小鼠牙髓干细胞外泌体通过MSTRG.19716.1促进少突胶质细胞前体细胞分化的机制研究

Mechanisms research on differentiation of oligodendrocyte precursor cells promoted by mouse dental pulp stem cell-derived exosomes via MSTRG.19716.1

摘要

目的 探讨小鼠牙髓干细胞（dental pulp stem cell，DPSC）来源外泌体（DPSC-derived exosome，DPSC-exo）通过MSTRG.19716.1促进少突胶质前体细胞（oligodendrocyte precursor cell，OPC）向成熟少突胶质细胞（oligodendrocyte，OL）分化的作用和机制。 方法 通过RT-qPCR检测DPSC-exo和OPC中MSTRG.19716.1拷贝数。小鼠OPC经外泌体抑制剂Dynasore（20 μmol/L）预处理或预转染siRNA-MSTRG.19716.1，分别给予10、100 μg/mL的DPSC-exo处理48 h。采用免疫荧光法检测OL标志物O4和髓鞘碱性蛋白（myelin basic protein，MBP）表达，采用RT-qPCR检测MSTRG.19716.1、miR-294-3p及少突胶质细胞系转录因子2（oligodendrocyte transcription factor 2，OLIG2）mRNA相对含量，采用荧光素酶实验验证miR-294-3p与Olig2 mRNA的结合及MSTRG.19716.1对其调控作用，采用外泌体示踪法检测DPSC-exo的摄取，采用ELISA检测OLIG2蛋白表达。 结果 DPSC-exo中MSTRG.19716.1的拷贝数显著高于OPC。DPSC-exo处理可显著上调OPC中MBP表达水平，并增加O₄阳性细胞比例，该作用可被Dynasore显著抑制。miR-294-3p可与Olig2 mRNA结合，而MSTRG.19716.1能抑制二者的结合。DPSC-exo摄取可显著上调OPC中MSTRG.19716.1表达水平，并促进OLIG2蛋白表达；转染siRNA-MSTRG.19716.1后，上述作用明显减弱。 结论 DPSC-exo可通过递送MSTRG.19716.1上调OPC中OLIG2蛋白表达，从而促进OPC向OL分化。

Abstract

Objective To investigate the role and underlying mechanism by which mouse dental pulp stem cells-derived exosome （DPSCs-exo） promote the differentiation of oligodendrocyte precursor cells （OPCs） into mature oligodendrocytes （OLs） via MSTRG.19716.1. Methods The copy number of MSTRG.19716.1 in DPSCs-exo and OPCs was determined by RT-qPCR. Mouse OPCs were pretreated with exosome inhibitor Dynasore （20 μmol/L） or pretransfected with siRNA-MSTRG.19716.1， followed by treatment with 10 and 100 μg/mL DPSCs-exo for 48 h. The expression of O4 （a biomarker of OL） and myelin basic protein （MBP） was detected by immunofluorescence assay. The relative expression levels of MSTRG.19716.1， miR-294-3p and oligodendrocyte transcription factor 2 （OLIG2） mRNA were measured by RT-qPCR. A luciferase reporter assay was performed to verify the binding of miR-294-3p to Olig2 mRNA and the regulatory effect of MSTRG.19716.1 on this interaction. Uptake of DPSC-exo was assessed by exosome tracing assay， and OLIG2 protein expression was determined by ELISA. Results MSTRG.19716.1 was significantly enriched in DPSCs-exo compared with that in OPCs. Treatment with DPSCs-exo significantly increased MBP expression and the proportion of O4-positive cells in OPCs， and this effect was markedly inhibited by Dynasore. Further studies showed that miR-294-3p could bind to Olig2 mRNA， whereas MSTRG.19716.1 suppressed this interaction. Uptake of DPSCs-exo significantly upregulated MSTRG.19716.1 levels and promoted OLIG2 protein expression in OPCs. These effects were markedly attenuated after transfection with siRNA-MSTRG.19716.1. Conclusion DPSCs-exo promote the differentiation of OPCs into OLs by delivering MSTRG.19716.1， which upregulates OLIG2 protein expression in OPCs.

