膜性肾病组织中不同抗原标志物表达及其临床特点相关性分析

Expressions of different antigenic biomarkers in renal tissue of membranous nephropathy and their correlation with clinical characteristics

摘要

目的 研究上海地区单一肾病中心原发性膜性肾病（primary membranous nephropathy，PMN）患者肾组织中不同相关致病抗原的分布特征及其与IgG亚型的相关性，探讨不同抗原分布特点及其临床意义。 方法 应用免疫荧光、免疫组织化学等检测复旦大学基础医学院病理学系肾病室220例PMN病例的石蜡组织中磷脂酶A2受体（phospholipase A2 receptor，PLA2R）、Ⅰ型血小板反应蛋白7A域（thrombospondin type-1 domain-containing 7A，THSD7A）、神经源性表皮生长因子样分子-1（neural epidermal growth factor-like 1，NELL-1）、前蛋白转化酶枯草杆菌素/Kexin6型（proprotein convertase subtilisin/kexin type 6，PCSK6）4种抗原的表达情况及其与IgG亚型的相关性，结合临床和病历资料进行回顾性临床病理分析。 结果 PLA2R阳性率最高（83.2%，183/220）；其次为THSD7A（7.3%，16/220），两者IgG亚型都以IgG4为主；NELL-1和PCSK6阳性率分别为1.4%（3/220）、0.45%（1/220），IgG亚型都以IgG1为主；PLA2R阳性病例临床资料除PMN外未见伴有其他疾病病史；THSD7A阳性病例中3例随访期间先后出现恶性肿瘤；NELL-1阳性患者除MN外未见其他的疾病出现；1例PCSK6阳性患者有短期较大量非甾体抗炎药服药史；PLA2R阳性与THSD7A阳性患者的病理分期差异性改变有统计学意义（P<0.05）。 结论 PLA2R是PMN的主要致病靶抗原，IgG4为其主要自身抗体；THSD7A阳性可能与患者伴有恶性肿瘤、感染等疾病病史相关；NELL-1和PCSK6阳性较为少见。

Abstract

Objective To investigate the distribution characteristics of pathogenic antigens and their correlations with IgG subtypes in patients with primary membranous nephropathy（PMN）in a single center for kidney disease research of Shanghai， and to explore the clinical significance of antigen-specific distribution patterns. Methods Paraffin-embedded renal tissues from 220 PMN cases archived at the Department of Pathology， School of Basic Medical Sciences， Fudan University were retrospectively analyzed. Immunofluorescence and immunohistochemistry were performed to detect the expression of phospholipase A2 receptor （PLA2R）， thrombospondin type-1 domain-containing 7A （THSD7A）， neural epidermal growth factor-like 1 （NELL-1）， and proprotein convertase subtilisin/kexin type 6 （PCSK6）， along with IgG subtype analysis. Clinical and pathological data were integrated for clinicopathological evaluation. Results PLA2R positivity was the highest（83.2%， 183/220）， with IgG4 as the predominant subtype；THSD7A ranked second in positivity（7.3%， 16/220）， also predominantly associated with IgG4；NELL-1 and PCSK6 exhibited low positivity rates of 1.4%（3/220）and 0.45%（1/220）， respectively， both linked to IgG1；PLA2R-positive cases showed no comorbidities other than PMN；three THSD7A-positive patients developed malignancies during follow-up；one PCSK6-positive patient had a history of short-term high-dose of nonsteroidal anti-inflammatory drug use；no extrarenal diseases were observed in NELL-1-positive cases；statistically significant differences in pathological staging were observed between PLA2R- and THSD7A-positive groups （P<0.05）. Conclusion PLA2R is the predominant pathogenic target antigen in PMN， with IgG4 as its primary autoantibody. THSD7A may be associated with malignancies or infections. Positive cases for NELL-1 and PCSK6 were rarely detected.

Graphical abstract

关键词

原发性膜性肾病（PMN） / 靶抗原 / 磷脂酶A2受体（PLA2R） / Ⅰ型血小板反应蛋白7A域（THSD7A） / 神经源性表皮生长因子样分子-1（NELL-1） / 前蛋白转化酶枯草杆菌素/Kexin6型（PCSK6）

Key words

primary membranous nephropathy （PMN） / target antigens / phospholipase A2 receptor（PLA2R） / thrombospondin type-1 domain-containing 7A （THSD7A） / neural epidermal growth factor-like 1 （NELL-1） / proprotein convertase subtilisin/kexin type 6 （PCSK6）

