胞生长的影响。 方法 应用3D生物打印机通过调节SF/HPMC溶液浓度和打印参数，并结合冷冻干燥法制备6种不同孔隙率、孔径大小和表面粗糙度的3D打印SF/HPMC支架。选用人支气管上皮细胞系BEAS-2B细胞，在支架上培养7天。通过CCK-8试剂盒检测细胞增殖，通过扫描电子显微镜观察细胞生长形态，通过活/死细胞染色观察细胞在支架上的活性。 结果 粗糙表面和光滑表面的20%（质量百分数）SF/HPMC支架的孔隙率分别为70.5%±2.0%和65.5%±6.1%，粗糙表面和光滑表面的30%（质量百分数）SF/HPMC支架的孔隙率分别为63.9%±2.1%和59.6%±2.1%。粗糙表面的20% SF/HPMC支架有两种孔径，分别为（443.9±104.1）μm和（681.1±115.1）μm。BEAS-2B细胞在粗糙表面支架上的延展更好，在高孔隙率和小孔径支架上的增殖更好。 结论 3D打印SF/HPMC支架适合支气管上皮细胞生长，粗糙表面、高孔隙率和小孔径的支架结构可能有利于细胞生长。

Abstract

Objective To investigate the effect of the structure of 3D-printed silk fibroin/hydroxypropyl methylcellulose （SF/HPMC） scaffolds on the growth of tracheal epithelial cells in vitro. Methods Six types of SF/HPMC scaffolds with different surface topography， pore size， and porosity were fabricated using a 3D printer by adjusting the concentration of SF/HPMC solutions and printing parameters， combined with freeze-drying. Normal human bronchial epithelial cell lines BEAS-2B were cultured on these scaffolds for 7 days. The cell proliferation was detected by CCK-8 assay and live/dead cell staining， and the cell morphology was observed by scanning electron microscopy （SEM）. Results The porosity of 20% （weight percentage） SF/HPMC scaffolds with rough surface and smooth surface were 70.5%±2.0% and 65.5%±6.1%， respectively， and the porosity of 30% （weight percentage） SF/HPMC scaffolds with rough surface and smooth surface were 63.9%±2.1% and 59.6%±2.1%， respectively. The two pore sizes of the rough-surfaced 20% SF/HPMC scaffolds were （443.9±104.1） μm and （681.1±115.1） μm. BEAS-2B cells spread better on the rough-surfaced scaffolds， and their proliferation was higher on scaffolds with higher porosity and smaller pore sizes compared to those with lower porosity and larger pore sizes. Conclusion The 3D-printed SF/HPMC scaffolds are suitable for bronchial epithelial cell growth. Scaffolds with rough surfaces， higher porosity， and appropriate pore sizes might facilitate BEAS-2B cell growth.

Graphical abstract

关键词

丝素蛋白（SF） / 3D打印 / 上皮细胞 / 支气管 / 表面形态 / 孔隙率

Key words

silk fibroin （SF） / 3D printing / epithelial cell / bronchus / surface morphology / porosity

临床上气管部分切除是治疗外伤、先天性气管狭窄和气管肿瘤等疾病的必要手段。当成人气管切除长度大于50%，或儿童气管切除长度大于30%，通常需要使用替代物进行气管重建^［1］。用于临床的气管替代物的自体组织来源有限，而异体移植存在免疫排斥等问题。组织工程化气管为解决这一问题提供了新方向^［2］，3D打印技术的出现进一步推动了该领域的发展。3D打印技术能够基于患者医学影像数据构建个性化结构，并精确调控支架的内部结构^［3］。采用3D打印聚己内酯^［4-5］和左旋聚乳酸^［6］等材料制作的气管支架在动物实验中展现出良好的机械性能，并观察到部分软骨化和上皮化现象。然而，理想的3D打印气管支架需满足更高的要求，包括较高的生物相容性、可控降解速率的生物可降解性、具有促进血管生长以及营养、氧气和废物输送的三维多孔结构^［7-8］、适合细胞黏附和增殖的表面以及良好的机械性能^［6-9］。