Graphical abstract

关键词

牙髓干细胞（DPSC） / 外泌体 / 少突胶质前体细胞（OPC） / 少突胶质细胞（OL） / MSTRG.19716.1 / miR-294-3p / 少突胶质细胞系转录因子2（OLIG2） / 小鼠

Key words

dental pulp stem cell （DPSC） / exosome / oligodendrocyte precursor cell （OPC） / oligodendrocyte （OL） / MSTRG.19716.1 / miR-294-3p / oligodendrocyte transcription factor 2 （OLIG2） / mouse

全球超过10亿人受到神经发育障碍（neurodevelopmental disorders，NDD）的影响^［1-2］。NDD是导致发育期儿童行为和认知功能异常的重要原因，通常以儿童早期起病为特征，其核心病因之一是脑功能发育异常^［3-5］。髓鞘是包裹神经元轴突的保护性脂质结构，对加快神经冲动传导和维持神经系统功能稳定至关重要。在神经发育障碍或神经损伤状态下，髓鞘受损或缺失可导致神经元功能障碍甚至死亡。因此，促进髓鞘再生被认为是NDD及相关神经损伤治疗的重要策略^［6］。然而，作为哺乳动物中枢神经系统（central nervous system，CNS）中有限的内源性修复过程，髓鞘再生效率较低。既往研究表明，少突胶质前体细胞（oligodendrocyte precursor cell，OPC）向成熟少突胶质细胞（oligodendrocyte，OL）的分化是髓鞘再生的关键环节^［7］。OPC是CNS中的重要细胞群，若其分化功能受损，将导致髓鞘形成不足，进而影响神经信号传导以及神经再生与修复^［8］。因此，阐明OPC分化的调控机制，并积极探索促进OPC向OL分化的新方法和新策略，对于NDD及CNS损伤治疗策略的开发具有重要意义，也有望成为多模式治疗体系的重要组成部分。

外泌体具有天然递送载体的优势，在神经损伤修复和再生医学领域展现出良好的应用前景。牙髓干细胞（dental pulp stem cell，DPSC）可通过分泌外泌体（DPSC-exo）将蛋白质、脂质及非编码RNA等活性物质递送至受体细胞，从而调控细胞命运转变及组织修复过程^［9-11］。然而，DPSC-exo是否能够调控OPC分化进而促进髓鞘再生，目前尚缺乏明确证据。长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）-MSTRG.19716.1是我们前期通过高通量测序在DPSC-exo中筛选得到的一种高丰度表达分子。生物信息学分析预测其可作为内源竞争性RNA（competing endogenous RNA，ceRNA），通过分子海绵机制吸附miR-294-3p，从而抑制miR-294-3p与其靶基因少突胶质细胞系转录因子2（oligodendrocyte transcription factor 2，OLIG2）mRNA的结合。已知OLIG2是OPC向成熟OL分化过程中关键的转录调控因子之一^［12］，上述调控轴提示：DPSC-exo可能通过递送MSTRG.19716.1，解除miR-294-3p对OLIG2的抑制作用，从而促进OPC向OL的分化及髓鞘形成。

本研究拟探讨DPSC-exo通过递送MSTRG.19716.1参与OPC分化调控的功能及其分子机制。作为一种新兴的无细胞治疗策略，DPSC-exo具有低免疫原性、高生物相容性及潜在跨越血脑屏障的能力，在中枢神经系统修复中展现出显著应用前景。因此，解析其携带的关键lncRNA在调控少突胶质细胞分化及髓鞘再生中的作用，对于突破传统治疗手段局限具有重要意义。本研究旨在揭示DPSC-exo介导髓鞘再生的分子机制，拓展lncRNA-ceRNA调控网络在神经再生中的理论，并为NDD及CNS损伤的外泌体精准干预提供新的靶点。

