肺炎克雷伯菌抗CRISPR蛋白AcrIE10的表达纯化及晶体结构解析

Expression， purification and crystal structure analysis of the anti-CRISPR protein AcrIE10 from Klebsiella pneumoniae

摘要

目的 构建抗CRISPR蛋白AcrIE10的原核表达纯化体系，并通过X射线衍射技术解析其晶体结构。 方法 以肺炎克雷伯菌基因组DNA为模板，将acrIE10基因克隆至pET28a-SUMO表达载体，构建重组质粒pET28a-SUMO-AcrIE10，将其转化进感受态细胞BL21（DE3）。通过优化蛋白纯化过程中的条件，确定AcrIE10的最佳纯化条件。通过Ni-NTA亲和层析以及凝胶过滤层析，获得高纯度、高浓度的蛋白溶液。通过晶体培养和筛选，在上海同步辐射光源光束线站收集蛋白晶体衍射数据。 结果 成功构建抗CRISPR蛋白AcrIE10的原核表达纯化体系，切除6×His和SUMO标签蛋白后，确定其最佳纯化温度为20 ℃；经Ni-NTA亲和层析以及凝胶过滤层析方法纯化后得到的蛋白溶液浓度为18 g/L。在PEG 3000（w/v=10%）+咪唑（0.1 mol/L）+盐酸（pH=8.0）+硫酸锂（0.2 mol/L）的结晶条件下，获得高质量蛋白晶体，解析出AcrIE10单体的晶体结构，衍射分辨率为2.39 Å。AcrIE10以同源二聚体形式存在，整体结构由1个较短的β-折叠（β1）和6段α-螺旋（α1~α6）构成，N端区域由β1、α1和α2构成典型的带状-螺旋-螺旋（ribbon-helix-helix，RHH）结构域。 结论 肺炎克雷伯菌的AcrIE10蛋白可在原核生物中高效表达。在切除6×His和SUMO标签蛋白后，20 ℃ 下纯化可获得高纯度AcrIE10蛋白。AcrIE10蛋白的N端具有典型的RHH结构域，提示其可能为双功能抗CRISPR蛋白。

Abstract

Objective To construct a prokaryotic expression vector of the anti-CRISPR protein AcrIE10， and to determine the crystal structure of AcrIE10 protein by X-ray diffraction technology. Methods With the genomic DNA of Klebsiella pneumoniae as the template， the acrIE10 gene was inserted into the pET28a-SUMO expression vector to construct the recombinant plasmid pET28a-SUMO-AcrIE10， which was then transformed into the competent cell BL21 （DE3）. We adjusted the environmental temperature during the protein purification process to explore the optimal purification conditions for the anti-CRISPR protein （AcrIE10）. Using Ni-NTA affinity chromatography and gel filtration chromatography， a pure and high-concentration protein solution was obtained. Then we cultivated and screened crystals， and collected protein crystal diffraction data at Shanghai Synchrotron Radiation Facility beamline station. Results The recombinant plasmid pET28a-SUMO-AcrIE10 was constructed and transformed into competent BL21 （DE3） cells. After removing the 6×His and SUMO tag proteins， the optimal purification temperature was 20 ℃. After purification by Ni-NTA affinity chromatography and gel filtration chromatography， the protein solution concentration was 18 g/L. Appropriate crystals were grown under the conditions of PEG 3000 （w/v=10%）， imidazole （0.1 mol/L）， hydrochloric acid （pH=8.0） and lithium sulfate （0.2 mol/L）. The crystal diffraction resolution was 2.39 Å. The crystal structure of AcrIE10 apo was successfully resolved. The structure analysis showed that the AcrIE10 protein assembled in a homodimeric form. Its overall folding consisted of a short β-sheet （β1） and six α-helices （α1-α6）. β1 and α1， α2 formed the N-terminal domain of the AcrIE10 protein， which was a typical ribbon-helix-helix （RHH） domain. Conclusion The AcrIE10 protein of Klebsiella pneumoniae can be highly expressed in the prokaryotic expression system. By removing the 6×His and SUMO tags and using a purification temperature of 20 °C， the AcrIE10 protein can be obtained more efficiently. The AcrIE10 protein has a typical RHH domain， suggesting that it might be a bifunctional protein.

