感音神经性耳聋的潜在药物靶点：一项跨组织转录组关联研究

Potential drug targets for sensorineural hearing loss： a cross-tissue transcriptome-wide association study

摘要

目的 基于跨组织转录组关联研究（transcriptome-wide association study，TWAS）识别感音神经性耳聋（sensorineural hearing loss，SNHL）的易感基因及潜在药物靶点。 方法 采用跨组织TWAS鉴定SNHL的候选基因。其次，采用基于功能摘要的融合插补法（functional summary-based imputation，FUSION）来验证候选基因在单个组织中的结果，并基于基因组注释多标记分析法（multimarker analysis of genomic annotation，MAGMA）进一步筛选候选基因。采用基于汇总数据的孟德尔随机化（summary data-based Mendelian randomization，SMR）和共定位分析进一步推测候选基因与SNHL的因果关系。通过基因功能富集分析探索候选基因及其功能意义，并对已鉴定基因的成药性进行评估，以期发现潜在候选药物。 结果 通过跨组织TWAS共鉴定出22个候选基因。由FUSION和MAGMA证实，8个候选基因（SPTBN1、EML6、SLC16A8、ARHGAP28、ASCC2、C2orf73、MICALL1和GCAT）与SNHL具有显著相关性。SMR和共定位分析进一步验证了以上候选基因与SNHL具有因果关系。基于数据库挖掘和分子对接预测，提示磷酸吡哆醛为SNHL的潜在候选药物。 结论 共确定8个与SNHL风险相关的易感基因及潜在药物靶点，其中GCAT与已上市化合物磷酸吡哆醛关联，为SNHL的“老药新用”策略提供了遗传学依据。

Abstract

Objective We carried out a transcriptome-wide association study （TWAS） to identify susceptibility gene and potential drug targets for sensorineural hearing loss （SNHL）. Methods The TWAS was used to identify candidate genes for SNHL. The functional summary-based imputation （FUSION） was performed to validate the discoveries in single tissues. The multimarker analysis of genomic annotation （MAGMA） was used to screen the candidate genes. Additionally， summary data-based Mendelian randomization （SMR） as well as colocalization analyses were employed to further infer the causal associations. Gene enrichment analysis was conducted to provide further insight into the functional significance of these susceptibility genes. The druggability of these identified genes was assessed to find the candidate drugs. Results A total of 22 susceptibility genes were identified by cross-tissue TWAS analysis. There were 8 genes （SPTBN1， EML6， SLC16A8， ARHGAP28， ASCC2， C2orf73， MICALL1 and GCAT） confirmed to have a significant correlation with SNHL by FUSION and MAGMA analyses. SMR and colocalization analyses further validated these susceptibility genes. These candidate genes might be associated with SNHL by regulating multiple pathways. Pyridoxal phosphate might be a candidate drug for SNHL，based on database mining and molecular docking prediction. Conclusion A total of 8 susceptibility genes associated with SNHL risk and potential drug targets are identified， among which the association between GCAT and the marketed compound pyridoxal phosphate provides a genetic-based rationale for the drug-repurposing strategy in SNHL.

Graphical abstract

关键词

感音神经性耳聋（SNHL） / 易感基因 / 药物靶点 / 候选药物 / 转录组关联研究（TWAS）

Key words

sensorineural hearing loss （SNHL） / susceptibility gene / drug target / candidate drug / transcriptome-wide association study （TWAS）

耳聋是一个全球性的健康问题^［1］，全世界超过15亿人患有耳聋，其中4.3亿人为中度至重度耳聋^［2］。感音神经性耳聋（sensorineural hearing loss，SNHL）是一种最常见的耳聋类型，通常是由于耳蜗中的感觉毛细胞及其突触和/或螺旋神经节神经元发生退行性病变所引起。SNHL与遗传、衰老等因素密切相关^［3-5］。年龄是SNHL的主要风险因素之一，在65岁以上老年人中SNHL患病率显著增加。流行病学研究提示SNHL的患病风险存在性别差异，男性中发病率更高且发病年龄更早，这可能与职业噪声暴露、遗传易感性以及性激素保护效应等多种因素相关^［6］。目前治疗SNHL主要为基于糖皮质激素的综合疗法^［7］，但治疗效果不能满足临床需求。因此，迫切需要确定SNHL的潜在药物靶点以促进相关药物研发。