膜性肾病是引起成人肾病综合征最为常见的肾病病理类型，多发于中老年人，男女比例约为2∶1^［1-2］，亚洲地区高发。随着我国人口老龄化及环境等复杂因素的影响，膜性肾病患病率逐年上升，造成沉重的医疗负担，因此提高该病的早期诊断以及进行特异性治疗至关重要。

膜性肾病按致病原因分为原发性膜性肾病（primary membranous nephropathy，PMN）和继发性膜性肾病（second membranous nephropathy，SMN），其中PMN占比高达85%。长期以来，PMN病因不明，探索致病原因成为研究热点。2009年，Beck等^［3］首次揭示M型磷脂酶A2受体（phospholipase A2 receptor，PLA2R）是PMN的致病靶抗原。此后，随着激光微切割联合蛋白质谱新技术的发展，十余种MN相关靶抗原相继被发现和鉴定。其中PLA2R、Ⅰ型血小板反应蛋白7A域（thrombospondin type-1 domain-containing 7A，THSD7A）、神经源性表皮生长因子样分子-1（neural epidermal growth factor-like 1，NELL-1）等是目前研究较多的抗原^［4-5］。研究显示，这些不同致病抗原在不同国家和地区PMN中的表达分布也不同，这可能与PMN发病率的差异、各地文化背景、生活环境不同等因素有关。此外，研究发现有些抗原（如THSD7A、NELL-1等）表达可能与患者体内潜在的疾病因素（如恶性肿瘤、感染等）有关^［5-7］，前蛋白转化酶枯草杆菌素/Kexin6 型（proprotein convertase subtilisin/kexin type 6，PCSK6）表达可能与使用非甾体抗炎药有关^［8］。因此研究不同地区PMN的不同相关抗原表达特点和分布情况对PMN分子发病机制、病因诊断以及临床针对性治疗有重要的辅助作用。

本研究针对复旦大学基础医学院病理学系肾病室近5年220例PMN进行了回顾性研究，通过检测肾组织中PLA2R、THSD7A、NELL-1及PCSK6抗原表达以及IgG亚型的分布特征，结合临床和病历资料进行临床病理分析，探讨上海地区单一肾病中心肾活检病例中PMN的抗原分布特点及其临床意义。

材 料 和 方 法

临床样本 收集复旦大学基础医学院病理系肾病室（来源于多家上海及周边城市医院的病例）2018—2022年1 350例肾活检病例中诊断为PMN的220例病例的肾穿刺组织的石蜡标本。因回顾性研究所限，无法获得研究对象的血清样本，因此本研究仅在原活检肾小球组织上进行了抗原标记研究。所有样本获取及使用均通过复旦大学基础医学院伦理委员会批准（批准号：［2024］伦研第（008）号）。

病理学检查 所有标本均行常规光镜观察（包括HE染色、PAS染色、PASM染色以及Masson染色），免疫荧光染色（包括免疫球蛋白IgG、IgA、IgM和补体C1q、C3、C4）以及透射电镜检查。排除了非膜性肾病以及SMN病例后，将诊断为PMN病例收集备用。

免疫染色 对冰冻组织切片进行多克隆抗体PLA2R（1∶60，美国Sigma公司，HPA012657）、PCSK6（1∶100，英国Abcam公司，ab140934）免疫荧光染色；对石蜡切片进行多克隆抗体THSD7A（1∶500，美国Sigma公司，HPA000923）、NELL-1（1∶100，美国Sigma公司，HPA051535）酶解免疫组化染色；对所有病例进行石蜡切片IgG亚型（1∶30，基因科技上海股份有限公司）免疫荧光染色。免疫荧光、免疫组化阳性程度做半定量分析：弱阳性（1+）；阳性（2+）；强阳性（3+）。

临床病理资料分析 收集患者于肾活检时的临床病理资料（包括年龄、性别、24小时蛋白尿、血清肌酐浓度等）和临床门诊随访病史等进行回顾性分析。

统计学方法 运用SPSS 25.0统计软件进行分析。计数资料以n（%）描述，组间比较采用χ² 检验；正态分布的计量资料以x±s表示，非正态的计量资料以M（P₂₅，P₇₅）表示，成组比较采用两独立样本均数t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

PMN病例病理特点

PMN病例的光镜下典型病变为：肾小球毛细血管基底膜弥漫、均匀一致增厚，PASM染色显示毛细血管襻基底膜增厚，外缘毛糙伴钉突形成；少数病例伴节段性系膜细胞轻度增生和/或系膜基质轻度增多。

