使用孟德尔随机化（Mendelian randomization，MR）的研究论文发表量近十年来呈指数增长。根据孟德尔分离定律，减数分裂过程中，来自父母双方的同源染色体会随机分配到配子中，遗传因素对暴露的影响被类似于随机对照试验（randomized controlled trial，RCT）中随机化分组影响暴露。虽然使用的仍是观察性研究数据，但正确设计的MR研究可能获得接近RCT的效能，因此其因果推断能力被放到了队列研究之上
［1］，“因果关联”一词也频繁地出现在相关论文标题中。随着近二十年来测序技术的飞速发展，遗传特征从单个位点检测发展到组学测序，成本也逐步降低；英国生物银行（UK Biobank）等平台开放使用，为MR研究提供了用之不竭的数据资源。一时间，似乎所有的生活方式、环境因素、生物标志物与疾病之间的流行病学研究都可以使用MR来开展探索。
从因果推断理论来说，成功的MR能满足工具变量（instrumental variable，IV）所要求的假设，避免传统观察性研究中难以避免的混杂，但在实际研究中还存在认识误区。本文通过有向无环图（directed cyclic graph，DAG）
［2］阐释混杂现象和工具变量的基本原理，解释RCT作为因果推断金标准的理论基础，并对比RCT和MR对工具变量核心假设的满足程度，以期提高研究者对MR原理的认识，促进其在流行病学研究中的合理应用。
以DAG展示混杂现象和工具变量原理
医学与公共卫生领域的观察性研究难以避免地存在未控制的混杂。如
图1所示，研究者关注X对Y的效应。以DAG的术语，从X到Y的箭头，表示变量X直接影响变量Y，同时表示时序上X先于Y，X是Y的上游变量、父变量，Y是X的下游子变量。在观察性研究中，相当多未收集或因不了解而无法收集的混杂因素表示为上游变量集合U，同时影响X和Y，使所计算获得的X-Y关联估计偏离X对Y的真实效应。从X到Y有两条路径：X到Y和从X到U到Y。前者是X→Y的开放路径；后者X←U→Y由一条指向X的箭头出发（又称为后门路径，back-door path），是X-Y之间的另一条开放路径。开放的原因是U的存在造成了X-Y之间额外的关联。可以看到U满足混杂因素的定义：U影响X和Y、且不是X→Y路径上的中间变量。X←U→Y这一开放路径引入了除X→Y直接关联外的额外关联，使观察到的X-Y关联成为两种关联的合并，使得对X影响Y效应的估计可能被低估（负混杂）、高估（正混杂）或碰巧被正确估计（U集合中的混杂效应互相抵消）。常用的控制混杂的多种手段都是在尽可能收集U信息的基础上进行的，无论是限制、分层还是多因素回归模型，都是在试图控制U，从而关闭X←U→Y路径，消除X←U→Y所产生的关联，让X→Y的关联单独清晰呈现。但是实践中对U集合的了解与信息收集总是有限的，对X←U→Y路径的关闭难以彻底，因此难以充分控制混杂。综上，
图1中由于混杂U的存在，直接观察到的X-Y关联不是X对Y效应的有效估计。
Z是我们想寻找的工具变量，即Z-Y之间的也有两条路径，即Z→X→Y的开放路径和Z→X←U→Y的闭合路径。后者闭合的原因是该路径中→X←的部分使X成为一个对撞点（collider），X截断并关闭了这条路径。对撞点X是上游Z和U共同的子变量。对于有对撞点的路径，不去控制对撞点，该路径就是闭合的，Z-U之间没有关联；但一旦控制了对撞点，反而会引入额外的上游父变量Z-U之间的关联。比如BMI是体重和身高共同的子变量，是体重→BMI←身高这一路径中的对撞点。这条路径原本是闭合的，体重和身高之间没有明确的关联，无法通过身高得到体重。然而，当控制BMI之后，例如，在BMI为20的人群中，提供身高，就能准确知道相应的体重。原本闭合路径的打开、原本不存在关联的出现，是由对对撞点的控制所引入的（这也是选择偏倚在DAG上的展示）。
图1中，Z-Y之间只有一条路径是开放的（Z→X→Y），观察到的Z-Y关联就代表了Z通过影响X而影响Y的效应。Z-Y关联没有受到U的影响，因为Z→X←U→Y是闭合的，不产生关联，由此，Z-Y关联是Z对Y效应的有效估计。易得Z-X关联也是Z对X效应的有效估计。