丝素蛋白（silk fibroin，SF）是一种天然的大分子蛋白聚合物，由于良好的生物相容性、机械性能和可控的降解速率，已被广泛应用于各种生物技术和生物医学中^［10］。与组织工程中广泛使用的天然聚合物（胶原蛋白、明胶、壳聚糖等）相比，SF具有更优异的机械性能，如拉伸强度和韧性^［11-13］。通过不同的处理方法，SF可以形成多样化的结构（如纤维、薄膜、水凝胶和三维多孔结构等），从而促进成纤维细胞、软骨、间充质干细胞、上皮细胞等的生长^［7，14］。

通过传统的冷冻干燥法^［15］制备的三维多孔SF支架用于气管缺损修复，可以促进气管上皮细胞的增殖^［16］。然而，这种方法难以精准控制支架结构和内部几何形状^［17］。3D打印技术可以精确打印细胞、生物材料和生物活性分子，创建具有复杂几何形状的三维组织构造，为生物医学应用提供更高的适用度^［18］。尽管低pH值、高温、酒精和剪切应力可以加速SF凝胶化过程，但调控困难。羟丙基羧甲基纤维素（hydroxypropyl methylcellulose，HPMC）作为一种纤维素醚衍生物，可以与SF形成牢固的连接。通过混合加热SF和HPMC，可以形成适用于3D打印的水凝胶^［19］。

体外实验显示，BEAS-2B细胞可以在3D打印的SF/HPMC支架上增殖^［20］。支架的结构参数会影响细胞的黏附、迁移和增殖^{［7，21-22］}。然而，不同结构参数的SF/HPMC支架对支气管上皮细胞生长行为（黏附、迁移和增殖）的具体影响尚不明确。本研究旨在利用SF和HPMC材料，通过3D生物打印技术制造结构精确的SF/HPMC支架，并观察3D打印SF/HPMC支架的结构参数（表面形貌、孔径和孔隙率）对支气管上皮细胞生长的影响，评估不同结构参数的3D打印SF/HPMC支架上细胞的黏附、增殖和活性情况，以期为人工气管支架的开发提供参考。

材 料 和 方 法

材料

聚乙二醇（上海麦克林生化科技有限公司），HPMC粉末（上海阿拉丁生化科技股份有限公司），DMEM培养基、10%胎牛血清、1%青霉素和链霉素（美国Hyclone公司），钙黄绿素AM（Calcein-AM）和碘化丙啶（PI）（美国Sigma公司），CCK-8试剂盒（中国迈基生物），BEAS-2B细胞（ATCC）。

SF和HPMC水溶液的制备

制备SF溶液^［15］：用0.5%（质量百分数）的Na₂CO₃水溶液煮沸45 min，去除蚕茧中的丝胶蛋白，蒸馏水洗涤后37 ℃干燥，干燥的SF在60 ℃下溶解于9.3 mol/L LiBr溶液中1 h，经过3天透析，聚乙二醇溶液透析SF溶液，获得30%~32%（质量百分数）的SF溶液，再分别稀释至20%和30%。用蒸馏水溶解HPMC粉末制备10%（质量百分数）的HPMC溶液。

支架制备

制备用于打印的SF/HPMC凝胶^［19］。为获得不同孔隙率的3D打印SF/HPMC支架，将10%的HPMC溶液加入20%和30%的SF溶液中。SF与HPMC的体积比为9∶1。将两种混合物（20% SF/HPMC和30% SF/HPMC）倒入3D打印机的料筒中，70 ℃加热1 h使其成为凝胶状态。将预先设计好的输出格式为STL的模型文件导入3D生物打印机（3D Bio- Architect^® Work Station，杭州捷诺飞生物科技股份有限公司），调整打印参数打印出圆形的3D SF/HPMC支架。为了获得表面粗糙的支架，使用喷水罐在打印过程后向支架喷水。所有支架在-20 ℃冷冻24 h，常温下用75%的乙醇浸泡1 h，进一步形成稳定的β-折叠结构。通过软件调整打印的间距，使用20% SF/HPMC混合物构建两种不同宏观孔径的SF/HPMC支架。共制备6种3D打印的SF/HPMC支架：光滑表面的20% SF/HPMC和粗糙表面的20% SF/HPMC，光滑表面的30% SF/HPMC和粗糙表面的30% SF/HPMC，小孔径粗糙表面的20% SF/HPMC和大孔径粗糙表面的20% SF/HPMC。

