24份宁夏地区葡萄种质资源遗传多样性分析

Analysis of genetic diversity in 24 grape germplasm resources from Ningxia region

摘要

对宁夏地区葡萄（Vitis vinifera L.）品种进行遗传多样性分析和指纹图谱构建，为葡萄分子育种、遗传改良和种质资源鉴定提供理论基础和参考依据。以24 份葡萄种质为材料，从30 对引物中筛选出多态性及稳定性较高的SSR引物进行PCR扩增。结果表明：筛选出的18 对多态性高、稳定性好的引物，共检测到277 个等位基因，每对SSR引物扩增出等位基因数（Na）6~24 个，平均15.389 个。VMC4F3-1标记扩增等位基因数最多，其次是VMC1C10和Vchr3a，Vchr17a标记最少。有效等位基因数（Ne）为135.039，平均有效等位基因数为7.502，Shannon’s信息指数（I）和多态性信息含量（PIC）分别为1.550~2.517和0.729~0.940。18 对引物中，以引物VMC4F3-1的Na、Ne、I和PIC最高。聚类结果表明，供试葡萄品种分为3 个类群，与Structure群体遗传结构分析和主坐标分析结果高度一致。此外，利用18 对SSR引物构建了24 个葡萄品种的DNA指纹图谱。宁夏地区的葡萄品种具有丰富的遗传多样性，可为中国其他省市葡萄种质资源保存、评价与利用提供参考。

Abstract

This study analyzed the genetic diversity of grape varieties in Ningxia and constructed a fingerprinting map， providing a theoretical basis and reference for molecular breeding， genetic improvement and germplasm resource identification of grapes. A total of 24 grape germplasm samples were utilized as materials， and SSR primers with high polymorphism and stability were selected from 30 pairs of primers for PCR amplification. The results showed that 18 pairs of high polymorphic and stable primers were selected， resulting in a total of 277 alleles detected， with the number of alleles （Na） amplified by each SSR primer ranging from 6 to 24， averaging 15.389. The VMC4F3-1 marker amplified the highest number of alleles， followed by VMC1C10 and Vchr3a， while Vchr17a had the fewest. The effective number of alleles （Ne） was 135.039， with an average effective number of alleles of 7.502. The Shannon information index （I） and polymorphic information content （PIC） ranged from 1.550 to 2.517 and from 0.729 to 0.940， respectively. Among the 18 pairs of primers， VMC4F3-1 had the highest Na， Ne， I， and PIC. The clustering results indicated that the tested grape varieties were divided into three groups， which were highly consistent with the results of Structure population genetic structure analysis and principal coordinate analysis. Furthermore， a DNA fingerprinting map of the 24 grape varieties was constructed using the 18 pairs of SSR primers. The grape varieties in the Ningxia region exhibit rich genetic diversity， which can provide a reference for the conservation， evaluation， and utilization of grape germplasm resources in other provinces and cities in China.

Graphical abstract

关键词

葡萄 / SSR标记 / 遗传多样性 / 指纹图谱 / 宁夏地区

Key words

grape / SSR markers / genetic diversity / fingerprinting map / Ningxia region

葡萄（Vitis vinifera L.）是世界上历史最为悠久的果树种类之一，拥有丰富的农业与文化价值^[1]。葡萄属种质资源非常丰富，在全球范围内有70 多个种，而经过正式登记记录的品种超过了16 000 个^[2]。但是，在长期引种栽培的过程中，不同品种之间可能会发生杂交，导致品种间的界限变得模糊。这些杂交可能会产生新的品种，但同时也导致了同名异物与同物异名现象的普遍存在，这极大地增加了葡萄品种鉴定工作的复杂性与挑战性^[3]。因此，深入研究葡萄种质资源的亲缘关系对保护遗传资源和促进葡萄育种具有重要意义。