跨组织关联研究已被广泛用于确定复杂疾病的候选易感基因^［8］。本研究旨在利用SNHL的GWAS数据和GTEx_V8 eQTLs文件进行跨组织转录组关联研究（transcriptome-wide association study，TWAS），以筛选和验证SNHL的候选基因，通过生物信息学方法分析其生物学特性，并对其成药性进行评估，以期发现SNHL的候选药物。

资 料 和 方 法

研究设计

研究流程如图1所示。首先，基于分子特征统一检验（unified test for molecular signatures，UTMOST）进行跨组织TWAS分析，筛选与SNHL显著性相关的基因。其次，采用功能摘要的融合插补（functional summary-based imputation，FUSION）验证候选基因在单个组织中的结果，并基于基因组注释多标记分析法（multimarker analysis of genomic annotation，MAGMA）进一步筛选候选基因。此外，基于孟德尔随机化（summary data-based Mendelian randomization，SMR）和共定位分析进一步推测候选基因与SNHL的因果关系。通过基因功能富集分析探讨候选基因其功能，并对其成药性进行评估，以期发现SNHL的潜在候选药物。

数据来源

SNHL的GWAS数据来自FinnGen数据库（R11版数据集，https：//www.finngen.fi/en），该数据集包括39 620例SNHL病例和397 865例对照^［9］。本研究使用的GWAS汇总数据为混合性别的全样本分析结果，未对SNHL的遗传关联进行性别分层分析。表达数量性状基因座（expression quantitative trait loci，eQTL）数据来自GTEx数据库（V8版，https：//genome.gov/gtex）。

跨组织TWAS分析

通过UTMOST（https：//github.com/Joker-Jerome/UTMOST？tab=readme-ov-file）进行跨组织TWAS分析，以在个体水平上提供整体基因-性状相关性的量化^［10］。该方法可识别在组织内具有丰富性状遗传性的基因，并提高准确性。使用Benjamin-Hochberg方法对P值进行校正，以控制错误发现率（false discovery rate，FDR）（α=0.05）。P_FDR <0.05为差异有统计学意义。

单组织TWAS分析

利用SNHL的GWAS数据和49种不同组织的GTEx_V8 eQTL数据进行FUSION分析（http：//gusevlab.org/projects/fusion/），以评估基因与SNHL之间的关联^［11］。通过1000 Genomes（http：//fileserve.mrcieu.ac.uk/ld/1kg.v3.tgz）欧洲样本估计全基因组关联研究（genome-wide association study，GWAS）中每个位点的预测模型与单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）之间的连锁不平衡（linkage disequilibrium，LD）后，FUSION整合多个预测模型来评估SNP对基因表达权重的整体贡献。使用预测性能最高的模型来确定基因权重，将SNHL的遗传效应与基因权重整合，以执行SNHL的TWAS分析。经过FDR调整后，P_FDR <0.05为差异有统计学意义。

条件联合分析

考虑到标记之间的LD，条件联合（conditional and joint，COJO）分析能够更全面地洞察性状变异的遗传结构^［12］。由于FUSION分析中的单个位点可能识别出多个相关特征，因此通过COJO分析以确定独立的遗传信号。经过测试，代表独立关联的基因被标记为共同显著基因，而非显著性基因则被视为边缘显著基因。

MAGMA分析

通过MAGMA分析将SNP水平的关联统计归纳为基因得分，从而量化每个基因与表型的关联程度^［13］。经过FDR 调整后，P_FDR <0.05为差异有统计学意义。

SMR与共定位分析

通过SMR与共定位分析相结合，进一步分析已鉴定基因与SNHL的因果关系。通过设定以相应基因为中心的窗口（±1 000 kb）和5.0×10^-8的P值，筛选出相关性最高的顺式eQTL^［14］。通过Wald比值法评估基因与SNHL的因果关联，显著性水平设定为P<0.05。工具变量异质性检验（heterogeneity in the dependent instrument，HEIDI）用于评估多效性。共定位分析用于确定GWAS和eQTL信号在因果变异位点是否存在重叠。H4的后验概率（posterior probability for hypothesis 4，PP.H4）>0.70为具有共定位，即eQTL和GWAS之间存在共同的因果变异，PP.H4>0.90为具有高度共定位。

