液相色谱-串联质谱检测血浆γ-氨基丁酸方法的建立和临床应用

Establishment of a LC-MS/MS method for detecting gamma-aminobutyric acid in plasma and its clinical application

摘要

目的 建立一种稳定的血浆γ-氨基丁酸（gamma-aminobutyric acid，GABA）的液相色谱-串联质谱（liquid chromotography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）检测方法，并评估基于该法的GABA检测结果用于辅助诊断睡眠障碍的价值。 方法 使用UPLC XevoTQs 液质联用仪检测GABA，并进行预验证和性能验证，建立健康人群的参考范围。比较表观健康人群和睡眠障碍患者血浆中GABA含量是否存在差异。 结果 以氘代化合物作为同位素内标，采用Amide色谱柱进行分离。流动相为0.050%甲酸水溶液和含0.175%甲酸和5 mmol/L乙酸铵的90%乙腈水溶液，梯度洗脱，柱温35 ℃。LC-MS/MS检测GABA的线性范围为0.05~10.00 μmol/L，定量下限为0.02 μmol/L，批内变异系数（coefficient of variation，CV）<3.00%，批间CV<4.00%，回收率为101.06%~109.02%。将300例健康人按年龄把GABA参考范围分为3组：18~34岁为0.08~0.15 μmol/L，35~49岁为0.10~0.20 μmol/L，≥50岁为0.12~0.23 μmol/L。以血浆GABA为标志物辅助诊断睡眠障碍，检测221例患者和300例健康人，结果显示18~34岁、35~49岁和≥50岁组的AUC分别为0.510（P=0.850）、0.686（P=0.002）和0.890（P<0.001），GABA的最佳截断值（cut-off）分别为0.09、0.10和0.11 μmol/L。 结论 所建立的LC-MS/MS方法检测GABA的结果可靠，能够灵敏、准确地检测血浆GABA水平，可用于辅助诊断睡眠障碍。

Abstract

Objective To establish a stable liquid chromatography-tandem mass spectrometry （LC-MS/MS） method for detecting gamma-aminobutyric acid （GABA） in plasma， and to evaluate the value of GABA detection in the diagnosis of sleep disorders. Methods GABA was detected using a UPLC Xevo TQs system. The method was pre-validated and its performance was verified to establish a reference range for healthy individuals. The difference in plasma GABA levels between apparently healthy individuals and patients with sleep disorders was compared. Results We employed deuterated compounds as isotopic internal standards and utilized an Amide chromatographic column for separation. The mobile phase was 0.050% formic acid in water and 90% acetonitrile in water containing 0.175% formic acid and 5 mmol/L ammonium acetate with gradient elution in the column temperature of 35 ℃. The linear range for the detection of GABA by LC-MS/MS was 0.05-10.00 μmol/L， with a lower limit of quantification of 0.02 μmol/L， the inter-day CV<3.00% and intra assay CV<4.00%， respectively， and the recovery rate was 101.06%-109.02%. The reference ranges for plasma GABA were established by analyzing 300 healthy controls stratified by age： 18-34 years （0.08-0.15 μmol/L）， 35-49 years （0.10-0.20 μmol/L）， and ≥50 years （0.12-0.23 μmol/L）. Then plasma GABA was used as a biomarker for auxiliary diagnosis of sleep disorders in analyzing 221 patients and 300 healthy controls， which revealed that AUC values were 0.510 （P=0.850）， 0.686 （P=0.002）， and 0.890 （P<0.001） in the groups of 18-34 years， 35-49 years， and ≥50 years， respectively， with optimal cut-off values of 0.09， 0.10 and 0.11 μmol/L. Conclusion A reliable LC-MS/MS method for detecting GABA has been established， which can detect plasma GABA levels sensitively and accurately and can be used in assisting the clinical diagnosis of sleep disorders.