葡萄品种的鉴定方法主要包括形态学鉴定法、生物化学鉴定法和DNA分子标记法‎^[4]。其中形态学标记是最常用的方法，但它主要依靠对植物外部形态进行观察和描述，如籽粒大小、颜色、叶形、花色和抗逆性等特性，对于内部结构和生理特征等方面难以鉴定。这就可能导致某些植物品种在形态上相似，难以区分。为了提高葡萄品种鉴定的准确性和可靠性，通常采用分子生物学、细胞学和生化分析等多种科学方法进行综合鉴定，从而克服传统形态学鉴定的局限性。其中分子标记具有很大的优势，扩增片段长度多态性（AFLP）、简单重复间序列（ISSR）、简单重复序列（SSR）、相关序列扩增多态性（SRAP）以及近年来逐渐兴起的目标起始密码子多态性（SCoT）等标记方法已广泛应用于葡萄的多个领域，如遗传图谱构建、品种鉴定和杂交种纯度分析、亲缘关系分析、基因标记，以及育种和种群遗传研究中的许多其他领域^‎[5]。然而，在各种标记系统中，SSR标记因其共显性、易检测、多态性高以及重复性高而成为首选标记。SSR是基于聚合酶链式反应（PCR）的DNA标记技术，目前已用于多种果树，包括杏^‎[6]、苹果‎^[7]、柑橘^‎[8]、梨‎^[9]、桃‎^[10]等。Riaz等^‎[11]首次使用基于SSR标记的方法，成功鉴定了北美圆叶葡萄（V.rotundifolia Michx.）的栽培品种和杂交品种。王富强等‎^[12]建立了一套适合于葡萄DNA指纹图谱构建的技术体系，为葡萄种质资源的鉴定提供了依据。目前，众多研究已经证实，诸如RFLP、RAPD、AFLP和ISSR等一系列分子标记技术已经应用于葡萄品种鉴定、品种间的亲缘关系和种质间遗传多样性的分析等研究。然而，应用SSR标记进行宁夏葡萄亲缘关系研究的报道相对较少。本文以宁夏地区的24 份葡萄种质资源为材料，利用SSR标记对其进行指纹图谱构建及遗传多样性分析，为葡萄品种鉴定和分子标记辅助育种提供参考依据。

1 材料和方法

1.1 材料

试验所用葡萄品种资源共计24份（表1），精选自宁夏地区广泛种植的葡萄品种，其中包括了一些传统的、有地方特色的以及近年来引进的新品种，均于2023年5月采自位于银川市贺兰县的宁夏农垦农旅产业园。采集新鲜幼嫩叶片，在-80 ℃下保存，用于DNA的提取。

1.2 葡萄DNA的提取

采用DNAsecure新型植物基因组DNA提取试剂盒（TIANGEN，北京），按照离心柱法的操作说明从叶片中提取DNA。采用超微量分光光度计测定DNA浓度和纯度。

1.3 SSR引物筛选和PCR扩增

选用的标记全部来自葡萄已报道的相关标记^‎[12]，从中筛选出18个标记。普通引物和分别用HEX、TAM、ROX 3 种荧光标记的M13荧光引物均由北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成。

PCR扩增使用20 μL体系：2×M5 HiPer plus Taq HiFi PCR mix 10 μL，引物4 μL，DNA模板2 μL，荧光引物4 μL。

PCR反应程序：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共35个循环；72 ℃延伸10 min。

1.4 毛细管电泳检测

PCR产物由上海宇英生物科技有限公司进行毛细管电泳检测，用Gene-Marker软件（Soft Genetics LLC， USA）进行数据分析。

1.5 数据分析

利用GenAlEx（v6.502）软件计算遗传多样性指数，包括观测等位基因数（Na）、有效等位基因数（Ne）、观测杂合度（Ho）、期望杂合度（He）和Shannon’s信息指数（I），并且进行主坐标分析（PCoA）。利用PowerMarker（v3.25）软件计算各标记位点的多态性信息含量（PIC），并基于UPGMA方法生成聚类图。利用Structure（v2.3.4）软件分析群体遗传结构，群体数（K）设置为1~10，每个K值重复运行10次。MCMC预迭代（burn-in）设为10 000次，burn-in后的MCMC迭代设为100 000 次。将Structure运算结果导入Structure Harvester网站（http：//taylor0.biology.ucla.edu/structureHarvester/），根据Evanno等‎^[13]方法选择最佳K值。

1.6 指纹图谱的构建

利用王琰琰等^[14]确立的方法，构建DNA指纹图谱。遵循SSR引物编号的自然递增顺序（A、B、C、…），系统化地记录每个样本针对各SSR引物的扩增条带数据。对于单一扩增条带的产物，实施重复性记录1 次，省略分子量单位（bp），仅保留数字；若条带多重，采用“/”符号连接各数字；若无扩增条带显现，则以0标示。通过此方法，将品种特性转化为由字母与数字交织的独特带型编号。随后，将这些数据及品种名称、植物学分类、指纹带型编号等关键信息，集成输入至草料二维码生成平台（http：//cli.im/），以生成对应的二维码标签，实现信息的便捷记录与追溯。

2 结果与分析

2.1 SSR标记的筛选

利用30 对引物对随机选取的‘赤霞珠’和‘美乐’2 个葡萄品种进行扩增，初步筛选出扩增产物条带清晰稳定的引物，共20 对（图1）。对这20 对引物进行毛细管电泳多态性检测，共检测筛选出18 对多态性较高的SSR引物（表2）。