材 料 和 方 法

试剂和仪器

小鼠来源的DPSC-exo和OPC均由课题组前期制备。293人胚肾细胞（TCHu43）购于中科院上海细胞典藏中心；DMEM/F-12培养基（11320033）、胎牛血清（A2720803）、0.25%胰蛋白酶（25200-056）、无菌磷酸盐缓冲液（dulbecco’s phosphate buffered saline，DPBS）（10010-023）和Lipofectmaine^® 2000转染试剂（11668019）均购于美国Invitrogen公司；培养板（3516，3524）购于美国Corning公司；细胞总RNA抽提试剂盒（9767）、RNA反转录试剂盒（RR037A）和荧光定量检测试剂盒（RR820A）均购于宝生物工程（大连）有限公司；OL标志物O4（MAB1326）一抗购于美国Bio-Techne公司；外泌体抑制剂Dynasore（Ab120192）、蛋白一抗（Ab53521、Ab203491和Ab7349）和二抗（Ab150113、Ab150077和Ab150159）均购于英国Abcam公司；M-PER细胞总蛋白提取试剂盒（78501）和BCA定量试剂盒（78501和23225）均购于美国Pierce公司。siRNA和DNA合成由上海吉玛生物科技有限公司完成。小鼠Olig2 ELISA试剂盒（MBS2890554）购于美国MyBioSource公司，双荧光素酶检测试剂盒（E1910）和GloMax20/20 Luminometer型荧光素酶活性检测仪均购于美国Promega公司。370系列Steri-Cycle 高温灭菌CO₂培养箱购于美国Thermo公司，Optima XPN型超速离心机购于美国Beckman Coulter公司，NeoScope JCM-7000型台式扫描电镜购于日本电子株式会社。

DPSC-exo表征观察

采用扫描电镜（scanning electron microscopy，SEM）观察DPSC-exo的超微结构和形态特征。参照文献方法^［13］，基于捕获微珠-外泌体-检测抗体三明治法，结合流式细胞术检测DPSC-exo表面标志物CD81和CD9的表达情况。

OPC的培养和鉴定

小鼠OPC由本课题组前期分离制备，来源于出生7天的C57BL/6小鼠脑组织。细胞在无血清条件下培养于DMEM/F12培养基中，并补充2% B27、1% N₂、PDGF-AA（20 μg/L）及bFGF（10 μg/L），以维持其增殖及未分化状态。培养条件为37 ℃、5% CO₂恒温培养箱，每3天更换一次培养基。为鉴定OPC纯度，将细胞接种于多聚-L-赖氨酸（poly-L-lysine，PLL）包被的培养板上，培养24 h后，采用免疫荧光染色检测其特异性标志物A2B5和PDGFRα的表达。

实验分组和处理

对照组：OPC不做处理；DPSC-exo （LD）+OPC组：DPSC-exo终浓度为10 mg/L；DPSC-exo （HD）+OPC组：DPSC-exo终浓度为100 μg/mL；DPSC-exo （HD）+OPC+Dynasore组：DPSC-exo终浓度为100 mg/L，Dynasore终浓度为80 μmol/L；DPSC-exo （HD）+OPC+siRNA-MSTRG.19716.1组：转染siRNA-MSTRG.19716.1（5’-GUACUUACACUGUAAUCUA-3’）至OPC后24 h，添加终浓度为100 mg/L的DPSC-exo；DPSC-exo （HD）+OPC+siRNA-NC组：转染siRNA错义序列（NC，5’-UAUCGAUAUCUGCAAAUC U-3’）至OPC后24 h，添加终浓度为100 mg/L的DPSC-exo。OPC按照1×10⁵个/孔的密度接种于6孔培养板，正常条件过夜培养，待其完全贴壁后添加DPSC-exo和Dynasore，继续培养48 h。siRNA转染按照转染试剂说明书进行。