Graphical abstract

关键词

γ-氨基丁酸（GABA） / 液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS） / 睡眠障碍 / 性能验证 / 参考范围

Key words

gamma-aminobutyric acid （GABA） / liquid chromotography-tandem mass spectrometry （LC-MS/MS） / sleep disorders / performance validation / reference range

γ-氨基丁酸（gamma-aminobutyric acid，GABA）是中枢神经系统重要的抑制性神经递质，具有促进脑内葡萄糖代谢、乙酰胆碱合成和生长激素分泌以及稳定情绪等多种生理功能^［1］。中枢神经系统中GABA水平低下或传递功能受损与包括亨廷顿病、癫痫、帕金森病、阿尔茨海默病、酗酒、睡眠障碍等^［1］在内的多种疾病相关。苯二氮卓类和巴比妥类药物通过增强GABA传递功能，可缓解焦虑、诱导睡眠、抑制癫痫发作等^［2］。此外，外周血中的GABA具有改善睡眠、降血压、保护肝肾、稳定血糖等功能^［3-4］。因此，亟需建立一种稳定、特异、灵敏的血浆GABA定量分析方法，以便临床上监测外周血GABA浓度，辅助判断病情和用药情况，进一步进行相关基础研究。

现有的GABA检测方法包括纸电泳法、纸层析法、比色法、高效液相色谱法和氨基酸分析仪测定法等，但在低浓度下灵敏度有限^［5］。且GABA存在同分异构体α-氨基丁酸（alpha-aminobutyric acid，AABA）和β-氨基丁酸（beta-aminobutyric acid，BABA），如图1所示^［6-9］。其中AABA在人体中含量远高于GABA，且与GABA的化学性质相似，难以分离，可能导致检测结果假性偏高。

液相色谱-串联质谱（liquid chromotography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）是一种结合高效液相色谱分离与串联质谱检测的分析技术，具有高特异性、高灵敏度和强抗干扰能力等特点，尤其适用于复杂基质中同分异构体的准确定量分析，是目前小分子生物标志物检测的重要方法。本研究旨在建立一种LC-MS/MS检测血浆中GABA浓度的快速可靠的方法，并用于分析表观健康人群与睡眠障碍患者外周血GABA浓度是否存在差异。

材 料 和 方 法

研究对象

收集300名2023年10—11月在复旦大学附属中山医院体检的表观健康人群血浆标本作为对照组，其中男性204名，女性96名，平均年龄为（48.2±14.12）岁。同期入组221名在复旦大学附属中山医院神经内科和心理医学科就诊的睡眠障碍患者血浆标本作为疾病组，其中男性130名，女性81名，平均年龄为（46.1±14.8）岁。本研究经过复旦大学附属中山医院伦理委员会批准（批准号：B2024-113）。疾病组纳入标准：临床诊断为睡眠障碍，且血清褪黑素浓度<8.61 nmol/L^［10］（参考范围为上午8.61~216.11 nmol/L），未服用治疗睡眠障碍的药物。对照组纳入标准：年龄≥18岁；18.0 kg/m²≤BMI≤35.0 kg/m²；血压无异常（<130/80 mmHg，1 mmHg= 0.133 kPa）；无高血压病史；不吸烟，不嗜酒；无严重器质性心脏病；无肝、肾功能不全；非妊娠、哺乳期。两组均未服用降压药和GABA相关保健品，且未经过激素治疗，空腹采血。

样本采集

使用乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）抗凝真空管采集患者静脉血。2 000×g离心10 min，分离血浆，吸取血浆分装到尖底离心管内，-20 ℃冻存。

仪器和试剂 质谱系统为 Xevo TQS MS ACQUITY UPLC System（美国Waters公司）。标准品为GABA纯品（美国Sigma公司），内标品为4-GABA-2，2，3，3，4，4-d6（美国Sigma公司），AABA纯品（美国Sigma公司），乙腈（德国Merck公司，色谱级），甲酸（美国Roe Scientific公司，色谱级），PBS缓冲液（上海元象医疗器械有限公司），乙酸铵（美国Fluka公司，色谱级）。