2.2 SSR引物多样性分析

利用18对引物对24个葡萄品种基因组DNA进行扩增，结果表明，18对引物共扩增出277 个等位基因（表3），每个SSR位点扩增出的等位基因个数不等，变化范围为6~24，引物的平均等位基因数为15.389，有效等位基因数是3.734~11.535，平均为7.502，表明18对引物均具有较好的扩增效果。引物VMC4F3-1扩增的等位基因数最多，达24个，等位基因数位点最少的引物是Vchr17a，只有6个。扩增的有效等位基因数最多的是引物VMC4F3-1，多达11.535 个，最少的是引物Vchr16a，为3.734。观测杂合度和期望杂合度分别为0.444~0.917和0.721~0.906，平均分别为0.716和0.848。Shannon’s信息指数和多态性信息含量分别为1.550~2.517和0.729~0.940。18 对引物中，VMC4F3-1的等位基因数、有效等位基因数、Shannon’s信息指数和多态性信息含量值最高。

2.3 遗传结构与聚类分析

2.3.1 遗传结构分析

利用Structure 2.3.4软件分析遗传结构并预测最佳K值，结果得出K为3时，\mathrm{\Delta }K达到最大值（图2），即24 个葡萄种质被划分为3 类亚群，各类亚群品种数分别为14、9和1。其中，亚群Ⅰ包括‘奥古斯特’（8）、‘阳光玫瑰’（24）、‘玫瑰香’（10）、‘蜜光’（21）、‘红艳天松’（17）、‘红地球’（16）、‘汤姆逊’（11）、‘大青’（9）、‘威代尔’（20）、‘瑞都红玉’（15）、‘美人指’（18）、‘霞多丽’（7）、‘贵人香’（6）和‘摩尔多瓦’（22）；亚群Ⅱ包括‘白宝石’（12）、‘维多利亚’（13）、‘赤霞珠’（1）、‘红十月’（14）、‘6-12’（3）、‘美乐’（4）、‘南太湖特早’（23）、‘甜蜜蓝宝石’（2）和‘马瑟兰’（5）；亚群Ⅲ仅包括‘贵妃玫瑰’（19）1 个品种（图3）。大部分葡萄品种的Q值均高于0.6，推测该部分葡萄材料遗传组分相对单一。

2.3.2 聚类分析

聚类分析结果（图4）显示全部材料可划分为3 大群类，第Ⅰ类仅包括‘贵妃玫瑰’1 个品种，说明该品种与其他品种遗传关系较远。第Ⅱ类包括‘马瑟兰’‘美乐’‘赤霞珠’‘甜蜜蓝宝石’‘南太湖特早’‘红十月’‘6-12’‘维多利亚’和‘白宝石’9 个品种。其中‘维多利亚’与‘白宝石’的遗传距离最小，仅为0.155 2，说明这2 个品种具有非常相近的遗传背景。其余14 个品种被分到第Ⅲ类。本研究基本反映了24 个葡萄品种的亲缘关系。

2.3.3 主坐标分析

为了更好地研究不同葡萄种质间的遗传关系，利用GenAlEx 6.502基于遗传距离矩阵进行主坐标分析（PCoA），并绘制散点图（图5）。如图5所示，主坐标分析将24 份葡萄种质划分为3 组：Ⅰ组包括‘贵人香’（6）、‘霞多丽’（7）、‘奥古斯特’（8）、‘大青’（9）、‘玫瑰香’（10）、‘汤姆逊’（11）、‘瑞都红玉’（15）、‘红地球’（16）、‘红艳天松’（17）、‘美人指’（18）、‘威代尔’（20）、‘蜜光’（21）、‘摩尔多瓦’（22）、‘阳光玫瑰’（24）14 个种质；Ⅱ组包括‘赤霞珠’（1）、‘甜蜜蓝宝石’（2）、‘6-12’（3）、‘美乐’（4）、‘马瑟兰’（5）、‘白宝石’（12）、‘维多利亚’（13）、‘红十月’（14）、‘南太湖特早’（23）9 个种质；Ⅲ组只有‘贵妃玫瑰’（19）1 个种质。