免疫荧光染色

将OPC接种于无菌玻片并处理后，用PBS洗涤3次。活细胞染O4：加入稀释于培养基中的O4一抗，室温孵育30 min，PBS洗涤3次后加入相应荧光二抗，室温避光孵育30 min。细胞用4%多聚甲醛固定15 min，PBS洗涤后用0.1% Triton X-100透化10 min，PBS洗涤3次。封闭5% BSA 30 min后，于4 ℃过夜孵育MBP一抗。次日，PBS洗涤3次，加入相应荧光二抗，室温避光孵育1 h，随后用Hoechst染色细胞核5 min并封片。荧光显微镜采集图像，ImageJ软件分析O4和MBP信号。O4阳性表示未成熟OPC或早期OL，MBP阳性表示成熟OL，而O4/MBP双阳性细胞表示分化中期OL，可用于评估OPC的分化效率。OPC的A2B5和PDGFRα染色按照常规步骤进行。

RT-qPCR检测

按照RNA提取试剂盒说明书提取细胞总RNA。取1 μg总RNA按照RNA反转录试剂盒说明书制备cDNA，反转录引物使用 Random9和特异性反转录引物（5’-GTCGTATCC AGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGATTTCAC-3’）的混合物。取2 μL 反转录产物作为模板进行扩增。反应体系为20 μL：SYBR Green预混液10 μL，上、下游引物（20 μmol/L）各0.2 μL，cDNA 2 μL，无菌水补足至20 μL。PCR反应条件为：95 ℃预变性10 min；随后进行40个循环：95 ℃ 变性15 s，60 ℃退火/延伸60 s。PCR引物为：miR-294-3p，5’-GTCGTATCCAGT GCGTGTCGT-3’（上游）和5’-AAAGTGCTTCC CTTTTGTGTGT-3’（下游）；U6 （M10329.1），5’- GTGCTCGCTTCGGCAGCACATAT-3’（上游）和5’-AATATGGAACGCTTCACGAATTTG-3’（下游）。MSTRG.19716.1，5’-GAAGTACTTAC ACTGTAATCTAGGT-3’（上游）和5’-TGTAA GTACTTCTGCAATCATAC-3’（下游引物）。OLIG2（NM_016967.2），5’-CGGTGCGCAAGCT CTCCAAG-3'（上游）和5’-TAGATCTCGCTCA CCAGTCGCTT-3'（下游）。β-actin（NM_007393.5），5’-GGAGACGGGGTCACCCACACT G-3’（上游）和5’-TCTTCATGAGGTAGTCTG TCAGG-3’（下游引物）。miR-294-3p、MSTRG.19716.1和Olig2 mRNA相对含量通过2^-ΔΔCt法求得，U6和β-actin分别被用作内参。

同时，采用RT-qPCR对DPSC-exo和OPC中的MSTRG.19716.1进行绝对定量分析。首先，将包含 MSTRG.19716.1目标序列的PCR产物克隆至质粒载体中，测定其浓度并根据相对分子质量计算理论拷贝数。随后对标准品进行10倍系列梯度稀释，构建标准曲线，用于后续样本的定量分析。从DPSC-exo及OPC中提取总RNA，经反转录获得cDNA后进行qPCR检测。根据样本Ct值代入标准曲线方程，计算DPSC-exo的绝对拷贝数。为实现不同样本间的可比性，分别以细胞数量（每10⁶个OPC）及外泌体颗粒数（每10⁹个颗粒）为归一化单位，计算单位生物实体中的MSTRG.19716.1拷贝数。基于该统一标准，对外泌体与OPC中目标转录本的丰度进行比较，从而评估其在外泌体中的富集程度^［14］。

ELISA检测OPC经相应处理后，弃去培养液，使用预冷PBS轻轻洗涤2次，加入细胞裂解液充分裂解，4 ℃下裂解30 min，并于10 000×g离心10 min，收集上清作为待测蛋白样本。按照ELISA试剂盒说明书配制标准品及相关工作液，将标准品和样本分别加入酶标板孔中，37 ℃孵育30 min；随后依次加入检测抗体和酶结合物，按说明书要求孵育并洗板。最后加入显色底物避光反应，待显色充分后加入终止液终止反应，使用酶标仪于450 nm波长处测定各孔吸光度（D值），根据标准曲线计算各组样本中OLIG2蛋白含量。

