单相抑郁谱系障碍患者外周血miRNA差异表达谱及其临床关联分析

Differential expression profiles and clinical correlations of peripheral blood miRNAs in patients with unipolar depressive spectrum disorders

摘要

目的 筛选单相抑郁谱系障碍患者外周血中差异表达的miRNA，并分析其与抑郁严重程度及应激事件的关联。 方法 纳入健康对照（n=16）、亚综合征抑郁（n=17）、轻性抑郁（n=20）及抑郁症（n=20）共73例受试者，采集外周血样本进行miRNA测序，筛选差异表达分子，并采用RT-qPCR验证。分析差异miRNA与汉密尔顿抑郁量表（Hamilton Depression Rating Scale-17 items，HAMD-17）、汉密尔顿焦虑量表（Hamilton Anxiety Rating Scale，HAMA）、生活事件量表（Life Events Scale，LES）及童年创伤问卷（Adverse Childhood Experiences International Questionnaire，ACE-IQ）等评分的相关性。 结果 测序鉴定出95个组间差异表达miRNA（P<0.05），其中16个经RT-qPCR验证。在调整年龄与性别因素后，13个miRNA仍具组间差异。let-7a-5p、let-7b-5p与HAMD-17和HAMA总分呈显著负相关（|r|>0.6，P<0.01）；miR-30a-5p与负性LES呈正相关（r_s=0.244，P<0.05）。ACE-IQ评分与let-7a-5p之间存在弱负相关（r=-0.264，P<0.05）。 结论 外周血中let-7家族及miR-30a-5p可能作为单相抑郁谱系障碍的潜在生物标志物，其表达变化可能与抑郁严重程度及应激暴露相关。

Abstract

Objective To identify differentially expressed miRNAs in the peripheral blood of individuals with unipolar depressive spectrum disorders， and examine the relationships between these miRNAs and the severity of depression and stress-related events. Methods A total of 73 participants were recruited， comprising 16 healthy controls， 17 individuals with subsyndromal depression， 20 individuals with mild depression， and 20 individuals with major depressive disorder. Samples of peripheral blood were obtained and miRNA sequencing was performed. RT-qPCR was used to select and validate differentially expressed miRNAs. The correlation between the miRNA expression and the results of Hamilton Depression Rating Scale-17 items （HAMD-17）， Hamilton Anxiety Scale （HAMA）， Life Events Scale （LES）， and Adverse Childhood Experiences International Questionnaire （ACE-IQ） were analyzed. Results Sixteen of the 95 miRNAs that were shown to be differentially expressed among groups （P<0.05） by sequencing were confirmed by RT-qPCR. Thirteen miRNAs remained significantly differentially expressed after controlling for age and gender. Let-7a-5p and let-7b-5p showed substantial negative associations （|r|>0.6， P<0.01） with HAMD-17 and HAMA total scores. Negative LES showed a positive correlation with miR-30a-5p （r_s=0.244， P<0.05）. Let-7a-5p expression and ACE-IQ scores showed a modest negative correlation （r=-0.264， P<0.05）. Conclusion miR-30a-5p and peripheral blood let-7 family members may be useful biomarkers for unipolar depressive spectrum disorders， with expression alterations being associated with stress exposure and the severity of depression.

关键词

单相抑郁谱系障碍 / miRNA / let-7a-5p / miR-30a-5p / 生物标志物

Key words

unipolar depressive spectrum disorders / miRNA / let-7a-5p / miR-30a-5p / biomarker

抑郁症（major depressive disorder，MDD）是全球公共卫生领域的重大挑战。流行病学显示，全球约3.4亿抑郁患者中每年因抑郁导致的自杀死亡约百万人^［1-2］。值得注意的是，阈下抑郁虽未达到《精神障碍诊断与统计手册》第5版（Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders，Fifth Edition，DSM-5）或《疾病和有关健康问题的国际统计分类》第10次修订版（International Statistical Classification of Diseases and Related Health Problems，Tenth Revision，ICD-10）诊断标准^［3］，但已造成职业功能损害与医疗资源消耗^［4］，因而被纳入“单相抑郁谱系障碍”概念范畴，该概念由Judd等^［5］提出，将传统抑郁症诊断范畴扩展至包括亚综合征抑郁（subsyndromal depression，SSD）、轻性抑郁（mild depression，MinD）等临床状态，凸显了阈下抑郁的临床重要性。单相抑郁谱系障碍患者个体差异显著、症状组合多样、病程迁延且复发率高，这些特征共同构成精准诊疗的核心障碍^［6］。现行抑郁症的诊断主要依赖DSM-5和ICD-10基于症状学的诊断体系，存在主观性强、评估工具易受认知与文化因素干扰等局限，这些挑战不仅存在于典型抑郁症诊断过程中，在更广泛的单相抑郁谱系障碍鉴别中尤为突出，迫切需要开发客观生物标志物以提升诊断准确性。