有效的工具变量Z能够利用上述两个有效估计Z-X关联和Z-Y关联，来估计X对Y的效应，即便原本X-Y之间的关联受到了U的混杂，不是有效估计。在DAG中，变量Z如果符合以下条件，则可以构成估计X对Y效应的无条件且有效的工具变量：Z影响X，即Z是X的上游变量——关联性假设；Z和Y没有共同的上游原因——独立性假设；Z只通过X间接影响Y，即从Z到Y的所有定向路径都通过X——排他性假设。
有效的工具变量可以用来检验“X对Y没有效应”这一无效假设：即如果Z对Y有效应，那么X一定对Y有效应。在额外的假设下，工具变量可以用于估计特定人群中X对Y效应的大小。只有在Z能影响X并且X能影响Y时，Z与Y是相关的，因为从Z到Y的唯一开放路径是Z→X→Y。换言之，只有当无效假设（X不影响Y）为假时，Z才能与Y相关。因此，如果拒绝Z-Y间相关性的无效假设，就必须拒绝“X不影响Y”这一无效假设。根据
图1，这个逻辑要求意味着，即使X-Y间存在混杂，对Z-Y间相关性的检验仍然是对X-Y间无效假设的有效检验
［2］。
工具变量方法起源自计量经济学，为解决内生性问题提供了有力的工具，推动了因果推断的发展
［3］；但其应用中最大的难点在于寻找到可以作为有效工具的那个变量。
RCT：经典的工具变量方法应用
RCT是在研究设计阶段控制混杂的有力手段，能使混杂因素在各处理组中均衡分布，从而保证两组可比。目前认为成功的RCT是验证因果关联的金标准，正因为其满足了工具变量所需的假设（
图1）；条件（1） Z影响X——随机化分组Z确定了暴露分组X；条件（2） Z和Y没有共同的上游原因——随机化分组作为独立过程，不受任何因素影响，因而和结局Y之间也不会有共同的上游原因，从而规避了混杂；条件（3） Z只通过X间接影响Y——随机化分组Z只通过暴露X间接影响结局Y，若非经过暴露X，随机化分组本身不会影响结局。
在RCT中，数据分析有其特殊的策略，背后是工具变量有效应用的支撑。数据分析的标准做法是基于分配的治疗而不是实际接受的治疗进行比较，被称为意向性分析（intent-to-treat analysis，ITT），估计的正是Z-Y关联。而基于实际接受的治疗进行比较则被称为符合方案分析（according-to-protocol analysis，ATP），估计的是X-Y关联。ITT保留了检验治疗效应无效假设的有效性。如前所述，成功的随机化分组不会受到影响结局的混杂因素的影响，并且仅通过实际接受的治疗对结局产生影响。尽管实际治疗与结局之间的关联可能会受到混杂，但分配的治疗（随机化分组）与结局之间的关联不受影响。这使得随机化分组成为检验治疗与结局之间关联的有效工具变量。
现实中并非所有的RCT都是成功的，RCT也可能因设计或执行不当而违背工具变量假设。例如“RCT能使混杂因素在各处理组中均衡分布”这句话，其完整的表述至少应该是：“在充分的样本量下，成功的随机化分组后，基线时混杂因素在各处理组中均衡分布”。多种因素都能破坏RCT有效结论所依赖的条件。例如很小的样本量很难保证所有的混杂因素分布都能均衡。如果随机化分组受到了人为的干扰，研究者有意让预后好的对象进试验组，引入了指征混杂，就会破坏RCT对工具变量条件（2）的满足。受试者不遵守分配的治疗方案，会导致实际接受的治疗与分配的治疗之间存在差异，削弱对工具变量条件（1）的满足。基线时均衡分布于组间的混杂因素，可能会在过程中影响治疗依从性，同时又影响结局（如社会经济水平），重新带来混杂。如果失访严重，不仅会影响研究效率，而且如果失访受到暴露（如不良反应严重）、结局（如病情重难以参加随访）和混杂因素（如社会经济水平）的影响，则会引入选择偏倚和混杂。如果盲法被打破，随机化分组方法被受试者知晓，积极或消极的心理因素会影响结局，为Z-Y引入新的关联路径，打破对工具变量条件（3）的满足，等等。
孟德尔随机化：工具变量的一种弱案例
同样考量MR需要满足的工具变量假设：条件（1） Z影响X（关联性假设）——遗传变异影响暴露；条件（2） Z和Y没有共同的上游原因（独立性假设）——个体层面遗传变异随机分配（MR的核心思想）；条件（3） Z只通过X间接影响Y （排他性假设）——遗传变异只通过研究暴露影响结局。