免疫荧光染色显示：IgG为颗粒性荧光，沿肾小球毛细血管襻管壁分布，83%的病例PLA2R阳性，其分布与IgG一致。肾小管及间质IgG和PLA2R均为阴性。

电镜下可见：肾小球毛细血管襻上皮下区细颗粒状电子致密物沉积，基底膜增厚，可伴钉突形成。病理分期结果显示：Ⅰ期30例，早期病变，肾小球上皮下少量电子致密物呈细颗粒沉积；Ⅱ期145例，典型病变期，肾小球上皮下大量电子致密物呈颗粒状连续分布，基底膜增厚，钉突形成，上皮足突广泛融合；Ⅲ期43例，病变进展期，肾小球基底膜上皮下大量电子致密物沉积，个别致密物颗粒有吸收空晕或空腔；Ⅳ期2例，病变严重期，肾小球基底膜内许多电子致密物颗粒吸收后出现虫蛀状空泡，基底膜不规则增厚。其中Ⅱ期患者占65.9%，可见PMN Ⅱ期最为常见。

PLA2R及其IgG亚型的表达情况

PLA2R阳性病例有183例，阳性率为83.2%。其中：（1+）81例，（2+）90例，（3+）12例。免疫荧光结果显示：IgG、IgG4和PLA2R的阳性均为颗粒状沿血管壁分布（图1）。183例PLA2R阳性PMN患者中，男女比为113：70，年龄为50~60岁，180例为IgG4阳性，阳性率为98.4%，其中有21例IgG4强阳性，同时伴有IgG1弱阳性表达。病史小结和随访显示：这些病例除了有蛋白尿或肾病综合征的表现外，无其他系统性疾病的表现，部分患者病情稳定，有少数患者会出现自发缓解的情况。

THSD7A及其IgG亚型的表达情况

在37例PLA2R阴性病例中，有15例THSD7A阳性病例，占全部PMN病例的6.7%（15/220）。其中：（1+）8例，（2+）4例，（3+）3例。15例THSD7A阳性病例中男女占比为9/6，平均年龄为53岁。THSD7A的免疫组化阳性表现是肾小球内沿基底膜呈棕褐色细颗粒线状分布（图2）。15例THSD7A阳性病例中IgG4阳性率为93.3%（14/15），其中有5例IgG4强阳性，同时伴有IgG1弱阳性表达，表明THSD7A以IgG4表达为主。

经病史回顾和随访发现，3例THSD7A阳性患者在PMN诊断后1~5年内先后出现肿瘤病史，1例肺小细胞肺癌，1例乳腺癌，1例B细胞淋巴瘤（该例同时伴有PLA2R阳性）。但肺癌和乳腺癌组织免疫组化THSD7A均阴性（图3）。未收集到B细胞淋巴瘤瘤组织，无法检测抗原。

此外还发现1例是乙肝病毒感染患者（血清乙肝病毒小三阳），但在其肾组织中HBV免疫组化阴性，因此仍诊断为PMN；还有1例62岁患者患有肠克罗恩病史（图4）。

现有研究报道已发现少数病例可出现PLA2R与THSD7A双阳性情况^［9-10］，因此本研究进一步对PLA2R阳性的病例检测THSD7A的表达。排除切片中肾小球数量太少、不完整或肾小球深切丢失的病例，共收集141例PLA2R阳性组织完整的切片再进行THSD7A免疫组化检测，结果显示1例阳性。该例患者为55岁的女性，临床表现为肾病综合征，24小时尿蛋白定量4 g，血糖升高8年，服药控制，其余检查未见特殊异常，2019年11月肾活检病理诊断为PMN，PLA2R阳性。随访至今病情稳定，蛋白尿波动于（1+）~（2+），未见其他非肾病的系统性疾病发生。IgG亚型染色为IgG4阳性（图5）。加上前述的1例肿瘤病例双阳性，PLA2R和THSD7A双阳性病例总计2例，阳性率为1.1%（2/178）。

NELL-1及其IgG亚型的表达情况

37例PLA2R阴性的病例中有3例NELL-1阳性，占比1.4%（3/220），患者平均年龄为47岁。NELL-1阳性表现是沿着肾小球基底膜呈棕色线状分布，其中1例部分肾小球中NELL-1阳性呈节段性分布，肾小管及间质均为阴性（图6），IgG亚型结果为2例IgG1，1例因切片陈旧未检出。随访1~5年，3名患者病情稳定，蛋白尿维持在（1+）~（2+），未出现除PMN之外的其他系统性疾病改变。

PCSK6及其IgG亚型的表达情况

37例PLA2R阴性病例中有1例PCSK6阳性病例，占总病例数的0.45%（1/220），IgG亚型是IgG1，同时合并IgG3弱阳性，实验结果显示PCSK6免疫荧光阳性呈亮绿色细颗粒线状沿肾小球基底膜分布，肾小管及间质均为阴性（图7）。随访后得知，患者在肾穿刺的2年前因为牙疼，曾在一段时间内经常服用布洛芬。

