生物炭与复合菌剂对玉米秸秆堆肥酶活性、理化性质的影响

Effects of biochar and composite microbial agent on enzyme activity and physicochemical properties of corn straw compost

摘要

为研究玉米秸秆堆肥纤维降解复合菌剂（fiber degrading compound microbial agent， FDM）的最适配比、最适生物炭用量，二者配施对堆肥纤维降解酶活性、理化性质的影响，以及堆肥酶活性与理化性质的相关性开展试验。利用纤维降解菌解蛋白芽孢杆菌（Bacillus proteolyticus）X51和长梗木霉（Trichoderma longibrachiatum）Z8-2，通过测定2株菌株在添加生物炭质量分数（w）为0%~5.0%（梯度0.5%）培养基中的内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶、木质素过氧化物酶、漆酶和锰过氧化物酶活性，确定X51和Z8-2按活菌数2.5∶1配比为最佳的菌株配比，w（生物炭）为3.0%处理的发酵液的纤维降解酶活性最高，并用于后续堆肥试验。玉米秸秆好氧发酵堆肥设置w（生物炭）为0%、2.5%、3.0%、3.5%及接种FDM（X51活菌数1×10⁹ CFU∙kg^-1，Z8-2孢子数2×10⁸个·kg^-1）和不接种2 组，共8 个处理，以无添加为对照。结果表明，FDM配施生物炭可促进堆肥升温，延长高温期2~5 d，提前10 d腐熟。腐熟时，各配施处理的有机碳、全氮含量分别提高36.2%~65.6%和37.8%~91.0%，CO₂和NH₃排放量分别降低61.9%~70.5%和43.9%~62.8%，6种纤维降解酶活性增加0.3%~503.8%，β-葡萄糖苷酶活性增幅最大，添加w（生物炭）为3.0%的效果最优。由结构方程分析可知，生物碳和FDM配施通过增强纤维降解酶活性促进堆肥碳氮转化和腐熟，减少碳氮损失及温室气体排放。其中，内切葡聚糖酶和木质素过氧化物酶在碳氮转化上起主要直接作用，漆酶具有一定保氮作用。二者的影响具有叠加效应。综上所述，生物炭和FDM配施有利于堆肥快速腐熟，改善物料理化性质。

Abstract

This study aimed to investigate the optimal ratio of the fiber degrading compound microbial agent （FDM） for corn straw compost， the appropriate amount of biochar， and the impact of their combined application on the enzyme activity and physicochemical properties of compost， as well as the correlation between compost enzyme activity and physicochemical properties. Using the fiber degrading bacteria Bacillus proteolyticus X51 and Trichoderma longibrachiatum Z8-2， the study measured the activity of endo-β-glucanase， exo-β-glucanase， β-glucosidase， lignin peroxidase， laccase， and manganese peroxidase in media with varying biochar mass fractions （w） of 0 to 5.0% （in 0.5% increments） to determine that the optimal strain ratio was 2.5∶1 （X51 to Z8-2 based on viable cell count） and that the fermentation liquid with 3.0% biochar showed the highest fiber degrading enzyme activity， which was used for subsequent composting experiments. The aerobic fermentation composting of corn straw was set up with w （biochar） at 0， 2.5%， 3.0%， 3.5%， and inoculated with FDM （X51 viable cell count 1×10⁹ CFU·kg^-1， Z8-2 spore count 2×10⁸ spores·kg^-1） and non-inoculated groups， amounting to a total of 8 treatments， with the control being no additives. The results showed that the combined application of FDM and biochar could promote compost heating， extend the high-temperature phase by 2 to 5 days， and accelerate maturity by 10 days. During maturity， the organic carbon and total nitrogen content in various treatments increased by 36.2% to 65.6% and 37.8% to 91.0%， respectively， while CO₂ and NH₃ emissions decreased by 61.9% to 70.5% and 43.9% to 62.8%， respectively， with the activity of six fiber degrading enzymes increasing by 0.3% to 503.8%， and the largest increase was seen in β-glucosidase activity， with the optimal effect at 3.0% biochar addition. Structural equation analysis indicated that the combined application of biochar and FDM promotes the carbon-nitrogen transformation and maturity of compost by enhancing fiber degrading enzyme activity， reducing carbon and nitrogen losses and greenhouse gas emissions. Among them， endo-β-glucanase and lignin peroxidase play a major direct role in carbon-nitrogen transformation， while laccase has a certain nitrogen retention effect. The effects of the two have a cumulative effect. In summary， the combined application of biochar and FDM is beneficial for the rapid maturity of compost and improves its physicochemical properties.