miRNA作为一类约22个核苷酸的非编码RNA，参与神经可塑性、突触传递、炎症反应及下丘脑-垂体-肾上腺轴调节等抑郁相关病理过程^［7-8］。临床研究已发现多种miRNA在抑郁症患者中表达异常，例如miR-132、miR-124表达上调可能通过脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）信号通路影响海马神经发生和突触可塑性^［9］，miR-134在慢性应激诱导的抑郁模型中下调，导致树突棘形态异常和突触功能受损^［10］。此外，血清miR-134和miR-16水平与患者的疾病恐惧程度显著相关，且独立于传统临床指标［如汉密尔顿抑郁量表（Hamilton Depression Rating Scale-17 items，HAMD-17）评分］^［11］，提示其作为生物标志物的潜力。在阈下抑郁人群中，研究发现miR-17-5p表达与患者健康问卷-9项（Patient Health Questionnaire-9，PHQ-9）评分呈正相关，表明miRNA在抑郁谱系早期识别中可能具有特异性作用^［12］。

本研究采用第二代测序技术系统分析健康对照（healthy control，HC）、SSD、MinD及MDD等4组人群的血浆miRNA表达谱，筛选差异表达miRNA，并通过RT-qPCR进行独立验证，旨在构建具有临床转化潜力的miRNA诊断模型，为单相抑郁谱系障碍的早期识别与客观诊断提供新依据。

资 料 和 方 法

研究方法

本研究为探索性研究，样本量基于前期预实验确定，未进行样本量估算。病例组来源于上海交通大学医学院附属精神卫生中心2021—2023年就诊的门诊患者，包括MDD、MinD和SSD；HC组通过社区招募。本研究经上海交通大学医学院附属精神卫生中心伦理委员会批准（批件号：2021-49），所有受试者均签署知情同意书。具备完全行为能力的受试者由本人签署；存在阅读困难者由研究人员逐条解释后签署；无法自主理解者由法定监护人代为签署。

研究对象

病例组纳入标准：汉族，18~64岁，无精神活性药物使用史，符合DSM-5诊断标准。MDD组为首次发作且HAMD-17≥17分；MinD组需具备至少1项核心抑郁症状且HAMD-17为8~16分；SSD组为无核心症状但存在≥2项相关症状且HAMD-17为8~16分。排除合并其他精神障碍、严重躯体疾病及妊娠者。HC组无精神疾病史及家族史，与病例组无血缘关系。

临床信息收集与评估

收集人口学及临床信息，病例组进一步使用HAMD-17、汉密尔顿焦虑量表（Hamilton Anxiety Rating Scale，HAMA）、五项简化版Parkinson疾病问卷”（Parkinson’s Disease Questionnaire-5，PDQ-5）评估抑郁及焦虑症状，使用生活事件量表（Life Events Scale，LES）及童年创伤问卷（Adverse Childhood Experiences International Questionnaire，ACE-IQ）分析生活事件与童年创伤。采用心境障碍问卷（Mood Disorder Questionnaire，MDQ）和简明精神病量表（Brief Psychiatric Rating Scale，BPRS）排除双相情感障碍及精神分裂症。

样本采集及RNA提取

采集所有受试者外周静脉血10 mL，使用EDTA抗凝管收集，4 ℃、1 509×g离心15 min分离血浆，-80 ℃ 保存。使用Qiagen血清/血浆miRNA提取试剂盒和TransZol Up Plus RNA试剂盒提取并纯化总RNA，经NanoDrop One检测浓度与纯度。

miRNA测序与差异表达分析

基于Illumina NovaSeq6000平台进行miRNA测序。建库流程包括接头连接、逆转录和PCR扩增，并使用Qubit^® 2.0荧光仪与Agilent 2100系统进行文库质检。原始测序数据经Fastx预处理，过滤低质量及短序列Reads，再通过Bowtie比对至GRCh38参考基因组，结合miRBase数据库完成miRNA注释。采用TMM法对Reads计数进行归一化，转换为TPM值以标准化表达量，进而筛选具有统计学意义的差异表达miRNA。