外泌体摄取实验

DPSC-exo加入前用PKH-26进行标记，于37 ℃、5% CO₂条件下继续培养24 h后去除培养基，使用0.5 mL的DPBS洗细胞2遍，以去除未被细胞摄取的游离外泌体。添加500 μL的4%多聚甲醛固定细胞，对细胞核进行Hoechst染色后拍照。在获得细胞的荧光图像后，使用ImageJ软件对这些细胞中的绿色荧光颗粒数量进行计数^［15］。先分离背景，再根据绿色荧光通道的强度阈值识别绿色荧光颗粒，并进一步统计颗粒数量及荧光强度。

荧光素酶实验

采用生物信息学软件 TargetScan预测Olig2 mRNA与miR-294-3p的潜在结合位点。化学合成miR-294-3p模拟物（5’-AA AGUGCUUCCCUUUUGUGUGUdTdT-3’）、阻遏物（5’-ACACACAAAAGGGAAGCACUUUdT dT-3’）及阴性对照（NC，5’-CUCUCUAGAUUA GUGUCUGUGUdTdT-3’）。将对数生长期的293细胞接种至24孔培养板，每孔1×10⁴个，37 ℃、5%CO₂条件下过夜培养，待细胞完全贴壁后，按照转染试剂说明书进行miR-294-3p模拟物、阻遏物及阴性对照与报告基因载体pGL3-OLIG2-3’UTR （wt）或pGL3-OLIG2-3’UTR （mt）的共转染实验。转染细胞正常条件培养48 h，收集细胞检测荧光素酶活性。将表达载体pcDH-MSTRG.19716.1、miR-294-3p模拟物与报告基因载体共转染293细胞，48 h后收集细胞进行荧光素酶活性检测。

统计学分析

采用GraphPad Prism 9.0软件进行统计学分析。所有实验均为体外实验（n=3）。两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），组间两两比较采用Tukey多重比较检验。在进行统计分析前，对数据进行正态性检验和方差齐性检验。若数据不符合正态分布或方差不齐，则采用非参数检验（如Mann-Whitney U检验或Kruskal-Wallis检验）。P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

DPSC-exo表征和OPC细胞鉴定

SEM表征数据表明，DPSC-exo的粒径分布于50~200 nm，符合外泌体大小的理论参数（图1A）。流式鉴定结果表明，经免疫珠吸附形成的外泌体聚集体绝大多数呈现外泌体标志物CD81和CD9阳性表达（图1B）。免疫荧光染色结果表明，绝大多数OPC同时表达A2B5和PDGFRα，说明OPC纯度较高（图1C）。

DPSC-exo与OPC中MSTRG.19716.1含量比较 定量分析结果表明，DPSC-exo中MSTRG.19716.1的拷贝数为（31.80±7.96）×10⁶/10⁹，显著高于OPC中的（4.56±0.98）×10⁶/10⁶（P<0.01），提示MSTRG. 19716.1在DPSC-exo中具有较高载量（图1D）。

DPSC-exo对OPC分化以及MSTRG.19716.1和miR-294-3p含量的影响

免疫荧光染色结果表明，与对照组比较，DPSC-exo （LD）+OPC组细胞中O4与MBP荧光信号均有所增强（P<0.05或P<0.01），DPSC-exo （HD）+OPC组增加更为显著（P均<0.001，图2A）。RT-qPCR检测结果表明，与对照组比较，DPSC-exo （LD）+OPC组MSTRG.19716.1含量明显增加（P<0.05），DPSC-exo （HD）+OPC组增加更为显著（P<0.001）；与DPSC-exo （HD）+OPC组比较，DPSC-exo （HD）+ OPC+Dynasore组MSTRG.19716.1含量明显降低（P<0.001）。与对照组比较，DPSC-exo （LD）+ OPC组miR-294-3p含量有所降低但差异无统计学意义，而DPSC-exo （HD）+OPC组明显降低（P<0.05）；与DPSC-exo （HD）+OPC组比较，DPSC-exo （HD）+OPC+Dynasore组miR-294-3p含量明显升高（P<0.05，图2B）。