Graphical abstract

关键词

生物炭 / 纤维降解复合菌剂 / 玉米秸秆堆肥 / 纤维素酶活性 / 木质素酶活性

Key words

biochar / fiber degrading microorganism / corn straw compost / cellulase activity / lignin enzyme activity

农业秸秆类废弃物来源广泛，产量巨大。堆肥作为秸秆资源化利用的主要方式^[1]，主要依靠微生物分泌胞外酶催化有机物的转化，最终实现秸秆的矿质化、腐殖化和无害化^[2]。但是，堆肥过程会释放二氧化碳、氨气等气体，导致物料碳氮损失、堆肥品质下降，同时带来环境污染等问题^[3]。因此，合理使用秸秆堆肥添加剂以促进酶活性，对于缩短腐熟时间，减少二氧化碳、氨气等气体排放，改善堆肥品质至关重要。

针对秸秆高效堆肥需求，促腐熟菌剂和其他促腐熟剂的研发及其作用机制成为研究热点。大量研究表明，接种促腐熟菌剂能显著影响堆肥的菌群结构，增加多种水解酶活性，有效促进堆肥物料转化，加速腐熟进程^[4-5]。促腐熟菌剂通常由纤维类或蛋白质类降解酶活性较高的细菌、真菌等多种微生物组成，较单一菌更有利于有机物的快速降解^[6]。生物炭（biochar，BC）具有比表面积大、微孔结构丰富等特征，既能为堆肥中的微生物提供良好栖息环境，有利于氧气传输，增强微生物代谢、产热能力，又能减少热量和水分散失，有利于堆肥保温、升温，还能减少二氧化碳、氨气等气体排放，提高堆肥产物品质^[7-8]。为进一步优化堆肥工艺，Tu等^[9]在猪粪堆肥中添加BC（0.5%）和商业复合菌剂，发现二者配施较单加BC、单加菌剂显著促进了猪粪堆肥进程。Awasthi等^[10]研究添加BC（12%）和复合型细菌菌剂对牛粪堆肥的影响，证明二者配施可调整堆肥微生物活性，促进纤维素降解，改善堆肥效果。Wang等^[11]发现，BC和复合菌剂配施可显著促进羊粪堆肥的腐熟进程。以上研究说明，堆肥中施用BC和促腐熟菌剂可以发挥一定的协同增效作用，进行堆肥发酵时要综合考虑底物的组分特征、菌剂构成及BC的差异，利用堆肥发酵试验明确最优配比方案。

玉米秸秆通常富含纤维素和少量木质素等大分子多糖，需要多种水解酶协作完成其降解转化。该过程涉及的纤维素酶主要有内切葡聚糖酶（endoglucanase，ED）、外切葡聚糖酶（exoglucanase，EG）和β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase，BG）等；木质素酶主要包括木质素过氧化物酶（lignin peroxidase，Lip）、漆酶（laccase，Lac）和锰过氧化物酶（manganese peroxidase，Mnp）等^[12]。堆肥初期，纤维素酶活性快速增高，促进有机物的分解和转化^[13]，同时Lip、Lac和Mnp等木质素酶参与降解过程^[14]。在堆肥中分别添加纤维降解菌剂和BC，前者可提高纤维降解酶的活性，加速物质转化^[15]，后者能调控堆肥物料菌群，两者均能促进堆肥快速腐熟^[16]。但是，在玉米秸秆堆肥中配施纤维降解复合菌剂（fiber degrading compound microbial agent， FDM）和BC的优化方案，6 种纤维降解酶活性的响应规律及其与堆肥理化性质的相关性等尚不清楚，有待深入研究。