基因功能富集分析

通过STRING数据库（https：//cn.string-db.org/）预测与候选基因相互作用的前50个蛋白质。此外，使用g：Profiler（https：//biit.cs.ut.ee/gprofiler）进行基因本体（Gene Ontology，GO）、京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）、Reactome（REAC）和人类表型（human phenotype，HP）等功能富集分析。

潜在药物挖掘与分子对接预测

通过检索DrugBank（https：//go.drugbank.com/），Therapeutic Target Database （https：//db.idrblab.net/ttd/）和ChEMBL（https：//www.ebi.ac.uk/chembl/）等数据库查询确定候选药物。通过CB-DOCK2平台进行分子对接以评估候选药物与候选靶点的预测结合能力，并设置对照组，确保数据的可靠性和结果的可解释性。

统计学分析

在TWAS（包括UTMOST和FUSION）、MAGMA分析中，基因与SNHL的关联强度均通过检验统计量（如t、Z）进行评估。所有P值经FDR校正，以控制多重比较带来的假阳性，P_FDR <0.05为差异有统计学意义。在SMR分析中，使用Wald比值法计算基因表达对SNHL风险的因果效应值，报告其比值比（odds ratio，OR）及95%CI。P<0.05为差异有统计学意义。在共定位分析中，使用贝叶斯共定位方法计算后验概率，以评估GWAS与eQTL是否共享同一因果变异。PP.H4>0.70为存在共定位，PP.H4>0.90为存在强共定位。功能富集分析中，使用超几何检验评估候选基因相关蛋白在特定功能条目（GO、KEGG等）中的富集程度，并报告经过多重检验校正后的富集P值。分子对接中，结合自由能由CB-DOCK2平台内置的Vina评分函数计算得出（单位：kcal/mol）。

结 果

跨组织和单组织TWAS分析结果

在跨组织TWAS分析中，共识别出322个P<0.05的基因。经过FDR调整后，仍有22个显著基因。在单组织TWAS分析中，共识别出543个基因（P_FDR <0.05）。其中ARHGAP28、GCAT、MICALL1、SLC16A8、CBY1、ASCC2、SPTBN1、C2orf73、Lnc-MTIF2-1、ACTBP15和EML6等11个候选基因达到跨组织和单组织分析的严格阈值。

COJO分析结果

上述11个候选基因分别位于2号、18号和22号染色体上。为了消除因LD导致的假阳性结果，对这些基因在相关组织中进行COJO分析。结果显示均为共同显著基因。

MAGMA分析结果

在MAGMA分析中共发现369个候选基因与SNHL风险显著相关（P_FDR <0.05）。综合UTMOST跨组织、FUSION单组织和MAGMA基因分析的结果，最终共确定8个基因与SNHL风险显著相关，分别为SPTBN1、EML6、SLC16A8、ARHGAP28、ASCC2、C2orf73、MICALL1和GCAT。

SMR和共定位分析结果

如表1所示，SMR分析结果表明上述8个基因与SNHL之间具有因果关系（P<0.05），其中ARHGAP28、ASCC2、C2orf73和SPTBN1基因在多个组织中均与SNHL具有因果关系。共定位分析表明，ARHGAP28、ASCC2、EML6、GCAT、SPTBN1基因与SNHL存在共定位（PP.H4>0.70），其中ASCC2、EML6和SPTBN1基因在多个组织中与SNHL存在高度共定位（PP.H4>0.90，表2）。根据共定位结果，ASCC2、EML6和SPTBN1基因为SNHL的一级潜在靶点，ARHGAP28和GCAT基因为SNHL的二级潜在靶点，C2orf73、MICALL1和SLC16A8基因为SNHL 的三级潜在靶点。