MSTRG.19716.1对miR-294-3p与Olig2 mRNA结合的影响

生物信息学预测显示，在小鼠Olig2 mRNA的3’非编码区（untranslated region，UTR），存在7个碱基的miR-294-3p种子区结合位点5’- AGCACUU-3’ （图3A）。荧光素酶实验结果表明，与pGL3-Olig2-3’UTR （wt）转染组比较，miR-294-5p模拟物或阻遏物与其共转染组293细胞中荧光素酶活性明显降低和升高（P均<0.01）。与pGL3-Olig2-3’UTR （mt）转染组比较，miR-294-5p 模拟物或阻遏物与其共转染组293细胞中荧光素酶活性无显著影响。此外，阴性对照转染对pGL3-Olig2-3’UTR （wt）及pGL3-Olig2-3’UTR （mt）转染的293细胞中荧光素酶活性均无显著影响（图3B）。在MSTRG.19716.1序列上，至少存在3个miR-294-3p种子区结合位点（图3C）。荧光素酶实验结果表明，与pGL3-Olig2-3’UTR （wt）转染组比较，miR-294-5p模拟物与其共转染组293细胞中荧光素酶活性明显降低（P<0.01）；与pGL3-Olig2-3UTR （wt）+ miR-294-5p模拟物转染组比较，pcDH-MSTRG.19716.1+pGL3-Olig2-3’UTR （wt）+miR-294-5p模拟物共转染组293细胞中荧光素酶活性明显上升（P<0.01，图3D）。

DPSC-exo在OPC中的摄取分析

荧光显微镜下，DPSC-exo进入OPC的效率与共孵育时间以及添加浓度呈正比。与对照组相比，DPSC-exo （LD）+OPC组细胞中红色荧光颗粒数明显增加，且24 h组差异有统计学意义（P<0.01）；DPSC-exo （HD）+OPC组中红色荧光颗粒数增加更为显著（12 h组：P<0.05，24 h组：P<0.001）（图4A）。

MSTRG.19716.1沉默对DPSC-exo促进OPC中OLIG2蛋白表达的影响

RT-qPCR检测结果显示，与对照组比较，DPSC-exo （HD）+OPC组MSTRG.19716.1含量明显增加（P<0.001）；与DPSC-exo （HD）+OPC组比较，DPSC-exo （HD）+OPC+siRNA-MSTRG.19716.1组MSTRG.19716.1含量明显降低（P<0.01），DPSC-exo （HD）+OPC+siRNA-NC组无明显变化（图4B）。ELISA检测结果则表明，OLIG2蛋白在各组OPC中的表达变化趋势与MSTRG.19716.1完全一致（图4C）。

讨 论

OPC是CNS中重要的胶质细胞，在神经发育过程中发挥关键作用^［16］，其主要功能是分化为成熟的OL进而形成包裹神经元轴突的髓鞘，从而加快神经冲动传导，维持神经信号的快速高效传递，并为轴突提供保护以及营养和代谢支持。OL的生成及髓鞘化是一个受到精细调控的过程，不仅对大脑正常发育至关重要，在神经再生、神经修复及相关疾病治疗中也具有重要意义。OL缺失或功能异常可导致多种神经系统疾病，如多发性硬化症、脑白质疾病及部分遗传性周围神经病，进而引起神经功能障碍^［17-18］。因此，OPC正常分化为OL在很大程度上决定了髓鞘生成与修复的水平^［19-20］。研究表明，促进OPC分化可加快受损髓鞘的再生，并在神经损伤及神经退行性疾病中发挥积极作用^［21］。在NDD等疾病中，再髓鞘化水平的提高亦与临床症状改善密切相关^［22］。基于上述研究结果，以OPC分化调控为模型，进一步探索促进其向OL分化的有效策略，可为以OPC分化为靶点的神经修复干预提供理论支持。