Graphical abstract

关键词

蛋白纯化 / Ni-NTA亲和层析 / 凝胶过滤层析 / 蛋白结构解析 / AcrIE10 / 肺炎克雷伯菌

Key words

protein purification / Ni-NTA affinity chromatography / gel filtration chromatography / protein structure analysis / AcrIE10 / Klebsiella pneumoniae

成簇规律间隔短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）相关（CRISPR-associated，CRISPR-Cas）系统是已知的唯一一种原核生物的适应性免疫系统^［1］。这一系统在细菌和古生菌中广泛存在，并能抵御诸如噬菌体和质粒等可移动遗传元件的入侵^［2］。CRISPR-Cas系统主要分为两类^［3］，其中第Ⅰ类系统负责CRISPR-Cas防御系统干扰阶段的靶标识别与降解，由一条61个核苷酸组成的crRNA骨架和5种Cas蛋白亚基按照严格的化学计量比组装而成的cascade复合物以及核酸酶Cas3共同组成。

抗CRISPR（anti-CRISPR，Acr）蛋白于2013年首次在铜绿假单胞菌Mu样噬菌体中被发现^［4］，是一类可直接且特异性抑制CRISPR-Cas系统的小分子蛋白。2013—2020年至少54个Acr蛋白家族被陆续鉴定出来，包括100多种Acr成员^［5］。其中多数由生物信息学方法预测，仅少数通过蛋白结构和功能研究得以验证^［5-7］。Acr蛋白在噬菌体体内表达量较低，但是功能强大，微量即可发挥抑制CRISPR系统的防御功能^［8］。然而，许多Acr蛋白在体外理化性质不稳定，无法得到纯度和浓度符合要求的蛋白水溶液，因此限制了研究的深入开展^［9］。

最初Acr蛋白多在噬菌体中发现^［10］，近年来细菌中的Acr蛋白相继被报道，包括AcrIE10蛋白。该蛋白是一种针对I-E型CRISPR-Cas系统发挥抑制功能的小分子蛋白，广泛分布于噬菌体和细菌的基因组中，在细菌中主要分布于肺炎克雷伯菌的质粒上。研究表明，AcrIE10可与I-E型CRISPR-Cas系统中的Cas7亚基互作，抑制CRISPR-Cas系统的功能，从而协助碳青霉烯类耐药质粒bla_KPC逃逸CRISPR-Cas系统的靶向攻击，维持bla_KPC质粒在细菌体内的稳定存在，最终导致耐药质粒在肺炎克雷伯菌中的传播^［11-13］。所以，在临床菌株中开展耐药质粒编码的Acr蛋白的功能和机制的研究具有重要意义。R41（GenBank序列号：SAMN29388315）是一株临床分离的碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌，本课题组通过对R41全基因组测序发现其携带一个含包括bla_KPC在内多种耐药基因的质粒，可介导多种抗菌药物耐药。在该bla_KPC质粒的“抗免疫系统基因簇”中发现了acrIE10基因，推测其可能与bla_KPC耐药质粒的传播密切相关。

本研究旨在建立抗CRISPR蛋白体外的高效表达与纯化体系，并通过晶体培养及X射线衍射收集AcrIE10蛋白晶体的衍射数据，解析其晶体结构。

材 料 和 方 法

菌株和质粒

感受态E. coli DH5α、E. coli BL21（DE3）购买自生工生物工程（上海）股份有限公司。工程质粒pET28a-SUMO由复旦大学附属华山医院抗生素研究所分子实验室保存。