基因功能富集分析结果

共鉴定出100个蛋白质与确定的8个候选基因具有相互作用。基因功能富集分析结果如表3所示，主要的分子功能包括肌动蛋白结合、细胞骨架蛋白结合、肌动蛋白丝结合、含蛋白复合物结合和细胞骨架结构成分；主要的生物过程包括肌动蛋白细胞骨架组装、基于肌动蛋白丝的生物学过程、肌动蛋白丝盖帽、负向调节肌动蛋白丝解聚和肌动蛋白丝组织；主要的细胞组分包括立体纤毛束、立体纤毛、基于肌动细胞的细胞突起簇、基于肌动细胞的细胞突起和肌动细胞骨架。KEGG分析表明，主要的信号通路包括非同源末端连接、马达蛋白、核苷酸切除修复、内吞作用和癌症中的蛋白聚糖。REAC分析表明，主要的信号通路包括声音的感觉处理（耳蜗内/外毛细胞）、感官知觉以及L1与锚蛋白之间的相互作用。HP分析显示，与候选靶点相互作用的蛋白质主要与听力障碍、感音神经性听力障碍、听力异常、脑干听觉反应缺失和红细胞渗透脆性增加相关。

潜在化合物挖掘与结合预测结果

以甘氨酸C-乙酰转移酶（glycine C acetyltransferase，GCAT）为靶点的药物有甘氨酸和磷酸吡哆醛。补充甘氨酸可能具有抗痉挛作用，磷酸吡哆醛主要用于营养补充、治疗恶性贫血和维生素B6缺乏症。丙酮酸（靶向SLC16A8）用于营养补充，钙（靶向SPTBN1）用于治疗钙缺乏症，ABT-413（靶向SPTBN1）用于治疗癌症，尚处于研究阶段。所检索的药物数据库中尚无关于ARHGAP28、ASCC2、C2orf73、EML6和MICALL1的药物信息。在已获批准的药物中，作为辅助因子的磷酸吡哆醛可能对SNHL具有治疗作用。分子对接显示（图2），磷酸吡哆醛与GCAT蛋白具有较好的结合亲和力（-7.0 kcal/mol），提示二者可能存在相互作用。以F9X为阳性对照，F9X与GCAT蛋白的结合能为-7.2 kcal/mol。以上仅为计算机模拟的初步证据，不能替代真实的生化实验和功能验证。

讨 论

本研究通过跨组织TWAS（UTMOST）、单组织TWAS（FUSION）和MAGMA系统评估了基因表达的遗传易感性与SNHL风险之间的关联，筛选出8个候选基因，并通过SMR和共定位分析验证了因果关系。结果表明，ASCC2、EML6和SPTBN1基因是SNHL的一级潜在靶点，ARHGAP28和GCAT基因是二级潜在靶点，C2orf73、MICALL1和SLC16A8基因是三级潜在靶点。一级潜在靶点为最关键的靶点，建议在后续研究中予以优先验证。根据基因预测，ARHGAP28、ASCC2和GCAT基因高表达与SNHL风险降低有关，而C2orf73、MICALL1、SLC16A8和SPTBN1基因高表达则与SNHL风险增加有关。

ASCC2位于细胞核中，可能具有泛素结合活性，参与停滞核糖体的重启、DNA触发的转录调控以及核糖体相关泛素依赖性蛋白降解过程。ASCC2涉及多种人类疾病，如癌症和类风湿性关节炎^［15-16］。尽管ASCC2在内耳中的功能未知，但其参与DNA损伤反应和转录调控，提示其可能在应对耳蜗内的氧化应激损伤中发挥作用。氧化应激引起的DNA损伤是年龄相关性听力损失的关键机制之一^［17］。本研究表明，较高水平的ASCC2与SNHL风险降低有关。因此，ASCC2可能通过增强耳蜗细胞的基因组稳定性或调节应激相关基因的表达来发挥保护作用。

EML6蛋白存在于细胞质和微管中，具有微管结合活性。EML家族蛋白参与调控微管动力学，而微管是细胞内运输和纤毛结构的关键组分^［18］。在内耳毛细胞中，微管网络对于囊泡运输（如神经递质释放）和纤毛束的极性维持具有重要作用。本研究中，EML6表达水平与SNHL之间的关系取决于组织类型。较高水平的EML6与未暴露于阳光的上腹部皮肤中SNHL风险的降低有关，而与全血中SNHL风险的增加有关。我们认为血液中的EML6与SNHL更为相关，EML6高表达可能是SNHL的风险因素之一。这提示全身性炎症或免疫状态（反映在血液中）可能通过影响EML6的表达或功能，间接干扰听觉系统的微管依赖性过程。