标准品溶液制备 GABA标准品和内标母液均用纯水配制，浓度为40 000.00 μmol/L，-80 ℃保存。使用1 mL容量瓶，准确移取25 μL的GABA标准品母液，加入纯水定容至1 mL刻度线，得到浓度为1 000.00 μmol/L的GABA储备液，于-80 ℃避光保存。标准曲线溶液配制：使用80%乙腈水溶液将储备液分别稀释为100.00、50.00、20.00、5.00、2.00、1.00、0.50 μmol/L的标准品，-20 ℃ 避光保存。质控品配制：使用75%PBS溶液将储备液分别稀释为7.50、3.00、0.15 μmol/L，-20 ℃ 避光保存。

将GABA内标母液用纯水稀释为100.00 μmol/L中间储备液，再取40 μL储备液加入到40 mL含1%甲酸的乙腈溶液中，得到浓度为0.10 μmol/L的内标工作液，于-20 ℃避光保存。

样本前处理

取出血浆、标准品和内标品，平衡至室温。取标准品5 μL和患者血浆50 μL，分别加入95 μL 75%PBS水溶液，再加入400 μL内标溶液，混匀，14 000×g离心5 min。取100 μL上清进LC-MS/MS检测。

色谱分析条件

色谱柱为ACQUITY UPLC BEH Amide Column（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）（美国Waters公司），柱温35 ℃。流动相A1为0.05%甲酸水溶液，流动相B1为含0.175%甲酸和5 mmol/L乙酸铵的90%乙腈水溶液。流速为0.3 mL/min，梯度洗脱。初始流动相为8%A1+92%B1，2 min后调整为20%A1+80%B1；0.2 min内使流动相调整为50%A1+50%B1，维持1.0 min；0.2 min内使流动相调整为8%A1+92%B1，维持1.4 min使色谱柱平衡至进样前状态。检测过程中流速为0.3 mL/min，每例样本平均检测时间为4.8 min，洗脱程序见表1。

质谱分析条件

样品上机检测，进样量为2 μL。质谱离子源参数设置：毛细管电压0.5 kV，脱溶剂气温度500 ℃，脱溶剂气流量1 000 L/h，源温度150 ℃。质谱仪使用多反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）分析，参数设置详见表2。

LC-MS/MS分离条件优化

选择美国Waters 公司的BEH C18色谱柱（2.1 mm×100.0 mm，1.7 μm）、BEH Amide色谱柱（2.1 mm×50.0 mm，1.7 μm）和HSS PFP色谱柱（2.1 mm×100.0 mm，1.8 μm），比较各色谱柱的出峰效果。

不同比例的乙腈、水、添加缓冲盐或酸配制不同浓度的流动相，检测含内标的GABA标准品，比较保留时间（retention time，RT）和色谱峰形，观察待测物和内标的响应。

方法学评价

参考《液相色谱-质谱临床应用建议》^［11］进行方法建立后的预验证和性能验证：预验证包含特异性和选择性、基质效应、重复性和携带污染；性能验证包含线性评估、定量下限、准确度、精密度、干扰试验、稀释可靠性和稳定性。

参考范围

根据CLSI C28-A3文件中的规定^［12］，至少需120例健康对照用于参考范围建立。

统计学分析

采用SPSS 17.0软件进行统计分析，计算均值（x）、标准差（s）、变异系数（coefficient of variation，CV）、偏移和回收率，对数据进行正态分析，计算参考范围，使用Mann-Whitney 检验组间差异，使用MedCalc软件进行ROC曲线分析。P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

LC-MS/MS分离条件优化

色谱柱选择

首先选用实验室最常用的BEH C18色谱柱进行尝试，参考Busardò等^［13］的方法，使用等度洗脱的方式分离待测物，用于质谱检测，若发现待测物与内标的保留时间都在1 min以内，即认为C18色谱柱对该物质的保留能力弱，不利于该物质的检测。绘制标准曲线后发现，虽然保留时间在1 min以内，但线性仍然良好。然而，人血浆标本检测结果的准确性不高，回收率仅为20%~50%，标本间定量离子对和定性离子对的离子峰度比差异很大。GABA存在同分异构体，且含量是GABA的数倍，干扰实验的离子峰度比和回收率都不可接受，认为该方法受到同分异构体的干扰。用梯度洗脱的方式进行优化，得到相似的结果，使用比普通C18柱性能更为优越的PFP色谱柱，其他条件不变，也不能将同分异构体成功分离。根据GABA的化学结构和性质使用BEH Amide色谱柱，可得到强响应纯品峰，进一步摸索流动相条件后可有效分离GABA及其同分异构体。