2.4 指纹图谱

参考薛华柏等‎^[21]的SSR特征指纹数据表构建方法，研究发现，2 对SSR引物组合（VMC4F3-1和VVMD25）就可以将24 份葡萄品种完全区分开。其中引物VMC4F3的区分能力最强，多态位点数达24 个，可以区分‘贵人香’‘汤姆逊’‘贵妃玫瑰’和‘霞多丽’等22 个品种。并参照王琰琰等‎^[14]的方法进行DNA指纹图谱构建。同时，为方便查询24 份葡萄品种的指纹信息，用在线软件草料二维码软件对每个葡萄品种的指纹图谱进行QR编码（图6）。

3 讨论与结论

育种的基础和引种栽培以及资源保护的基础都在于种质资源的遗传多样性‎^[22]。多年来，研究人员对葡萄遗传多样性进行了深入研究。SSR分子标记被广泛地用于葡萄遗传多样性研究。多态性信息指数（PIC）是用来衡量SSR引物多态性高低的重要指标。1980年，Botstein等^‎[23]首先提出多态性信息量指标，以衡量基因变异程度的高低，指出当PIC>0.5时，该引物为高度多态性信息引物，当0.25≤PIC≤0.5时，该引物为中度多态性信息引物，当PIC<0.25时，此引物为低度多态性信息引物。董志刚等‎^[24]从44 对SSR引物中筛选出15 对特异性引物用于随后的SSR扩增，共扩增出56 条条带，其中多态性条带51 条，多态性百分率为94.4%。本研究利用SSR标记对宁夏地区葡萄品种资源的遗传多样性进行研究。筛选的18对SSR引物等位基因数平均为15.389，PIC在0.729~0.940之间，表明引物多态性总体很高，与王富强等^[12]的研究结果相符。其中，引物VMC4F3-1扩增的等位基因数达24个，且PIC值最大（0.940），表明该引物鉴别能力较好，可作为葡萄种质鉴别和遗传多样性分析的首选引物^‎。根据表3的结果可知，18对SSR引物的Ho值介于0.444~0.917之间，平均值为0.716，其He值介于0.721~0.906之间，平均值为0.848。在这18 对引物中，有12 对的He值超过了平均值，说明这24 份资源的遗传多样性丰富。然而，Ho的平均值明显低于He的平均值，并且14 对引物的Ho值低于He值，说明大部分位点上纯合子的比例较高^‎[25]。18 对SSR引物I值为1.550~2.517，平均值为2.093，其中15 对引物的I值大于2.0，进一步说明24份资源的遗传多样性比较丰富。研究结果表明，PCoA与UPGMA聚类分析在整体分类趋势上保持一致。参照苏一钧等^[26]判断葡萄种质遗传背景的方法，发现‘贵人香’‘霞多丽’‘摩尔多瓦’‘马瑟兰’的Q值均低于0.6，表明这些种质遗传组成较为复杂，难以明确其归属类别。而剩余的20 份葡萄种质，其Q值均不低于0.6，表明这些种质的遗传结构较为单一，可以被归类到特定的群体中。

SSR标记已在多种果树的遗传指纹图谱构建中展现出显著的应用潜力。例如，王瑞等‎^[27]利用22 对SSR引物对168 个石榴品种进行DNA指纹数据库构建。李超等‎^[28]利用引物-带型组合法，成功构建了18 个西州密甜瓜材料的指纹图谱。然而，在葡萄研究领域，尽管SSR技术已被广泛用于遗传多样性分析，但在葡萄指纹图谱构建方面的应用相对有限。鉴于葡萄品种的多样性和复杂性，以及市场对高品质葡萄品种日益增长的需求，利用SSR标记构建葡萄指纹图谱显得尤为重要。因此，未来应加大SSR技术在葡萄指纹图谱构建方面的研究和应用力度，以推动葡萄产业的持续进步和繁荣。

本研究通过选择前人建立的适用于中国的葡萄SSR分子标记体系中的30 个SSR标记进行试验，并从中筛选出18 个在宁夏葡萄种质资源中展现出较高多态性的标记。这些标记能够较好地代表宁夏葡萄种质资源的遗传多样性。SSR标记的多态性高，能够提供足够的信息以区分不同的种质资源，能够为宁夏葡萄种质资源的遗传多样性研究和指纹图谱构建提供准确和有效的数据，这对葡萄杂交育种以及优良种质创新具有重要的指导意义。但本研究只分析了宁夏地区部分葡萄种质，这可能不足以全面代表宁夏地区葡萄的遗传多样性，且研究仅使用了SSR标记，没有结合其他类型的分子标记进行分析，这可能限制了对遗传多样性的全面理解。宁夏地区葡萄的遗传多样性还需进一步深入研究。

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基金资助

宁夏自然科学基金项目(2022AAC03010)

宁夏重点研发计划项目(2021BBF03006)

宁夏重点研发计划项目(2022BBF03004)