SPTBN1作为细胞骨架核心蛋白，经典功能在于维持细胞结构稳定性与信号传导。研究证明SPTBN1与听力损失之间存在明确的机制性关联，血影蛋白在纤毛束根部形成环状结构，这些环与小鼠的听觉能力密切相关，特异性敲除毛细胞中β2-血影蛋白的小鼠表现出严重耳聋^［19］。SPTBN1是Cx26膜定位的关键调控因子，其功能异常可能导致或加剧由GJB2基因突变引起的遗传性听力损失^［20］。本研究发现SPTBN1高表达可能增加SNHL风险，提示系统性或内耳局部的SPTBN1异常高表达可能导致毛细胞骨架过度刚性、突触信号传导紊乱或通过跨组织信号通路（如神经-内耳调控轴）干扰内耳离子平衡，最终诱发SNHL。

ARHGAP28蛋白具有GTP酶激活活性，并参与负向调节GTP结合活性^［21］。Rho GTP酶是肌动蛋白细胞骨架的关键调节因子，广泛参与细胞骨架动力学调控、发育、增殖、存活及再生等多种生理生化过程。在耳蜗毛细胞发育过程中，Rho GTP酶家族经典亚家族成员RhoA、Cdc42和Rac1通过诱导肌动蛋白单体聚合并稳定微丝结构，调控纤毛的发育与维持^［22］，调节听觉毛细胞纤毛束的正常形态，这是细胞极性调控的重要环节。同时，由RhoA、Cdc42和Rac1介导的肌动蛋白相关通路也参与外毛细胞的运动功能，表明Rho GTP酶在高度极化的听觉感觉系统中具有关键作用^［22］。本研究中，ARHGAP28高表达与SNHL的低风险相关。这表明ARHGAP28可能作为一个保护性因子，通过适时灭活RhoA等信号，防止过度的细胞骨架重构、细胞收缩或炎症反应，从而维持耳蜗结构的稳定。

GCAT是一种编码2-氨基-3-酮丁酸辅酶A连接酶的基因，该酶催化2-氨基-3-酮丁酸和辅酶A反应生成甘氨酸和乙酰-CoA^［23-24］。甘氨酸是中枢听觉通路中重要的抑制性神经递质，在耳蜗核和上橄榄复合体对声音信号的精确时相处理和频率分析中起关键作用^［25］。此外，GCAT反应产生的乙酰-CoA进入三羧酸循环，与细胞能量代谢密切相关。本研究表明，GCAT高表达可能对SNHL具有保护作用。其保护机制可能涉及两方面：一是通过维持甘氨酸能抑制性神经环路的平衡，防止兴奋性毒性；二是通过支持耳蜗细胞的能量代谢，增强其对抗应激的能力。

C2orf73、MICALL1和SLC16A8基因为SNHL的三级靶标。有关C2orf73的信息有限。MICAL家族蛋白是细胞骨架（特别是微丝）的调节因子，通过氧化还原酶活性影响肌动蛋白的组装^［26］。本研究发现，MICALL1高表达与SNHL风险增加有关，这可能意味着在某些病理条件下，MICALL1异常上调干扰了正常的细胞骨架动力学，导致毛细胞功能障碍或神经元信号传递异常。SLC16A8属于质子偶联单羧酸转运蛋白，负责促进乳酸的跨膜移动^［27］。乳酸水平与突发性耳聋的发病和预后有关^［28］。本研究发现，SLC16A8高表达与SNHL风险增加有关，这可能是在某些病理状态下，SLC16A8上调反映了乳酸异常增加或代偿不足以逆转损伤。

由于高水平的ARHGAP28、ASCC2和GCAT与SNHL风险降低有关，而C2orf73、EML6、MICALL1、SLC16A8和SPTBN1与SNHL风险增加有关。在已获批准的针对这些靶点的药物中，计算机模拟预测磷酸吡哆醛与关键候选基因GCAT具有强结合能力，然而其生物学功能和治疗潜力尚未得到证实。磷酸吡哆醛作为维生素B6的活性形式，是一种广泛用于营养补充和治疗某些代谢性疾病的化合物。已有临床研究在探索其复方制剂在改善脑血管相关症状（包括耳鸣）中的应用。本研究关于磷酸吡哆醛的发现，其意义不在于发现一种全新的药物分子，而在于为“老药新用”提供新的遗传学和生物信息学机制和优先靶点（GCAT基因）。磷酸吡哆醛对SNHL的治疗作用可能是通过调控GCAT介导的甘氨酸代谢或细胞能量通路来实现的。