图2左授权自某位研究生报告，用以阐释MR需要满足的工具变量核心假设。在MR相关的论文中，不少作者也如该图一样，将独立性假设的箭头画反了——画作了G指向U，正确画法应从U指向G（
图2右）。
图2左的做法将排他性假设（即无多效性）又重复了一次：G→U→Y与G→Y一样，也是G→E→Y之外的影响结局的路径；同时遗漏了独立性假设，即G与Y不共有上游变量。
从MR进入研究者视野起，就不断有方法学论文指出该方法对工具变量假设差强人意并作出全面的总结和提醒
［4-7］。条件（1） Z影响X——期待工具变量必须与暴露有足够强的相关性，正如期待RCT中受试者有高依从性。遗憾的是，大多数情况下遗传变异是弱工具变量。这也是为何研究者从经典的致病通路为基础的研究出发，能获得相对较强的G-E关联，例如与酒精代谢直接相关的
ADH1B基因变异确实能看到按遗传分组后人群饮酒率、饮酒量的差异
［8］；但是大多数的遗传变异只能解释暴露变量（如胆固醇水平、BMI等）变异中的很小一部分。现有研究检验工具变量强度多依赖
F统计值
［9］，但
F统计量受样本量影响很大，现代大规模人群队列数据和合并研究保证了高
F统计量。建议如上述
ADH1B基因与酒精等优质MR研究一样，加入遗传特征与暴露的直接关联强度分析，来把握工具变量的实际强度。另一方面，RCT的暴露由研究者给予、确定剂量，并在一定程度上受依从性的影响；观察性研究中暴露信息的收集则复杂、模糊得多。类似饮酒的信息收集多来自研究对象自报，高估和低估都有可能，基于此获得的Z-X关联强度也受到信息偏倚的影响。条件（2） Z和Y没有共同的上游因素——个体层面遗传变异随机分配（这也是MR的核心思想），但在群体层面，随机性可能受到人口结构、选择压力等因素的干扰；尤其在多数据合并分析以扩大样本量的情况下，如果来自不同遗传背景，则会引入人群分层问题。条件（3） Z只通过X间接影响Y ——遗传变异只通过研究暴露影响结局；如果遗传变异通过其他路径影响了Y，称为水平多效性，就难以成为有效的工具变量。对此，大多数MR研究论文开展遗传变异的多效性检验（pleiotropy effect，PE）、开发无效工具变量的多效性偏倚矫正方法来试图解决这一问题
［10］。如条件（1）所述，选择强相关的遗传工具至关重要，常见的两种策略是基于生物学机制的选择和基于统计学显著性的选择。前者可以减少水平多效性偏倚，但难以提供足够的工具进行敏感性分析。后者常见做法是建立多基因风险评分（polygenic risk score，PRS），以一系列遗传位点组合取代单个位点，提高与暴露的关联强度。这在GWAS数据丰沛的当下更为常用。PRS作为风险分层和高危人群识别的工具非常成功，但在MR研究中使用会大幅提高对排他性假设考察的难度。目前对工具变量所需满足假设的检验依赖于统计学方法，用不同的统计模型适应MR中的各种假设。例如，逆方差加权（inverse-variance weighted，IVW）模型假设所有工具变量都满足工具变量假设，而基于中位数的模型可以容许多达50%的工具变量违反工具变量假设。仅基于统计显著性对工具变量所需假设进行检验只能进行形式化的解释，至多能够辅助形成研究假设而非实质意义上的“因果推断”。
图1是一张简单而又强大的DAG——Z和Y之间有且只有通过X的一条开放路径。需要特别注意的是，这个理论框架假设了那些不存在的箭头就真的不存在——没有画出来的箭头比画出来的更强大。RCT是最轻松满足该DAG的研究设计，它仿佛从一张白纸开始作画，如果研究者能遵从正确的研究方案严格实施开展RCT，保持研究对象的高治疗依从性和随访率，就能尽量避免其他箭头的旁逸斜出，基本满足工具变量的条件，从而获得有效的结论。MR则不然，其观察性研究的本质注定从真实世界的复杂疾病网络一张已然画满的图出发，需要仔细甄别所有变量的收集时序，并对3条假设逐一开展细致的审视。虽然流行病学研究大多在辛苦求证现实中可能存在着某个箭头并估计它的强度，但更困难的其实是确认某些箭头不存在，并且这一点在逻辑上也是不可能实现的。