本试验利用实验室前期筛选获得的、具有纤维素和木质素降解功能的细菌和真菌各1株，以3种纤维素降解酶和3种木质素降解酶活性为核心指标，采用培养试验明确最佳FDM配比方案和BC添加量；利用好氧堆肥装置开展FDM和BC配施对堆肥的影响研究，基于玉米秸秆堆肥的理化性质和酶活性变化规律，结合二氧化碳、氨气的排放和物料腐熟情况等，分析总结最佳的FDM和BC配比方案，以期为玉米秸秆堆肥调控技术提供理论依据，促进秸秆高效资源化利用。

1 材料与方法

1.1 材料

纤维降解菌：解蛋白芽孢杆菌（Bacillus proteolyticus）X51（NCBI号OM371062）^[17]、长梗木霉（Trichoderma longibrachiatum）Z8-2（NCBI号MK934494）^[18]。二者对纤维素和木质素均有一定降解功能，由宁夏大学农业微生物学实验室筛选和提供。

培养基：牛肉膏蛋白胨培养基（BP）、马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）、木质素酶培养基（LD）、纤维素酶培养基（CD）^[19]。其他化学试剂均为分析纯。

BC和玉米秸秆：BC裂解温度为400 ℃，粒径小于0.01 mm，未水洗加工，购自河南金丰环保工程有限公司。玉米秸秆为收获后的干秸秆，取自宁夏青铜峡市农田，粉碎至粒径小于1 cm。物料基本性质见表1。

1.2 试验设计

1.2.1 BC对FDM发酵液纤维素酶和木质素酶活性的影响

细菌活化：BP平板，30 ℃，相对湿度（RH）为85%，恒温培养24 h；真菌活化：PDA平板，28 ℃，RH为 85%，恒温培养2 d。

菌悬液制备：将活化的X51接种于BP液体培养基，28 ℃，160 r·min^-1恒温培养2 d，用无菌去离子水调节活菌浓度为1×10⁸ CFU·mL^-1。

孢子悬液制备：将活化的Z8-2接种至PDA平板，28 ℃，RH 为85%，恒温培养4~6 d，用无菌去离子水冲洗，制取孢子悬液，调节孢子浓度为1×10⁷个·mL^-1。

FDM由X51菌悬液与Z8-2孢子悬液组成，设置体积比为1∶1、2∶1、1∶2，折合为活菌数为5∶1、10∶1、2.5∶1共3个配比方案；以接种量为10%，将FDM分别接入LD和CD培养基。同时，试验设置BC添加量梯度，在产酶培养基中分别添加BC的质量分数（w）为0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%、4.5%、5.0%，以不加BC为CK₀，每组11个处理。将各处理置于30 ℃、180 r∙min^-1恒温培养2 d。每处理设置3个重复。至培养结束，检测发酵液上清液的ED、EG、BG、Lip、Lac、Mnp酶活性，明确6种纤维降解酶活性最高的菌剂配比方案和BC添加量。

1.2.2 BC和FDM对玉米秸秆堆肥的影响

进行充气堆肥发酵试验，装置仿文献[17]。使用尿素将玉米秸秆粉碳氮比调节为25∶1。发酵桶容积20 L，装玉米秸秆粉1.0 kg，FDM接种量为10%，设置w（BC）为2.5%、3.0%、3.5%，以不加FDM、不加BC为CK，共8 个处理（表2）；调节物料含水率约60.0%。试验装置置于50 ℃恒温箱内。每天根据水分散失情况补充无菌去离子水，保持含水率约60.0%，每24 h记录温度，每5 d检测1 次NH₃和CO₂释放量并多点混合采样，每处理单批次取样约150 g。部分鲜样用于腐熟度检测；部分样品阴干后检测纤维素酶、木质素酶活性；部分样品过1.0 mm筛，检测pH、电导率（EC）、有机碳和全氮含量，每处理设置3重复。