流动相选择

经过对色谱柱的筛选，最终采用正相色谱法进行分析。首先使用在正相色谱中常用的流动相配比：A为纯水，B为含5 mmol/L乙酸铵的90%乙腈水溶液。配合Amide色谱柱能够在梯度洗脱的模式下成功区分GABA同分异构体。为了确定临床样本的浓度范围，随机检测10个血浆样本的质谱信号都非常低，待测物不能达到基线分离。改变流动相的配比，由于质谱在正离子模式下检测，通过在流动相中添加甲酸提高响应。进样2.00 μmol/L标准品后，不同比例流动相下得到的GABA色谱图如图2所示。在流动相中不断调整甲酸的比例，得到信号最强的流动相配比：流动相A1为0.050%甲酸水溶液，流动相B1为含0.175%甲酸和5 mmol/L乙酸铵的90%乙腈水溶液。

GABA、AABA和内标GABA-d6的色谱图

GABA及其内标的保留时间均为1.38 min（图3）。临床样本的GABA浓度为0.10 μmol/L，保留时间为1.38 min（图4）。AABA标准品的保留时间为2.08 min（图5），同时可见在GABA和AABA通道中均无GABA峰。临床标本GABA和AABA色谱图中GABA和AABA通道中待测物保留时间处均无干扰峰（图6），证明AABA不会干扰GABA的检测结果。

方法学评价

特异性和选择性

背景峰面积/检测下限（lower limit of measuring interval，LLMI）峰面积均值为12.97，符合均值<20.00%的标准；内标峰面积/预期IS峰面积均值为0.15，符合均值<5.00%的标准。

基质效应

添加低浓度标准品的比值均值为0.66，CV值为3.46%；添加高浓度标准品的比值均值为0.19，CV值为11.66%，基质效应引起的CV值均<15.00%，比值均<1，在血浆中待测物响应较弱，基质效应表现为离子抑制。

重复性

连续检测20次，LLMI为0.02 μmol/L，检测上限（upper limit of measuring interval，ULMI）为10.00 μmol/L，50%（LLMI+ULMI）为5.01 μmol/L，低、中、高浓度样本的CV值分别为8.42%、1.74%和1.90%，CV均<15.00%，满足重复性要求。

携带污染

高值-低值转换样本均值和低值-低值转换样本均值的差为-0.24，较低值-低值样本的3SD 0.27；分析高浓度后立即进样5份空白样本，空白样本检测信号分别为0.00、185.15、197.03、180.20和70.32，LLMI检测信号为2 254.36，空白样本信号低于LLMI 10倍以上，满足验证要求。

线性评估

测定0.05、0.10、0.20、0.50、2.00、5.00和10.00 μmol/L标准品，回归方程是Y＝0.00273832X+0.000942903，r²=0.99。LC-MS/MS检测GABA的线性范围为0.05~10.00 μmol/L。7个浓度标准品的偏差<15%，CV<20%。

定量下限

检测一系列低浓度标准品，当浓度为0.02 μmol/L时，信噪比>20∶1，CV<20.00%且偏差<15.00%，能够满足应用要求，故质谱检测方法的定量下限为0.02 μmol/L。

准确度

采用回收率评估准确度。低、中、高浓度（0.15、3.00、7.50 μmol/L）质控品中分别添加1.00 μmol/L标准品，得到GABA回收率为101.06%~109.02%，偏差分别为3.83%、1.06%和9.02%，符合回收率80.00%~120.00%、偏差<15.00%的标准。

精密度

低、中、高浓度质控品的批内不精密度分别为1.97%、1.22%和2.65%，批间不精密度分别为2.28%、1.65%和3.97%，均<15.00%，满足临床检测要求。