这进一步回答了上文为何MR在满足工具变量的条件（1）关联性假设和条件（3）排他性假设时好似形成了跷跷板：一旦关联性假设得到了更好的满足（如使用PRS获得更强的G-E关联），排他性假设就会受到进一步的削弱：想要证实单一遗传位点只经由影响暴露来影响结局已很困难，想要证实一系列遗传位点都没有通过暴露之外的因素影响结局则更难。在慢性疾病的病因图中，有着无数的上中下游变量：遗传与表观遗传、生活方式行为、社会心理因素、环境暴露、转录与转录调控、蛋白质表达与修饰、代谢物水平、微生物群落、细胞信号通路、免疫反应……它们之间复杂的交互作用可能牵一发而动全身，我们很难确定研究关注的某个暴露上游的遗传特征与结局之间只有我们想求证的箭头、是直截了当的关联，而没有其他路径的穿插。
MR研究帮助遗传-暴露-结局相关机制通路的发现
MR研究可助力药物开发。例如，研究者发现IL-6受体（
IL-
6R）基因变异与IL-6水平和C反应蛋白相关，且
IL-
6R rs7529229降低冠心病风险
［11］，后续临床试验证实抗炎药Canakinumab（靶向IL-1β，下游调控IL-6）可降低心血管事件风险
［12］。值得说明的是，MR方法本身不是为了发掘遗传特征与结局的关联而发展的，是为了探索所关注的暴露因素与结局之间的关联，苦于无法完全的混杂控制，借由上游遗传特征作为工具，间接估计暴露与结局关联发展而来的。传统的遗传易感性分析把研究结论下在遗传特征而非暴露上，不受MR难以满足工具变量假设的弱点影响
［4］。不少MR研究将遗传特征与暴露，或所在通路上分子标志物共同分析报告。暴露因素如果是病因链上的关键节点或易测标志物，即便不是“病因”，如果能有效干预，同样可以起到疾病防控的效果。有研究者在冠心病（coronary artery disease，CAD）相关研究中开展家族性高胆固醇血症（familial hypercholesterolemia，FH）相关
LDLR、
APOB和
PCSK9基因测序，评估这些基因的突变率及其对CAD风险的影响
［13］。该研究并未采取MR分析，结果显示在任何LDL水平下，FH突变携带者的CAD风险显著高于非携带者；FH突变携带者在多年随访中显示出更高的LDL胆固醇累积暴露。由此开发的
PCSK9抑制剂能降低血浆LDL和主要心血管结局
［14-15］。也有学者提出，由于MR的种种局限，必须像所有观察性流行病学研究一样谨慎对待，并建议在相关研究报告中避免使用“随机化”或“因果性”等术语，而准确地将其称为“遗传工具变量分析”
［16］。我们认为MR已被广泛接受且有万余篇论文发表，名称不一定拘泥，但审慎考察核心假设和谨慎结论非常必要。
MR不免除要求严格的研究设计和执行
理论上用于MR研究的遗传特征自然处于病因链的上游，从而有助于避免反向因果问题。但这不代表可以在此类研究设计和数据分析中对变量的时序性不作要求。暴露仍然应该发生在结局之前。基本的应用场景是在规范开展的队列研究中，探索基线暴露或结局发生前的某次随访时的暴露，注重观察研究暴露和其他因素在病因网络位置的上下游关系。然而在不少论文中，未见研究者对相关暴露信息和结局信息的测量时序加以确认和介绍，甚至出现了暴露与结局信息收集于同一时间的横断面研究。并不因为使用了为MR设计的数据分析过程，就免除了横断面研究暴露与结局时序难辨、暴露很可能已受疾病或疾病前期影响的缺点。尤其，如果该暴露不是相对稳定、能以近期暴露代表早期暴露，而是一些波动较高、随时可能被各类上游变量影响的暴露，如BMI、血脂等因素，数据本身难以满足因果推断所需的基本假设，而对结果的任何“因果”解释也将会是无本之末。对于这些情况，统计学软件和分析程序无法自动识别，把握混杂、暴露与结局的时序关系始终是研究者的责任。此外，当研究的暴露因素与遗传因素处于不同层次时，例如暴露因素的测量基于人群或宏观层面，MR设计也无法将研究效力从生态学研究设计升级至高于队列研究；如果再加上横断面或回顾性设计，则所得到的关联更加难以称为“因果”。
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