1.3 方法

生物学指标：ED、EG、BG酶活性检测均采用DNS法^[18，20]。酶活力计算公式为

\mathrm{酶活}\mathrm{力}(\mathrm{U}\cdot \mathrm{m}{\mathrm{L}}^{-\mathrm{1}})=\frac{\mathrm{葡萄}\mathrm{糖生}\mathrm{成量}(\mathrm{m}\mathrm{g})}{\mathrm{时间}(\mathrm{m}\mathrm{i}\mathrm{n})\times \mathrm{酶液}\mathrm{加入}\mathrm{量}(\mathrm{m}\mathrm{L})}。（1）

Lip酶活性检测采用藜芦醇氧化法^[21]；Lac酶活性检测采用ABTS法^[22]；Mnp酶活性检测采用Mn²⁺氧化法^[23]；1 个酶活力单位（U）定义为每分钟分别氧化1 μmol藜芦醇、ABTS、Mn²⁺所需的酶量。

种子发芽指数（GI）测定^[24]：按m（物料样品）∶v（无菌水）=1∶10浸提24 h制备物料浸提液，在直径为90 mm培养皿中铺1张等直径无菌圆滤纸，加入物料浸提液6 mL，放入20粒小油菜种子，置于28 ℃的恒温培养箱中培养72 h，统计种子发芽率，并用游标卡尺（精度0.01 mm）测定发芽种子的根长，计算GI。种子发芽率和发芽指数计算公式分别为

\mathrm{种子}\mathrm{发芽}\mathrm{率}=\frac{\mathrm{发芽}\mathrm{的种}\mathrm{子数}}{\mathrm{种子}\mathrm{总数}}\times \mathrm{100}%，（2）

\mathrm{G}\mathrm{I}=\frac{\mathrm{堆肥}\mathrm{浸提}\mathrm{液的}\mathrm{种子}\mathrm{发芽}\mathrm{率}\times \mathrm{种子}\mathrm{根长}}{\mathrm{蒸馏}\mathrm{水的}\mathrm{种子}\mathrm{发芽}\mathrm{率}\times \mathrm{种子}\mathrm{根长}}\times \mathrm{100}%。（3）

物理化学指标：于每天15：00测温；pH、EC分别使用pH计和电导仪测定；有机碳（TC）含量采用重铬酸钾外加热法测定；全氮（TN）含量采用H₂SO₄-H₂O₂消煮半微量凯氏定氮法测定^[25]；NH₃排放量采用硼酸吸收-硫酸滴定法测定；CO₂排放量采用NaOH吸收-硫酸滴定法测定^[26]。

1.4 数据整理与分析

使用Microsoft Excel 2019软件进行数据整理，SPSS 27.0软件进行统计分析，采用LSD法进行多重比较，利用Origin 2023、IBM SPSS Amos 27.0软件进行分析与绘图。结构方程（IBM SPSS Amos 27.0）分析分别对应M处理、B1~B3处理、MB1~MB3处理，并结合纤维素酶活性和木质素酶活性。

2 结果与分析

2.1 BC对FDM发酵液纤维素酶和木质素酶活性的影响

3种纤维素酶和3种木质素酶活性变化如图1所示。各种酶活性随着w（BC）的增加均呈先升后降趋势，且大多数处理在w（BC）为3.0%时出现酶活性峰值，Mnp酶出现活性峰值的w（BC）为2.5%，说明BC对纤维降解菌的产酶活性存在最适用量。w（BC）为3.0%，不同菌株配比处理的酶活性也有较大差异。对于BG和Mnp酶活性，1∶2处理显著高于1∶1和2∶1处理（P<0.05）；Lac酶活性峰值在1∶2和2∶1处理中均较高，二者的差异不具有统计学意义（P>0.05）；对于ED和Lip酶活性，2∶1处理显著高于1∶1和1∶2处理（P<0.05）；EG酶活性峰值为1∶1处理。综上所述，X51菌悬液和Z8-2孢子悬液体积配比1∶2，折合活菌数配比为2.5∶1，w（BC）为3.0%时FDM发酵液的纤维降解酶活性最高。