RT-qPCR验证及相关性分析

选取20个差异表达miRNA进行验证，以U6为内参。使用Mir-X试剂盒逆转录合成cDNA，采用TB Green预混试剂在QuantStudio 6 Flex系统上进行qPCR。反应体系含5 μL 2×Premix、0.2 μmol/L正反向引物及1 μL cDNA模板。扩增程序：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s、60 ℃ 34 s，40个循环。通过2^-ΔΔCt 法计算相对表达量，并将验证成功的差异表达miRNA与HAMD-17、HAMA、PDQ-5、LES及ACE-IQ量表评分进行相关性分析。

统计学分析

采用SPSS 26.0软件进行统计分析。计数资料以n（%）表示，组间比较采用χ²检验或 Fisher-Freeman-Halton检验。计量资料符合正态分布的以x±s表示，两组比较采用t检验，多组比较采用单因素方差分析（Oneway ANOVA）；非正态分布资料以M（P₂₅，P₇₅）表示，采用Mann-Whitney U检验。相关性分析根据数据分布类型选用Pearson或Spearman法。所有检验均为双侧，P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

人口学资料及临床特征分析

本研究共纳入78例受试者，经过实验质控程序，最终有73例受试者的数据进入统计分析，包括16例HC、17例SSD、20例MinD及20例MDD。

在人口学资料组间比较中（表1），4组间性别差异无统计学意义。经单因素方差分析检验，4组间年龄差异有统计学意义（P<0.05）。其次，在婚姻状况、吸烟情况和最高学历上，4组间差异无统计学意义。所有受试者均无精神活性物质使用史。

miRNA差异表达分析及验证

为明确单相抑郁谱系障碍各亚型与健康对照之间miRNA的表达差异，本研究采用Mann-Whitney U检验进行组间两两比较。结果显示，与健康对照组相比，MDD组、MinD组和SSD组分别鉴定出36、12和20个差异表达miRNA。其中，miR-30a-5p、miR-451a、miR-150-5p、miR-195-5p和miR-3615表达在3个患者组中均显著上调。

进一步采用单因素方差分析考察4组间miRNA的整体表达差异，共发现95个miRNA存在统计学差异（P<0.05）。选取其中差异最显著的20个miRNA进行RT-qPCR验证，采用2^-ΔΔCt法进行相对定量。Kruskal-Wallis检验结果显示（表2），16个关键miRNA在RT-qPCR数据中均保持显著的组间差异（P<0.05），验证了测序结果的可靠性。

为控制潜在混杂因素的影响，进一步进行协方差分析。在调整年龄和性别因素后，11个关键miRNA（包括miR-6721-5p、miR-660-5p和miR-30e-5p等）仍保持显著的统计学差异（表2）。miR-423-5p和miR-625-3p虽未达到显著性水平（P值接近0.05），考虑到其潜在生物学意义，仍纳入后续分析。

差异miRNA的表达量与临床量表评分的相关性分析

将RT-qPCR实验中组间差异有统计学意义的16个miRNA的表达量与HAMD-17、HAMA、PDQ-5及贝克自杀意念量表（Beck scale for suicidal ideation，BSSI）的评分进行相关性分析。结果显示（表3），除hsa-miR-22-3p外，其余15个miRNA与HAMD-17、HAMA评分显著相关。其中，let-7a-5p、let-7b-5p与HAMD-17总分和HAMA总分均呈强负相关（|r|>0.6，P<0.01），其余miRNA与上述两项量表评分相关，但相关性较弱（|r|<0.6，P<0.01）。此外，部分miRNA与PDQ-5、BSSI评分亦存在相关性，但所有相关系数（|r|/|rs|）均<0.6。

应激相关量表与差异miRNA的相关性分析

将RT-qPCR实验中组间差异有统计学意义的16个miRNA的表达量与应激相关量表评分进行相关性分析。结果显示（表4），let-7a-5p与ACE-IQ量表评分之间存在弱相关（r=-0.284，P<0.05），miR-30a-5p与负性事件刺激量评分之间存在弱相关（r_s=0.244，P<0.05），其余相关性分析均无统计学意义。