支架表征

形貌观察

使用扫描电子显微镜（型号：S-4800，日本日立，以下简称“电镜”）观察3D打印SF/HPMC支架的表面形貌和孔径（n=3）。使用Image J软件测量支架孔径的直径，计算平均值。

孔隙率测量

根据液体置换法，使用正己烷（不能溶胀或收缩SF基质）测量3D打印SF/HPMC支架的孔隙率（n=5）：孔隙率=［（V1-V3）/（V2-V3）］×100%（V1是正己烷的体积，V2是正己烷和支架的总体积，V3是去除SF/HPMC支架后正己烷的体积），计算平均值。

吸水性测量

计算3D打印SF/HPMC支架的吸水性和含水量（n=5）：吸水量=（W1-W2）/W2，含水量（%）=［（W1-W2）/W1］×100%（支架在蒸馏水中浸泡24 h，W1是支架的湿重量，W2是支架的干重量），计算平均值。

支架上细胞生长增殖评价

细胞增殖

使用CCK-8评估BEAS-2B细胞在6种3D打印SF/HPMC支架上的增殖情况。将5 mm×5 mm×2 mm的3D打印SF/HPMC支架放入48孔板，将20 μL含有4.5×10⁴个细胞的BEAS-2B细胞悬液接种在支架上，0.5 h后加入含有10%胎牛血清和1%青霉素和链霉素的DMEM培养基。培养1、3、5和7天后，将支架转移到新的48孔板中，加入200 μL培养基（含50 μL CCK-8试剂），在37 ℃、5%CO₂下孵育3 h。将100 μL混合溶液移入96孔板中，用酶标仪（美国安捷伦）测量吸光度（D₄₅₀值）。每组每个时间点设置6个复孔。

细胞形态

使用电镜观察6种类型的3D打印SF/HPMC支架上BEAS-2B细胞的形态。培养1、3和7天后，BEAS-2B细胞-支架复合物用PBS缓冲液洗涤，2.5%戊二醛和1%锇酸固定。梯度酒精脱水后，CO₂临界点干燥并镀金，以10 kV加速电压观察细胞-支架复合物。

细胞存活率

通过活/死细胞染色进一步观察6种类型的3D打印SF/HPMC支架上的BEAS-2B细胞的存活率。将相同大小的SF/HPMC支架放入48孔板中，将20 μL含有10×10⁴个BEAS-2B细胞的细胞悬液接种到支架上。细胞-支架复合物孵育0.5 h后加入200 μL培养基。培养1、3、7天后，加入20 μmol Calcein-AM（活细胞染色剂）和1 μg/mL丙啶碘（死细胞染色剂）溶液到支架上，37 ℃ 孵育30 min。使用激光共聚焦显微镜（型号：LSM710，德国卡尔蔡司）观察分析细胞-支架复合物。

统计学分析

使用SPSS 19.0软件进行数据统计分析。使用单因素方差分析统计4种3D打印SF/HPMC支架的孔隙率、含水率及对BEAS-2B细胞存活率的影响；使用非配对t检验分析2种不同孔径的3D打印SF/HPMC支架的孔隙率、含水率及对BEAS-2B细胞存活率的影响。所有数据用$\bar{x} \pm s$表示，P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

支架的结构特点

支架的形貌

喷水后20% SF/HPMC支架表面比喷水前更粗糙，支架表面出现广泛的裂纹（图1A、1E），而喷水前20% SF/HPMC支架仅在大孔周围出现裂纹（图1B、1F）。喷水后30% SF/HPMC支架表面形成了网格状（图1C、1G），喷水前30% SF/HPMC支架表面最光滑（图1D、1H）。4种支架在横截面上有微米级的孔隙（图1I~1L）。喷水后20% SF/HPMC支架在横截面上有分层孔，类似于喷水后30% SF/HPMC支架。喷水后20% SF/HPMC支架孔壁结构比喷水后30% SF/HPMC支架更薄（图1I、1K）。与喷水前30% SF/HPMC支架相比，喷水前20% SF/HPMC支架横截面孔径更大，孔壁更薄（图1J、1L）。为了研究孔径对细胞增殖的影响，用20% SF/HPMC结合喷水制作两种不同打印孔径的支架（图1M、1N），孔径（即单根打印丝线之间的距离）分别为（681.1±115.1）μm和（443.9±104.1）μm。