试剂和仪器

PCR预混液、2×Phanta Flash Master Mix、DNA纯化试剂盒和CBB染液（南京诺唯赞生物科技股份有限公司）；限制性内切酶（美国Thermo Fisher Scientific公司）；同源重组酶（艾科瑞生物工程有限公司）；晶体筛选试剂盒（日本Rigaku公司、美国Hampton Research公司）。

ÄKTA Avant 液相色谱系统（美国Cytiva公司）；LL PLUS蠕动泵［卡川尔流体科技（上海）有限公司］；Nanodrop 2000分光光度计、Sorvall LYNX 6000超速离心机（美国Thermo Fisher Scientific公司）。

质粒表达载体的构建

以肺炎克雷伯菌R41（GenBank序列号：SAMN29388315）基因组DNA为模板克隆acrIE10基因，通过酶切连接方法插入原核表达质粒pET28a-SUMO，获得AcrIE10蛋白表达载体。上游引物：5’-TGGTGGATCCGAAT TCGTGAAAAAAGAGATCTCCCGCAACC-3’，下游引物：5’-GTGCGGCCGCAAGCTTCAGCG ATCGAGCCGTTC-3’。使用2×Phanta Flash Master Mix进行PCR反应获得目的片段，反应条件：98 ℃预变性30 s；98 ℃变性10 s，56 ℃退火5 s，72 ℃延伸6 s，变性、退火、延伸循环30次；72 ℃终延伸1 min。PCR产物通过1%琼脂糖凝胶电泳进行分离，通过胶回收试剂盒回收目的DNA。EcoRⅠ和HindⅢ酶切线性化后的pET28a-SUMO 载体与acrIE10基因以摩尔比1∶3混合，用同源重组酶在50 ℃下连接10 min，连接产物转化进DH5α感受态细胞，筛选重组子并测序验证。

蛋白表达纯化

从-80 ℃的冰箱中复苏pET28a-SUMO-AcrIE10甘油菌，挑取pET28a-SUMO-AcrIE10单克隆，接种于20 mL含终浓度50 μg/mL卡那霉素的LB肉汤中，过夜培养；次日稀释至1 L含50 μg/mL卡那霉素的LB肉汤，37 ℃下180 r/min增菌；监测菌液的吸光度（D）至0.6，将菌液置于18 ℃下降温；待菌液降温到18 ℃，加入IPTG诱导蛋白表达，IPTG终浓度为0.5 mmol/L；18 ℃下180 r/min诱导蛋白表达；18~20 h后收集菌液，2 380×g离心15 min，收集菌沉。向菌沉中加入3~4倍体积的裂解缓冲液，同时加入终浓度为1 mmol/L的PMSF以防止目的蛋白降解；使用JN-3000 mini高压细胞破碎仪将菌体破碎3~4次，压力为1.2×10⁶ kPa。将破碎后的菌液分装在超速离心管中，配平后，24 370×g离心1 h，取上清，弃沉淀。使用Ni-NTA亲和树脂富集目的蛋白：将上清接入蠕动泵，使携带6×His标签的目的蛋白流过镍柱。在蛋白洗脱的过程中使用ÄKTA自动化蛋白纯化层析系统：用缓冲液（25 mmol/L Tris-HCl+500 mmol/L NaCl+25 mmol/L咪唑）平衡管道后将镍柱接入系统，进行目的蛋白洗脱。洗脱完成，收集A280出峰位置下的EP管，进行SDS-PAGE电泳鉴定，获取相应的目的蛋白。使用6×HisTag-SUMO蛋白促溶目的蛋白的标签，利用Ulp1蛋白酶可以特异性切除整个标签。根据SDS-PAGE胶图，选择合适出峰位置的蛋白加入透析袋中，并加入适量Ulp1蛋白酶进行酶切。将透析袋置于透析液（25 mmol/L Tris-HCl+150 mmol/L NaCl）中，4 ℃ 下磁力搅拌器连续搅拌透析5 h。收集蛋白溶液，接上蠕动泵，进行第二次镍柱亲和层析；收集流穿液及洗脱液，并通过SDS-PAGE电泳鉴定，收集目的蛋白。浓缩后行凝胶过滤层析，根据目的蛋白的相对分子质量（以下简称“分子量”，约为13 000），选择型号为HiLoad 16/600 Superdex 75 pg的分子筛接入ÄKTA系统，设置流速为1 mL/min，缓冲液体系为25 mmol/L Tris-HCl+150 mmol/L NaCl。