干扰试验

黄疸、溶血、脂血标本加标后回收率分别为92.81%、94.7%、117.41%，回收率在80.00%~120.00%。偏差分别为-7.19%、-5.30%、14.88%，均<15.00%，满足临床检测要求。此外，根据《液相色谱-质谱临床应用建议》，干扰需要对色谱峰型、保留时间、定量定性离子峰度比率、分析物与内标一致性等进行观察，并建立患者样本离子峰度比变化可接受范围。在干扰条件下，色谱峰型、保留时间、离子峰度比率、分析物与内标一致性均未受影响，干扰样本离子比变化在可接受范围内，说明GABA的检测结果不受其同分异构体的干扰。

稀释可靠性

GABA纯品储备液稀释至100.00 μmol/L，再进一步稀释为1∶5、1∶10和1∶20时，回收率分别为102.04%、103.01%和103.14%，均在100%±15%范围内，CV分别为0.94%、0.60%和0.82%，CV均<5.00%，满足验证要求，故样本最高可进行1∶20稀释。稀释基质为超纯水。

稳定性

三等份的低、高浓度样本进行冻融稳定性实验（表3），评估4 ℃和室温下的短期稳定性、-20 ℃和-80 ℃的长期稳定性、储备液稳定性和制备后稳定性、质控品稳定性和内标稳定性，结果显示所有指标检测值均在标称值的15%以内，满足应用要求。

健康人参考范围建立

经Shapiro-Wilk检验证实数据呈非正态分布（P<0.05），故采用非参数统计方法进行分析，取第95百分位数确定参考值范围。按性别（男/女）和年龄（18~34岁、35~49岁、≥50岁）分层，分别采用Mann-Whitney U检验和Kruskal-Wallis H检验进行组间比较。结果显示，男性和女性GABA浓度差异无统计学意义（P=0.218），故参考范围无需按性别分层。不同年龄组间的GABA浓度差异有显著统计学意义（P=0.000）。18~34岁、35~49岁和≥50岁年龄组GABA浓度［M（P₂₅~P₇₅），每组n=100］分别为0.12（0.08~0.15）、0.13（0.10~0.20）和0.15（0.12~0.23）μmol/L。GABA水平随年龄增长呈渐进性升高趋势。

血浆GABA用于辅助诊断睡眠障碍中的临床价值

使用Mann-Whitney检验221名睡眠障碍患者血浆标本和300名健康对照血浆标本，结果显示18~34岁年龄组间无显著差异外，其余两个年龄组均存在显著差异。使用MedCalc软件对3个年龄分组进行ROC分析，以血浆GABA作为标记物用于辅助诊断睡眠障碍，计算得到18~34岁、35~49岁和≥50岁年龄组的AUC分别为0.510（P=0.850）、0.686（P=0.002）和0.890（P<0.001），此时GABA的最佳截断值（cut-off）为0.09、0.10和0.11 μmol/L （表4）。

讨 论

本研究建立了检测血浆GABA的LC-MS/MS方法并进行了方法学评价，在建立方法的过程中突破了多个技术难点。质谱通过物质的质荷比锁定待测物并进行定量检测，具有高特异性、高灵敏度、高准确性的特点，但由于GABA具有多种同分异构体，分子量相同对质谱检测是一大挑战，这时色谱条件的优化是GABA分离的关键。GABA含有胺和羧酸两个官能团，油水分配系数为-3.17，是一种极性很强的两性分子，最常用的反相色谱法并不适用于强极性分析物的分离检测，我们也发现在反相色谱柱上GABA难以保留。基于这个特点，我们考虑使用待测物选择性与反相色谱法完全相反的亲水作用色谱（hydrophilic interaction liquid chromatography，HILIC）。HILIC色谱柱通常用于氨基酸、蛋白质和多肽等亲水性化合物的定量分析，本研究选用ACQUITY UPLC BEH Amide Column（2.1 mm×50 mm，1.7 μm），根据GABA与其同分异构体的极性不同在Amide色谱柱上有不同的保留特性将其分离。在我们建立的色谱方法中，流动相中添加了乙酸铵，此类盐类缓冲液在固定相表面水层中比含有高比例有机相的流动相中具有更高的溶解度，于是富集在固定相表面的极性层中，随着盐浓度的升高，极性层的亲水作用越强，对溶质有更强的保留，从而有助于待测物的保留、与同分异构体之间的分离与峰的对称。在流动相中添加一定浓度的甲酸除了在色谱中有离子交换的作用以外，最重要的是提高了待测物在质谱正离子模式下的响应。前处理方法使用的是蛋白沉淀法，该方法快速简便，可完全满足临床检测需求。