基因功能富集分析结果进一步支持了上述候选基因与听力的关联。通路富集分析显示，与8个候选基因相互作用的蛋白主要参与非同源末端连接、马达蛋白和核苷酸切除修复等通路，提示候选基因可能通过DNA损伤修复及细胞骨架运输参与内耳功能维持。REAC分析则直接富集到声音的感觉处理、耳蜗内/外毛细胞的声音感觉处理通路，这与候选基因在内耳感觉细胞中的潜在功能高度一致。HP分析表明，上述相互作用蛋白主要与听力障碍、感音神经性听力异常和脑干听觉反应缺失相关。上述多维度富集分析结果共同为候选基因在SNHL发病中的作用提供了分子证据。

本研究的优势在于应用多种方法（跨组织TWAS、单组织TWAS、MAGMA、SMR和共定位分析）发现和验证了SNHL的易感基因，从而使研究结果更加可信和稳定，但也存在一些局限性。首先，本研究的主要遗传数据来源于欧洲人群（FinnGen R11数据集）。虽然样本量大、表型定义严格，但遗传结构和环境背景可能与其他人群（如东亚、非洲或拉丁裔人群）存在差异。因此，本研究所鉴定的8个候选基因与SNHL的关联，在其他人群中可能需要重新评估和验证。尽管使用了跨组织TWAS等方法试图捕捉更稳定的遗传调控信号，但仍需在独立的多人群队列中进行重复，以确认这些靶点的普适性。其次，尽管本研究采用多种统计方法以降低假阳性率，但由于缺乏独立的重复数据集，结果验证受到了限制。此外，本研究使用的GWAS汇总数据未区分性别。鉴于SNHL患病率存在性别差异，未来的研究有必要在经过性别分层的GWAS数据中进行TWAS分析，以探索候选基因的效应在不同性别中是否存在异质性，这有助于更精准地理解SNHL的遗传机制和开发个性化治疗策略。本研究基于公共数据库的生物信息学分析，所有鉴定的基因与药物靶点均未经过实验验证。为提升研究结论的可信度，我们计划后续收集临床样本（SNHL患者与匹配对照者的外周血或手术组织），利用qRT-PCR及蛋白质技术验证SPTBN1基因在mRNA及蛋白质水平的表达差异，并结合临床表型进行相关性分析，以增强计算机模拟结果的可靠性。虽然通过富集分析发现候选基因显著富集于“肌动蛋白细胞骨架组装”“声音的感觉处理”等与听觉功能高度相关的通路，但这仅提供了间接的关联性证据。因此，本研究所提出的基因-SNHL关联本质上是统计学和遗传学层面的预测，其具体的分子机制尚需实验证实。尽管通过SMR和共定位分析提供了因果关系的统计学支持，并通过分子对接预测了药物的结合潜力，但这些发现仍需在细胞模型、动物实验以及临床研究中得到功能确认。例如，后续研究可在耳蜗毛细胞或螺旋神经元细胞中敲低或过表达关键候选基因（如SPTBN1、GCAT等），观察其对细胞活力、纤毛结构或听觉相关信号通路的影响；或在小鼠SNHL模型中，评估磷酸吡哆醛等药物的实际干预效果。本研究对磷酸吡哆醛的发现仅限于生物信息学层面的靶点关联预测和初步的计算机模拟结合证据，而非成药性评价，未来可进一步开展医学实验研究。

综上所述，本研究发现8个与SNHL风险相关的候选基因，其中SPTBN1基因有望在临床样本中进行初步表达验证。基于数据库挖掘和分子对接，提示磷酸吡哆醛可能通过作用于GCAT基因发挥效应，这为探索已上市化合物的“老药新用”提供了新的线索，潜在的药物作用有待功能实验和药效学评估来证实。

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