收集凝胶过滤层析纯化后的AcrIE10蛋白，将蛋白溶液平均分成3份，分别置于4 ℃、12 ℃、20 ℃下离心浓缩。根据AcrIE10蛋白的分子量（约为13 000），选择孔径为3 000的蛋白浓缩管，4 ℃下2 380×g离心浓缩。每10~15 min停止，将浓缩管上下颠倒混匀，移液枪轻柔吹打过滤膜，防止局部浓度过高引起蛋白沉淀。离心30 min后，取出不同温度下离心的浓缩管，用EP管（1.5 mL/管）收集蛋白水溶液。

对于切除标签的目的蛋白，取样进行SDS-PAGE电泳以验证蛋白纯度，同时使用NanoDrop 2000测定蛋白溶液的浓度。测完浓度后，13 709×g离心10 min，取上清蛋白溶液进行分装，每管100 μL，液氮速冻，-80 ℃冰箱保存。

蛋白晶体筛选

使用自动化结晶系统Gryphon（美国Art Robbins Instruments公司）对蛋白进行大规模晶体点样筛选。点样程序由系统自动设定，在96孔晶体点样板每孔中添加50 μL池液，在drop处会添加0.2 μL样品以及0.2 μL池液。点板完成后对点样板进行封膜，置于恒温18 ℃晶体房中待晶体生长。筛选所使用的晶体池液试剂盒包括Crystal Screen 1/2、Natrix、Index、PEG/ION、SaltRx1/2（美国Hampton Research 公司）以及Wizard 1/2、Wizard 3/4（日本理学株式会社）。

蛋白晶体结构解析 待晶体生成，挑选体积较大、质地坚硬的单晶，用loop捞取后迅速用液氮冻存。送至上海同步辐射光源收集X射线衍射数据，收集方式采用中心旋转衍射，即让晶体绕转角器中心轴旋转360°，每1°收集1张衍射画面。首先采用​HKL3000程序包​​初步处理衍射数据，再使用分子置换法进行相位解析，以Alphafold3（http：//alphafoldserver.com）预测模型作为初始模型，将其拟合至电子密度图中。利用CCP4、XDS及Phenix等软件套装，对数据进行进一步处理与分析，并将正确的氨基酸序列构建到电子密度中。通过Phenix软件的自动精修功能与Coot程序的手动调整​​相结合，对蛋白三维结构进行迭代优化，直至各项评估指标（包括Rmerge、数据完整性、Rwork和Rfree）均达到结构解析的标准要求。

结 果

pET28a-SUMO-AcrIE10重组表达载体的验证

以R41细菌的基因组为模板，PCR扩增acrIE10基因，基因长度为318 bp，琼脂糖凝胶电泳验证目的基因长度正确。目的片段与线性化载体pET28a-SUMO重组连接后转化至大肠埃希菌DH5α感受态细胞中，测序确认无误后，将重组质粒转化进BL21（DE3）中，挑选阳性转化菌株用于后续试验。