国内外关于人体血浆中GABA浓度的研究较为有限，且部分文献中报道的研究方法和结果与本研究测定的GABA水平存在显著差异^［13-17］，这可能与GABA检测的技术难点有关。本研究收集了300例表观健康人群的样本，按年龄分为3组，测得的GABA参考范围：18~34岁组为0.08~0.15 μmol/L，35~49岁组为0.10~0.20 μmol/L，≥50岁组为0.12~0.23 μmol/L。结果显示，GABA浓度随着年龄增长呈现上升趋势，这一发现与Lyssikatos等^［18］的研究结果一致，该研究中血清GABA的平均浓度为（0.15±0.04）μmol/L，且GABA水平随年龄增长而增加，推测可能与肌肉功能的下降有关。由于本研究样本量较小且研究人群来源有限，未来可考虑收集大量中国人群样本，以更全面地研究国内GABA水平及其与年龄、身体表现的关系。

本研究初步探讨了外周血GABA浓度与睡眠障碍之间的关系。结果显示，除18~34岁年龄组外，其余两个年龄组（35~49岁和≥50岁）的GABA浓度均存在显著差异（Mann-Whitney检验，P<0.05）。为进一步评估血浆GABA作为睡眠障碍辅助诊断标志物的潜力，我们使用MedCalc软件对3个年龄组进行了ROC曲线分析。结果显示，18~34岁、35~49岁和≥50岁年龄组的AUC面积分别为0.510（P=0.850）、0.686（P=0.002）和0.890（P<0.001），对应的GABA最佳截断值（cut-off）分别为0.09、0.10和0.11 μmol/L。这些结果表明，在≥35岁的人群中GABA与其他标志物联合使用，可能具备辅助诊断睡眠相关疾病的潜力。

生物样品中检测的GABA浓度可能为体内γ-羟基丁酸的浓度提供辅助诊断信息^［13］。GABA除了作为一种抑制性神经递质在人体内起主要作用以外，还对包括胰腺、肌肉、脂肪和肝脏在内的器官细胞水平的代谢有显著影响^［19-22］。GABA通过细胞间作用（如自分泌和旁分泌功能）在周围器官中起作用，但调节血液及各个代谢器官中GABA水平对代谢紊乱的疗效尚未明确。在不同的器官和生理条件下细胞功能不同，因此有必要进一步研究GABA在体外和体内系统中的不同作用。

综上所述，本研究成功建立了一种高通量、高灵敏度的LC-MS/MS检测血浆GABA的方法，该方法具有操作简便、通量高、准确性强等显著优势，不仅适用于人体临床样本的检测，还为深入研究GABA的临床应用提供了有力工具。后续研究将聚焦于扩大样本量，深入探究中国人群中GABA与年龄增长之间的关系。

参考文献

[1] JEMBREK MJ， VLAINIC J.GABA receptors：pharmacological potential and pitfalls［J］.Curr Pharm Des，2015，21（34）： 4943-4959.

[2] NEMEROFF CB.The role of GABA in the pathophysiology and treatment of anxiety disorders［J］.Psychopharmacol Bull，2003，37（4）： 133-146.

[3] 刘鸷驹，张东星，晏仁义，等.γ-氨基丁酸的生物活性研究进展［J］.现代药物与临床，2022，37（9）：6.

[4] BOONSTRA E， DE KLEIJN R， COLZATO LS，et al.Neurotransmitters as food supplements：the effects of GABA on brain and behavior ［J］.Front Psychol，2015，6：1520.

[5] 徐慧慧，章益明，梁新珍.γ-氨基丁酸检测方法的比较［J］.发酵科技通讯，2014，43（3）：37-41.