2.2 BC和FDM对玉米秸秆堆肥温度、pH、EC和GI的影响

温度是判断堆肥进程及腐熟情况的重要指标，对微生物生存和代谢活性起决定作用。试验堆肥温度变化如图2a所示，整体呈先增后降的趋势。CK和M处理分别在第5 天和第4 天进入高温期（≥55 ℃），而不同用量BC和FDM配施的各处理于第3天就进入高温期，且高温期较CK延长2~5 d。

堆肥的pH变化曲线呈先增后降趋势，见图2b。升温期，物料pH上升。随着堆肥时间推移，堆肥pH升高。腐熟期时，单加FDM的M处理pH较CK降低31.11%，添加BC的各处理pH较CK更高；BC和FDM配施的各处理pH较CK降低29.3%~59.6%（P<0.05），较M处理降低41.3%~44.5%（P<0.05），均为MB2处理效果最为显著。

EC可表征物料中的可溶性盐含量，随着堆肥时间推移呈先增后降的趋势，见图2c。单加FDM的M处理EC较CK有所升高，添加BC的各处理EC较CK升高49.1%~99.1%，较M处理有所降低；BC和FDM配施的各处理EC较CK升高21.5%~64.7%（P<0.05），较M处理升高20.4%~22.2%（P<0.05），均为MB2处理效果最为显著。

GI是评价堆肥腐熟度的重要指标。如图2d所示，随着堆肥时间推移GI呈上升趋势。CK、M的GI分别在第25天、第20天达到70%，完全腐熟。只添加BC的B1、B2、B3均在第20天达到腐熟标准，而BC和FDM配施的MB1、MB2、MB3的GI于第15天达到腐熟标准。

综上所述，与CK相比，BC和FDM配施处理的pH降低、EC升高，显著缩短堆肥腐熟进程，其中w（BC）为3.0%的处理效果最佳。

2.3 BC和FDM对玉米秸秆堆肥碳、氮转化的影响

堆肥过程是有机碳含量降低的过程，如图3a所示，堆肥前期，有机碳含量（w）随着堆肥温度升高而快速下降，至后期，w（有机碳）降速减慢。堆肥腐熟时，与CK比较，单加FDM的M处理w（有机碳）升高4.8%；单加BC的各处理增加6.3%~60.9%；较M处理增加1.6%~58.9%。BC和FDM配施处理的w（有机碳）增加36.2%~65.6%，较M处理增加33.0%~63.8%。MB2处理效果最为显著（P<0.05）。

堆肥中全氮含量（w）的变化趋势与有机碳相似，如图3b所示，但是不同处理降幅的差异具有统计学意义（P<0.05）。与CK相比，堆肥腐熟时，与CK比较，单加FDM的M处理增加32.0%，单加BC的各处理增加6.4%~46.2%。BC和FDM配施的MB2、MB3处理的w（全氮）较CK增加91.0%、37.8%，MB2处理的效果最为显著（P<0.05）。

因此，BC和FDM配施处理更有利于堆肥有机碳、全氮的保留，其中w（BC）为3.0%的处理效果最佳。

2.4 BC和FDM对玉米秸秆堆肥CO₂、NH₃排放量的影响

CO₂排放量呈先增后降的趋势，如图4a所示。各处理的CO₂排放量均在堆肥第20天达到峰值。与CK相比，单加FDM的M处理CO₂排放量降低24.3%；单加BC的各处理降低17.7%~34.8%，较M处理降低10.2%~13.9%；BC和FDM配施的各处理CO₂排放量降低61.9%~70.5%，较M处理降低49.6%~61.1%，其中MB2处理效果最为显著（P<0.05）。