蛋白的表达纯化

使用6×His标签富集目的蛋白，使用SUMO标签增加可溶性蛋白的表达（图1A）。用上述阳性表达菌株进行扩大培养，通过超声破碎、离心取上清液、Ni-NTA亲和层析及凝胶过滤层析得到目的蛋白。经专业网站（https：//www.detaibio.com/sms2/protein_mw.html）计算预测，各蛋白的理论分子量如下：6×His-SUMO-AcrIE10为27 000，6×His-SUMO为14 000，AcrIE10为13 000。结果表明，Ulp1酶将目的蛋白和6×His-SUMO促溶标签成功切开（图1B，泳道5）。将酶切后产物再次使用Ni-NTA挂柱，6×His-SUMO融合标签蛋白应该挂在Ni柱上，而目的蛋白则进入流穿液。流穿液中有较多目的蛋白和少量杂蛋白（图1B，泳道4），继续进行凝胶过滤层析以滤除杂蛋白。取峰下蛋白进行SDS-PAGE电泳，经过凝胶过滤层析后，溶液中几乎无杂蛋白（图1B，泳道1~2）。经Ni-NTA亲和树脂的过滤及凝胶过滤层析，成功得到纯净的AcrIE10蛋白。综上所述，pET28a-SUMO蛋白表达载体可用作AcrIE10蛋白的表达纯化。

蛋白的浓缩温度

一般来说，蛋白溶液浓度越高，越容易培养出蛋白晶体。为了得到高浓度蛋白溶液，使用蛋白浓缩管对蛋白溶液进行浓缩。取相同体积澄清的蛋白水溶液，在不同温度、相同转速下离心30 min。结果发现，在4 ℃时蛋白发生沉降，随着温度升高，溶液逐渐变澄清，在20 ℃时溶液呈现澄清透明（图2），取上清液检测蛋白浓度。NanoDrop 2000读数显示：4 ℃时为1.1 g/L，12 ℃时为7.9 g/L，20 ℃时为18.0 g/L。随着温度逐渐升高，AcrIE10蛋白的溶解度逐渐升高，接近室温时得到高浓度AcrIE10蛋白水溶液。由此可见，AcrIE10蛋白是一个喜温蛋白，建议浓缩时离心机温度设置为20 ℃。

蛋白晶体培养与衍射数据收集

通过提高浓缩温度得到18 g/L的AcrIE10蛋白溶液，使用该浓度的蛋白溶液进行蛋白质晶体的筛选。96孔晶体板在恒温18 ℃ 的晶体房中放置48 h，可见不同条件下的晶体生长。AcrIE10蛋白在PEG 3000（w/v=10%）+咪唑（0.1 mol/L）+盐酸（pH=8.0）+硫酸锂（0.2 mol/L）的条件下生长出合适的晶体，单晶呈长条块状，形状规则（图3）。将单晶送至上海同步辐射光源进行X射线衍射，共收集360张衍射画面。

蛋白晶体结构解析

AcrIE10晶体衍射数据首先采用HKL3000程序包​​进行初步处理，再使用分子置换法进行相位解析，以Alphafold3（http：//alphafoldserver.com）预测模型作为初始模型，将其拟合至电子密度图中。利用CCP4、XDS及Phenix等软件套装，对数据进一步处理和分析，并将正确的氨基酸序列构建到电子密度中。通过Phenix软件的自动精修功能与Coot程序的手动调整相结合，对蛋白三维结构进行迭代优化，直至各项评估指标（包括Rmerge、数据完整性、Rwork和Rfree）均达到结构解析的标准要求（表1）。经蛋白数据库（Protein Data Bank，PDB）审核确认该晶体结构无误，并获得唯一标识号9M71和结构验证报告。

蛋白晶体结构特征分析

AcrIE10蛋白单体（图4A）采用同源二聚体形式组装（图4B），其整体折叠由1个较短的β-折叠片（β1，残基2~12）和6段α-螺旋构成，依次为α1（残基15~23）、α2（残基29~46）、α3（残基52~59）、α4（残基69~86）、α5（残基90~99）及α6（残基104~114）。β1通过一段柔性无规肽链与α1和α2相连，α1与α2呈约60°夹角排布，使α1以“托举”方式支撑β1，共同形成一个典型的带状-螺旋-螺旋（ribbon-helix-helix，RHH）结构域^［14］。结构分析表明，该蛋白以二聚体形式发挥作用，N端存在RHH结构域，即典型的RHH₂架构。作为一种经典的DNA结合结构域，RHH结构域的存在提示AcrIE10蛋白可能具备DNA结合能力。此外，结合AcrIE10蛋白的表面静电势图（图4C）可见，C端结构域主要呈现负电性区域（红色区域），能够排斥带负电的分子；而正电性区域（蓝色区域）则主要集中在N端结构域。核酸分子携带负电荷，更易与带正电的蓝色区域结合。上述结果进一步提示，AcrIE10蛋白的N端结构域可能为其核酸底物的结合区域。