支架的孔隙率和含水率

喷水前后20% SF/HPMC支架的孔隙率分别为65.5%±6.1%和70.5%±2.0%，喷水前后30% SF/HPMC支架的孔隙率分别为59.6%±2.1%和63.9%±2.1%。20% SF/HPMC支架的孔隙率较30% SF/HPMC支架高，喷水后20% SF/HPMC支架的孔隙率与喷水前后30% SF/HPMC支架的差异均有统计学意义（P<0.05，P<0.001）。对于相同SF浓度的SF/HPMC支架，喷水后支架的孔隙率有所增加，但差异无统计学意义。

喷水前后20% SF/HPMC支架的含水率分别为79.9%±0.53%和80.5%±0.8%，喷水前后30% SF/HPMC支架的含水率分别为68.8%±2.3%和77.1%±0.7%。喷水前后20% SF/HPMC支架的含水率均高于30% SF/HPMC支架，4组之间差异均有统计学意义。在相同浓度组中，喷水后支架的含水率高于喷水前支架（图2A、2B），在30% SF/HPMC支架组差异有统计学意义（P<0.000 1）。对于20% SF/HPMC支架，大孔径支架的孔隙率高于小孔径支架，而含水率低于小孔径支架，但差异均无统计学意义（图2C、2D）。

体外支架上细胞生长增殖评价

细胞的增殖和活性

用CCK-8试剂检测不同结构的SF/HPMC支架上BEAS-2B细胞的增殖情况。培养1、3、5、7天，各组D₄₅₀值均随时间增加而增高，提示细胞在各组支架上不断增殖（图3A）。在20%和30% SF/HPMC支架上，表面粗糙的支架上细胞增殖更多。培养3、5、7天时，30% SF/HPMC支架组间差异有统计学意义（P<0.01、P<0.000 1和P<0.01），20% SF/HPMC支架组间差异无统计学意义。培养3、5、7天时，高孔隙率表面光滑的20% SF/HPMC支架上细胞增殖多于低孔隙率表面光滑的30% SF/HPMC支架，但差异无统计学意义。培养3、5、7天时，高孔隙率表面粗糙的20% SF/HPMC支架上细胞增殖少于低孔隙率表面粗糙的30% SF/HPMC支架，但差异无统计学意义。培养3、5、7天时，小孔径支架上细胞增殖多于大孔径架，差异有统计学意义（P<0.01、P<0.05和P<0.000 1，图3B）。

通过共聚焦显微镜观察BEAS-2B细胞在不同SF/HMPC支架上的活性（图3C）：细胞沿着支架增殖，随着培养时间延长，活细胞（绿色）不断增加。培养1、3和7天时，BEAS-2B细胞在6种SF/HPMC支架上均保持活性状态，在培养过程中未发现死细胞（红色）。

细胞黏附和形态

通过电镜观察不同支架上的细胞形态。培养1天，细胞黏附在6种SF/HPMC支架上；培养3、7天，细胞在粗糙表面支架上以单层片状生长，而在光滑表面支架上倾向于聚集成团生长。这种现象在表面光滑未喷水的30% SF/HPMC支架上表现最明显（图4A~4L）；培养7天，小孔径的支架上的细胞沿支架表面增殖（图4N、4P），而大孔径支架上的细胞倾向于聚集在大孔的侧壁上（图4M、4O），很难覆盖打印孔隙。