PLA2R阳性和THSD7A阳性病例的临床病理分析

对肾小球组织中4种不同相关抗原进行了检测。因NELL-1和PCSK6的阳性例数较少，无法进行统计比较，因此对PLA2R阳性和THSD7A阳性的两组患者的临床病理资料进行了对比分析。结果显示：两组患者在临床资料的比较中，仅血尿的差异有统计学意义（P<0.05）。在病理改变上，虽然与PLA2R组相比，THSD7A组的节段性系膜细胞增生及肾小球硬化率略高，但差异无统计学意义。PLA2R阳性患者多为PMN Ⅱ期，而THSD7A阳性患者则是PMN Ⅲ期为主，差异性改变有显著统计学意义（P<0.05，表1）。提示PMN中PLA2R阳性和THSD7A阳性表达与PMN的病理改变程度有一定关联。

讨 论

PMN相关致病抗原的研究近年来取得了积极的进展。目前大量研究显示PLA2R、THSD7A、NELL1是PMN的3个主要的相关致病抗原，且肾组织抗原标记结合血清检测相关抗体对PMN的诊断及治疗预后判断有重要的指导作用^{［9，11-13］}。本文因回顾性研究所限，仅在原活检肾小球组织上进行了抗原标记研究。

2009年，Beck等^［3］首先确定了PLA2R是MN中的主要靶抗原。在肾病状态下，肾足细胞异常表达PLA2R^［14］，诱导产生自身抗体IgG4，进而产生免疫复合物，导致PMN发病。美国梅奥医院的研究中，PLA2R阳性的PMN患者约占81%^［4］；北京安贞医院的832例PMN患者中有94%为PLA2R阳性^［6］。本研究中PLA2R阳性率为83.2%，与上述报道的PLA2R阳性率大致相同，证实PLA2R相关PMN的特异性高^［15］。但上述不同地区的PLA2R阳性率也存在差异，这主要与不同国家和地区人群MN发病率的差异、文化背景、生活环境等因素有关。2016年侯凡凡团队的研究中发现2004—2014年在我国北方地区空气污染较重，沙尘暴频发，PMN发病率偏高^［16］；HOU等^［17］的研究中也发现北方高污染地区人群携带PLA2R1风险基因型的个体较多，因而空气污染可能会导致北方比南方地区的PMN发病率高。这可能与我国不同地区PMN发病率分布差异有关。

THSD7A是继PLA2R后被发现的第二个与PMN相关的新型靶抗原^［18］。THSD7A阳性率在不同地区分布差异更加明显：美国梅奥医院报道的阳性率为2%~5%^［6］，北京安贞医院报道的为1.3%^［8］，但日本有报道（2017年）阳性率为9%^［19］，本研究中阳性率为7.3%，提示THSD7A表达可能受到多种因素影响。研究显示约20%~30%的THSD7A相关PMN（THSD7A-PMN）患者可能出现恶性肿瘤病变^［20-23］。本研究中有3例THSD7A阳性患者出现肿瘤病变（20%），分别是肺小细胞癌、乳腺癌和B细胞淋巴瘤，提示THSD7A-MN与肿瘤有一定关联，但本研究中肺小细胞癌和乳腺癌中THSD7A免疫组化阴性，因此THSD7A与肿瘤的相关性和发病机制还有待深入研究。此外，本研究还注意到THSD7A阳性可能还与其他非肿瘤因素有关。感染是PMN的重要诱发因素^［5］，如乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）、人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）感染，但在肾病发病时，在肾组织内没有检测到病毒存在，病理上仍诊断为PMN。英国一项研究发现在PLA2R阴性的病例中有3例THSD7A阳性（1例HBV-PMN，2例HIV-PMN）^［24］。本研究复查病史发现2例与感染有关，1个病例为HBV感染携带者，另有1例有肠克罗恩病病史，提示THSD7A-PMN可能与感染有关。我国HBV感染或携带者比率较高，尤其是南方地区，因此推测本研究中可能会有部分病例与HBV隐性感染相关，这或许是本实验中THSD7A阳性数较多的原因之一。