讨 论

Acr蛋白是一类由可移动遗传元件（mobile genetic element，MGE）编码的一类小分子蛋白，能特异性抑制某一类型的CRISPR-Cas系统。研究表明，所有已知的Acr蛋白长度都小于140个氨基酸，且未发现Acr蛋白间的序列与结构相似性，说明不同Acr家族可能具有独立的进化起源^［9］。

Acr蛋白的多样性和序列非保守性使得新型Acr蛋白的预测充满挑战。Acr下游存在一个保守基因，称为抗CRISPR相关基因（anti-CRISPR associated，aca）。Aca蛋白在包括前噬菌体在内的多种MGE中高度保守，已成为鉴定新型Acr蛋白的关键标志。目前已知13个Aca蛋白的N端含有螺旋-转角-螺旋（helix-turn-helix，HTH）DNA结合结构域，通过与acr-aca基因簇的启动子区域结合，抑制下游基因的表达，从而发挥对相关Acr蛋白的转录调控^［15］。尽管Aca蛋白通常编码在相应Acr蛋白的下游，但是在众多Acr蛋白中还存在一类特殊的双功能Acr蛋白。这类蛋白不仅能够抑制CRISPR-Cas系统发挥Acr功能，还具备HTH结构域，发挥转录调控功能。目前已知的双功能Acr蛋白包括AcrIIA1^［16］、AcrIIA6^［17］、AcrIIA13^［18］、AcrIIA14^［19］、AcrIIA15^［12］和AcrIF24^［20］。

蛋白质是生命活动的主要承担者，而蛋白质的结构又是其功能的基础^［21］。结构生物学的方法是研究蛋白质、小分子、核酸等物质功能的重要手段。本研究通过X射线衍射技术，首次解析了AcrIE10蛋白单体的晶体结构，该蛋白以同源二聚体的形式组装，其N端结构域由1个β-折叠片和2个α-螺旋构成经典的RHH结构域，RHH转录因子超家族具有保守的蛋白-DNA相互作用^［22］，利用保守的三维结构基序以序列特异性的方式与DNA结合。这个功能多样的蛋白超家族调控基因的转录，涉及金属的摄取、氨基酸的生物合成、细胞分裂、质粒拷贝数的控制、噬菌体的裂解周期以及许多其他细胞过程^［23-24］。由此推测，除了抗CRISPR-Cas系统的功能之外，AcrIE10可能还通过相关的转录调控功能来精密调控上游相关基因的表达，从而帮助细菌宿主应对不断变化的环境。HTH结构域与RHH结构域同属经典的具备转录调控功能的结构域，基于AcrIE10蛋白晶体结构的解析，发现其含有RHH结构域，提示AcrIE10可能是一个兼具抗CRISPR功能和Aca转录调控功能的双功能Acr蛋白，该结构的解析不仅为深入研究AcrIE10拮抗CRISPR-Cas系统的分子机制提供了基础，同时其N端RHH转录调控结构域的发现，也为深入探索AcrIE10的生物学功能奠定了结构基础。后续我们将开展深入研究，确定AcrIE10的DNA结合位点，评估其对acr基因簇的转录调控作用。

本研究通过构建AcrIE10的原核表达体系，应用Ni-NTA亲和层析、凝胶过滤层析等纯化方法，得到高浓度AcrIE10蛋白，并通过X射线衍射解析出AcrIE10蛋白单体的晶体结构，发现其N端具有RHH结构域，为后续进一步研究AcrIE10参与的生物学过程以及具体分子机制奠定了结构基础。

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基金资助

上海市卫健委青年项目(22410710300)