[6] LEON I，PEN A， CABEZAS C，et al.The last link of the x-aminobutyric acid series：the five conformers of beta-aminobutyric acid［J］.Phys Chem Chem Phys，2018，20（22）：15574-15580.

[7] TAKAISHI M， KUDO F， EGUCHI T.A unique pathway for the 3-aminobutyrate starter unit from L-glutamate through β-glutamate during biosynthesis of the 24-membered macrolactam antibiotic，incednine［J］.Org Lett，2012，14（17）：4591-4593.

[8] MEDICI V， PEERSON JM， STABLER SP，et al.Impaired homocysteine transsulfuration is an indicator of alcoholic liver disease［J］.J Hepatol，2010，53（3）：551-557.

[9] YI R， ZHAO S， KONG N，et al.Quantitation of γ-aminobutyric acid in equine plasma by hydrophilic interaction liquid chromatography with tandem mass spectrometry［J］.J Sep Sci，2017，40（16）：3239-3247.

[10] XIE Z， CHEN F， LI WA，et al.A review of sleep disorders and melatonin［J］.Neurol Res，2017，39（6）：559-565.

[11] 中华医学会检验医学分会，卫生计生委临床检验中心.液相色谱-质谱临床应用建议［J］.中华检验医学杂志，2017，40（10）：770-779.

[12] BOYD JC.Defining，establishing，and verifying reference intervals in the clinical laboratory； approved guidelines，CLSI document C28-A3，Vol.28，No.3［R/OL］.（2010-10-01）［2024-07-26］.

[13] BUSARDÒ FP， KYRIAKOU C， MARCHEI E，et al.Ultra-high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry （UHPLC-MS/MS） for determination of GHB，precursors and metabolites in different specimens：application to clinical and forensic cases［J］.J Pharm Biomed Anal，2017，137：123-131.

[14] GONZÁLEZ RR， FERNÁNDEZ RF， VIDAL JL，et al.Development and validation of an ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass-spectrometry （UHPLC-MS/MS） method for the simultaneous determination of neurotransmitters in rat brain samples［J］. J Neurosci Methods，2011，198（2）：187-194.

[15] ARNING E， BOTTIGLIERI T.Quantification of γ-aminobutyric acid in cerebrospinal fluid using liquid chromatography-electrospray tandem mass spectrometry［J］.Methods Mol Biol，2016，1378：109-118.

[16] 白冰，柴剑波，王万宇，等.基于液相色谱-质谱联用技术探讨愈癫汤对精神分裂症大鼠神经递质含量的影响［J］.现代中西医结合杂志，2021，30（30）：3317-3321.

[17] BUCK K， VOEHRINGER P， FERGER B.Rapid analysis of GABA and glutamate in microdialysis samples using high performance liquid chromatography and tandem mass spectrometry［J］.J Neurosci Methods，2009，182（1）：78-84.

[18] LYSSIKATOS C， WANG Z， LIU Z，et al.γ-Aminobutyric acids （GABA） and serum GABA/AABA （G/A） ratio as potential biomarkers of physical performance and aging［J］.Sci Rep，2023，13（1）：17083.

[19] LI J， ZHANG Z， LIU X，et al.Study of GABA in healthy volunteers：pharmacokinetics and pharmacodynamics［J］.Front Pharmacol，2015，6：260.

[20] SHIMADA M， HASEGAWA T， NISHIMURA C，et al.Anti-hypertensive effect of gamma-aminobutyric acid （GABA）-rich Chlorella on high-normal blood pressure and borderline hypertension in placebo-controlled double blind study［J］.Clin Exp Hypertens，2009，31（4）：342-354.

[21] INOUE K， SHIRAI T， OCHIAI H，et al.Blood-pressure-lowering effect of a novel fermented milk containing gamma-aminobutyric acid （GABA） in mild hypertensives［J］.Eur J Clin Nutr，2003，57（3）：490-495.

[22] CAVAGNINI F， BENETTI G， INVITTI C，et al.Effect of gamma-aminobutyric acid on growth hormone and prolactin secretion in man：influence of pimozide and domperidone［J］.J Clin Endocrinol Metab，1980，51（4）：789-792.