除此之外，本研究还发现了2例PLA2R和THSD7A双阳性的病例。同一患者PLA2R和THSD7A的双重阳性表达已有报道，但目前还很少见^［25］。北大一院报道578例PMN中发现2例PLA2R+THSD7A双阳性^［9］，安贞医院报道827例PMN中3例PLA2R+THSD7A阳性^［10］，IgG亚型为IgG4。大部分双阳性病例与PLA2R单独阳性患者临床表现差异性较小，其发病机制仍不清楚^［25］。目前发现两抗原之间没有交叉重叠反应，可能是某种病因引起肾脏足细胞损伤，首先PLA2R异常表达，引起足细胞损伤，产生蛋白尿，然后再进一步诱发第二种抗原表达^［25-26］。本研究2个双阳性病例中，1个病例除了MN，随访多年无其他并发症，病情也一直很稳定，可能符合上述两种抗原传递性表达机制；另1个病例当年肾活检只检测了PLA2R阳性，5年后发现了B细胞淋巴瘤，进一步检测肾小球THSD7A且为阳性，虽已有研究显示THSD7A可能与肿瘤细胞分泌有关^［22-23］，但本例没有收集到B肿瘤细胞，无法验证。因此，对于PMN中双抗原阳性的机制和临床意义，目前病例还太少，值得继续积累病例和更深入细致的研究。

NELL-1作为新发现的MN致病抗原^［27］，与前两种抗原不同，足细胞不表达NELL-1，其病理改变也有差异，如肾小球中NELL-1阳性可为节段性分布，IgG1阳性为主^［28］。美国阿肯色州医院和北京安贞医院研究报道的NELL-1相关PMN阳性率分别为1.9%和1.8%^［6，29］，本研究NELL-1阳性率为1.4%（3/220），因此NELL-1相关PMN是较为少见的。最新研究显示NELL-1可能也与恶性肿瘤有相关性^{［27，29］}。如在阿肯色医院研究中有2例有恶性肿瘤病例，其中1例为乳腺癌患者，其肾小球和乳腺癌细胞内发现NELL-1免疫荧光均为阳性^［29］。但在Iwakura（日本）的报道^［30］和北京安贞医院的研究^［6］中，NELL-1阳性病例经随访均未发现伴有肿瘤。本研究中的3例NELL-1阳性病例随访后，暂时也未发现肿瘤或其他疾病改变，可见NELL-1与肿瘤的具体相关性尚不明确，需要收集更多的病例进一步研究。

除上述3种目前报道最多的PMN相关靶抗原外，有关研究还发现了10多种其他抗原^［4］，如PCSK6。研究显示PCSK6与长期使用非甾体抗炎药（nonsteroidal anti-inflammatory drugs，NSAIDs）患者发生PMN相关^［4，8］。本研究检测出的1例PCSK6阳性患者，随访后得知该患者在2年前因为牙疼，一段时间内经常服用布洛芬，这也更加证实了PCSK6与NSAIDs的关联性。经文献检索，这是目前国内报道的第1例PCSK6阳性相关PMN的病例。

在不同抗原与临床表现的相关性研究中，本文针对PLA2R和THSD7A相关抗原标记与临床病理做了对比分析。结果显示，两个抗原标记组的主要临床表现（如尿蛋白、血肌酐分布等）无明显差异，THSD7A组仅血尿水平略高。提示不同抗原相关的PMN临床表现大致相同，这也与其他研究报道结果相似^［9，31］。进一步结合病理改变进行分析发现两组有不同的特点，但大多数指标差异无统计学意义，可能因THSD7A组数量不足所致。PLA2R组主要为Ⅱ期典型性PMN，结合临床更易发展为肾病综合征，而THSD7A组则以Ⅲ期进展期为多，并易出现节段性系膜细胞增生，及更多的肾小球硬化率，结合临床易出现血尿等现象，表明THSD7A组病理改变程度有加重倾向。这些结果与已报道的两个抗原的不同生物学特点相符^{［12-13，32］}，PLA2R是典型的PMN的主要抗原，引起的病变也是较为单纯的典型PMN，肾小球内多无明显的炎症和增生，部分患者可以自愈。目前已经发现THSD7A抗原与多种非膜性肾病的致病因素相关，如肿瘤、感染等，提示其肾小球病理改变可能也更复杂多样。这些结果表明不同的抗原引起的PMN的机制及临床表现不同^［33］。

综上所述，PLA2R是PMN肾组织中的主要致病性抗原，少数病例THSD7A阳性可能与后续病程发展中出现继发的恶性肿瘤、病毒感染等疾病相关。NELL-1和PCSK6阳性少见。PLA2R与THSD7A的不同阳性程度与患者肾病病理改变程度的差异有一定的相关性。加强对PMN的不同抗原检测和研究有益于更深入地认识和阐明PMN的复杂发病机制，并为临床治疗提供更多的病因线索和思路。

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