讨 论

本研究通过分析单相抑郁谱系障碍患者外周血miRNA表达谱，发现let-7家族成员（如let-7a-5p、let-7b-5p）和miR-30a-5p等分子在抑郁严重程度和应激暴露方面表现出显著相关性，提示其作为潜在生物标志物的可能性。

本研究首次从抑郁谱系整体视角系统比较了HC、SSD、MinD和MDD等4组人群的miRNA表达特征。结果显示，miR-30a-5p、miR-195-5p、miR-451a和miR-3615在3个病例组中均存在一致性表达差异，可能参与了抑郁谱系障碍的共同病理过程。通过RT-qPCR验证，我们成功确认了16个差异表达miRNA，这些miRNA的表达模式在不同抑郁亚组中呈现异质性，但未观察到4组间线性递增或递减的趋势，其中SSD组miRNA的表达水平最高，HC组次之。可能的原因包括：SSD患者处于疾病早期或前驱期，存在代偿性上调机制；不同抑郁亚型的病理机制可能存在差异等。调整年龄、性别混杂因素后，仍有13个miRNA在组间差异表达，其中多数在既往研究中亦有报道，如let-7a-5p、miR-19b-3p和miR-451a等在抑郁症患者外周血中表达异常^［13-16］，miR-625-3p则在抑郁症患者血清细胞外囊泡中存在显著下调^［17］，miR-30a-5p在卒中后抑郁患者中差异表达^［18］，miR-423-5p在抑郁症患者尸脑组织中显著高表达^［19］。本研究新发现的miR-6721-5p、miR-660-5p等分子在抑郁相关研究中尚未见报道，值得后续深入探索。

相关性分析表明，let-7a-5p和let-7b-5p与HAMD-17和HAMA评分均呈强负相关，提示其表达水平与抑郁和焦虑严重程度密切相关。这一发现与Roumans等^［16］在青少年抑郁队列中观察到的let-7b-5p低表达现象一致。已有研究从遗传调控、炎症机制和应激反应等角度揭示了let-7家族在抑郁发生中的作用。例如，let-7家族启动子区的遗传多态性与MDD风险相关^［20］；动物实验表明，前额叶皮层中IL-6水平升高可通过LIN28B介导的机制抑制let-7表达，进而参与神经炎症过程^［21-22］；此外，let-7家族成员在应激模型中表现出性别特异性表达变化，可能部分解释抑郁症发病的性别差异^［23］。这些机制共同提示，let-7家族可能在抑郁谱系障碍的病理生理过程中发挥调控作用。

尽管本研究中应激相关量表（如ACE-IQ、LES）与miRNA的整体相关性较弱，但仍发现let-7a-5p与童年创伤评分、miR-30a-5p与负性生活事件之间存在显著关联。这一结果与文献中关于miR-30a在早期应激调控中作用的报道相吻合，即miR-30a可通过表观遗传机制影响神经可塑性相关基因的表达，从而参与应激相关精神障碍的发病过程^［24］。应激因素在MDD乃至单相抑郁谱系障碍的发病机制中起着重要作用^［25］，需要在未来研究中进一步探讨和分析。

本研究有一定的局限性。首先，样本量相对有限，可能影响统计效力；其次，SSD与MinD组间年龄分布不均，可能对结果产生混杂影响；此外，部分新发现的miRNA（如miR-6721-5p、miR-660-5p）尚未在实验模型中进行功能验证。同时，外周血miRNA能否准确反映中枢神经系统的分子变化仍需进一步探讨。

本研究发现不同抑郁亚型之间存在明显的miRNA表达异质性，这种差异可能受到疾病严重程度、共病焦虑、年龄和性别等多重临床因素的共同影响。例如，let-7a-5p和let-7b-5p与HAMD-17评分呈强负相关，提示疾病严重程度是重要影响因素；而部分miRNA与HAMA评分的关联则暗示共病焦虑可能参与调控过程。未来研究应在扩大样本量的基础上，通过对不同亚型患者进行分层分析，系统考察上述临床因素对miRNA表达的独立与交互作用，并结合多组学数据与功能实验，深入解析差异表达miRNA的生物学机制及其在抑郁谱系障碍精准诊疗中的潜在价值。

综上所述，本研究提示外周血let-7家族成员及miR-30a-5p可能作为单相抑郁谱系障碍的潜在生物标志物，其表达变化与抑郁严重程度及应激暴露相关，为该疾病的分子分型与精准诊疗提供了新的线索。

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基金资助

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