讨 论

三维多孔支架的参数，如表面形貌、孔径和孔隙率，对细胞的黏附和增殖有重要影响。在人工支架重建气管时，管腔内的上皮细胞需要尽快在支架上再生。研究表明，改变支架的表面形貌、孔径和孔隙率可以促进细胞黏附和细胞增殖^{［7，22-23］}。SF溶液的浓度影响着SF支架的微孔尺寸和孔隙率^{［15，24］}。随着3D打印技术的发展，可以制备出结构可控的三维多孔支架。我们利用3D打印技术结合传统的冻干方法，制备了具有多级孔道（宏观孔和微孔）的3D打印SF/HPMC支架。通过计算机设计改变打印丝线之间的距离，可控制宏观孔的直径；通过改变SF溶液的浓度并结合冻干方法，可改变SF/HPMC支架单根纤维中的微孔。微观形貌的微妙变化可能会影响细胞的黏附和增殖，不同类型的细胞对光滑或粗糙表面可能有不同偏好^［25-26］。3D打印SF/HPMC支架在冻干后表面变得光滑。由于SF和HPMC的混合物在70 ℃加热1 h后能够形成不溶于水的水凝胶，并形成小而均匀的β-折叠结构。在3D打印SF/HPMC水凝胶表面喷水，-20 ℃冷冻24 h，支架表面会形成冰晶，由光滑变粗糙。结果表明，喷水后3D打印SF/HPMC支架可以产生更粗糙的表面。喷水和冻干是一种简单的绿色环保的表面修饰方法，无需任何化学品，在冻结过程中形成的冰晶可通过升华去除。

支架的表面粗糙度对细胞生长和组织形成起着至关重要的作用，细胞增殖实验显示BEAS-2B细胞在粗糙表面的3D打印多孔支架上的增殖较好，提示粗糙表面可能为BEAS-2B细胞的黏附、增殖和迁移提供合适的环境。细胞的生长可能会受到从宏观到微观不同尺度形貌的影响^［27］。喷水后30% SF/HPMC支架表面具有微米级别的网格形态，这种结构可能有助于BEAS-2B细胞的黏附，这与Kaewkong等^［28］发现的支架微表面粗糙度促进人间充质干细胞附着的结果相似。研究显示，在骨组织工程中增加支架表面粗糙度可促进成骨分化，这可能是因为粗糙表面是更好的细胞附着基质^［29-30］。Girault等^［31］认为，细胞黏附首选限制细胞变形的表面，以便细胞以最小的变形能量固定，因此有限的粗糙度有助于细胞黏附。

支架的孔隙率和孔的连通性对于组织运送氧和营养物质是必需的^［32］。细胞在4种支架上的增殖显示，高孔隙率表面光滑的20% SF/HPMC支架上BEAS-2B细胞增殖多于低孔隙率表面光滑的30% SF/HPMC支架。在喷水后形成的粗糙表面支架上，低孔隙率30% SF/HPMC支架上BEAS-2B细胞增殖情况更好，这表明BEAS-2B细胞的增殖可能受到支架参数的综合影响。

通过调整打印过程中纤维之间的距离，使用20% SF/HPMC溶液制备了具有不同宏观孔径的支架。小孔径支架上的BEAS-2B细胞增殖多于大孔径支架，这一发现与之前的研究结果一致^［27］。一般来说，孔径太小可能限制营养物质的输送和细胞增殖，大于300 μm孔径可能有助于血管化组织的形成^［33］。然而，孔径太大，细胞黏附会受到影响，并且会对细胞的增殖和分化产生负面影响^［34］。因此，孔径应控制在适当范围内以平衡细胞增殖、营养物质运输、血管化和细胞附着的最佳需求，同时维持机械稳定性^［9］。

综上所述，我们通过3D打印制备了3D多孔SF/HPMC支架，并研究了不同支架结构参数（表面粗糙度、孔隙率和孔径）对气管上皮细胞生长的影响。3D打印结合真空冷冻干燥技术能够形成具有粗糙表面、可调孔径和适当孔隙率的多孔SF/HPMC支架结构，不仅有利于营养和代谢物质的交换，而且有利于BEAS-2B细胞的黏附和增殖。因此，3D打印SF/HPMC支架是一种有应用前景的、适合气管上皮再生的支架。

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