由于DPSC来源于神经嵴外胚层，具有一定神经趋向性，其外泌体又具备神经保护和促修复再生特性，DPSC-exo在神经损伤修复中的应用潜力已受到广泛关注。研究表明，DPSC-exo可促进神经细胞生长与分化，改善受损神经组织修复，其作用可能与其携带的生长因子及促神经生长信号分子有关。DPSC-exo中的抗炎分子可减轻损伤区域的炎症反应，为神经再生创造有利微环境^［23］；其所含的促血管生成因子还能促进新生血管形成，为受损组织提供氧气和营养支持^［24］。Venugopal等^［25］发现，在体外兴奋性毒性损伤模型中，人DPSC-exo较骨髓间充质干细胞来源的外泌体更能抑制神经细胞凋亡，其机制可能与上调抗凋亡因子Bcl-2有关。另有研究显示，人脱落乳牙干细胞来源的外泌体可显著减少6-羟基多巴胺诱导的多巴胺能神经元凋亡，为其在帕金森病等神经退行性疾病中的应用提供了理论依据^［26］。另有研究表明，人DPSC-exo对创伤性周围神经损伤（peripheral nerve injury，PNI）的修复作用可能与促进髓鞘再生有关^［27］。因此，DPSC-exo已成为神经损伤修复生物治疗领域的重要研究热点，其作为神经修复生物治疗材料的潜力已初步显现。本研究发现DPSC-exo与OPC共培养可显著上调细胞中O4和MBP的表达，而使用外泌体抑制剂Dynasore可有效削弱DPSC-exo的上述作用，提示DPSC-exo能够进入细胞并促进OPC向OL分化。

外泌体富含蛋白质、mRNA、microRNA及lncRNA等多种生物活性分子，能够通过细胞间信息传递调控受体细胞功能^［28］。本研究发现，与OPC相比，DPSC-exo中富集MSTRG.19716.1。进一步机制研究显示，MSTRG.19716.1可通过ceRNA机制竞争性抑制miR-294-3p对OLIG2蛋白表达的负调控，从而促进OPC向成熟OL的分化。目前尚无关于MSTRG.19716.1生物学功能的报道，本研究为其功能研究提供了初步的实验依据。

在生理条件下，DPSC-exo主要作为牙髓微环境中的旁分泌介质，参与组织稳态维持、炎症调控及再生修复等过程，目前尚缺乏其在体内直接调控OPC分化及髓鞘发育的明确证据。然而，鉴于外泌体作为蛋白质及lncRNA的重要递送载体，在细胞间通讯中发挥关键作用，DPSC-exo理论上可能通过递送功能性RNA调控分化相关信号通路，从而影响OPC分化及髓鞘形成。结合本研究结果，推测DPSC-exo可能通过递送MSTRG.19716.1调控miR-294-3p/OLIG2信号轴，从而促进OPC分化。

本研究存在一定局限性。首先，本研究主要基于体外实验，尚缺乏体内验证，在CNS发育异常及神经损伤修复中的实际作用仍需进一步明确。其次，虽然本研究通过靶向沉默MSTRG.19716.1是否逆转DPSC-exo对OPC中miR-294-3p/OLIG2轴的影响，确认了MSTRG.19716.1在DPSC-exo促进OPC分化中的核心作用，然而，考虑到外泌体成分复杂，DPSC-exo中是否含有促进OPC分化的其他功能分子仍有待进一步的筛查。此外，虽然通过比较发现MSTRG.19716.1在OPC中的富集程度远低于DPSC-exo，但这种低背景表达是否受到OPC周边微环境及时空特异性的影响仍有待进一步阐明。

本研究首次发现DPSC-exo能够促进OPC分化和成熟OL生成，提示其在髓鞘形成与再生中具有重要作用。机制研究表明，DPSC-exo的上述作用与其通过递送MSTRG.19716.1影响miR-294-3p/OLIG2信号轴，进而促进OPC分化有关。上述结果为DPSC-exo用于神经发育障碍及神经损伤修复提供了新的理论依据。

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