NH₃排放量变化趋势与CO₂相似，如图4b所示。单加FDM的M处理NH₃排放量降低8.2%；单加BC的各处理降低14.1%~27.3%，较M处理降低6.4%~20.9%，MB2处理效果最为显著；BC和FDM配施的各处理的NH₃排放量降低43.9%~62.8%，MB1处理效果最为显著，较M处理降低39.0%~59.5%，MB3处理效果最为显著（P<0.05）。

由此可知，BC和FDM配施更有利于堆肥减少CO₂和NH₃的排放，其中w（BC）为3.0%的处理效果整体最佳。

2.5 BC和FDM对玉米秸秆堆肥纤维素、木质素酶活性的影响

堆肥添加BC和FDM，其3种纤维素酶和3种木质素酶活性均有不同的变化，如图5所示。

堆肥进程中，6种酶的活性均随着堆温上升而增加。纤维素酶活性均在第5天至第10天达到峰值。与CK相比，单加FDM、单加BC和两者配施各处理的ED、EG、BG活性均显著增加（P<0.05）。BC与FDM配施各处理ED、EG、BG活性较CK增幅分别为4.3%~95.3%、0.3%~95.0%、402.7%~503.8%，EG、BG活性较M处理分别增加4.6%~189.9%、215.3%~283.9%，其中MB3处理效果最显著，BG活性增幅最大。在ED活性上，MB3处理较M处理增加65.1%。

木质素酶活性大多在堆肥第5天达到峰值，其变化规律与纤维素酶相似。BC与FDM配施各处理的Lip、Lac、Mnp活性较CK增幅分别为21.5%~123.3%、88.1%~88.5%、6.8%~29.3%，较M处理分别增加77.8%~164.1%、83.7%~84.24%、19.45%~104.51%，其中MB3处理增幅最为显著（P<0.05），Lip活性增幅最大。

由此可知，在玉米秸秆堆肥中，木质素酶活性比纤维素酶活性高，BC和FDM配施均能促进纤维降解酶活性的增加，且木质素酶活性的增幅显著高于纤维素酶；对酶活性的促进效果主要与BC添加量有关，w（BC）为3.0%与FDM配施对堆肥酶活性的促进效果最佳。

2.6 添加BC和FDM的玉米秸秆堆肥中酶活性与理化性质的相关性

堆肥物料理化性质与纤维降解酶活性的相关性分析见图6。基于分析结果构建结构方程，评估添加BC、FDM对堆肥纤维素酶、木质素酶活性和理化性质的直接和间接影响，结果见图7。CHI/DF、RMSEA、GFI、IFI、TLI值表明模型拟合度良好。3 种纤维素酶活性之间、3种木质素酶活性之间均呈极显著影响。单加FDM处理的ED、Mnp对TN呈极显著负影响（λ=-0.55，-0.94，P<0.001），Lac对TN呈显著正影响（λ=0.25，P<0.01），EG对TC呈显著负影响（λ=-0.30，P<0.05），Mnp对TC呈极显著负影响（λ=-0.64，P<0.001），EG对EC为显著正影响（λ=0.47，P<0.01），Lac对pH为显著正影响（λ=0.43，P<0.05），ED、EG、Mnp对GI为极显著正影响（λ=0.34，0.55，0.82，P<0.001），Lac对GI为显著影响（λ=-0.29，P<0.01）。单加BC处理的ED对TN为显著负影响（λ=-0.44，P<0.01），Mnp对TN为极显著负影响（λ=-0.65，P<0.001），Lac对TN为显著正影响（λ=0.22，P<0.05），Lip对TC为显著负影响（λ=-0.30，P<0.05），EG对EC为极显著负影响（λ=-0.48，P<0.001），Lac对EC为极显著正影响（λ=0.54，P<0.001），EG对pH为显著正影响（λ=0.41，P<0.05），Lac对pH为极显著正影响（λ=0.48，P<0.001），ED、EG对GI为显著正影响（λ=0.44，0.33，P<0.01），Mnp对GI为极显著正影响（λ=0.59，P<0.001），TC对GI为显著负影响（λ=-0.22，P<0.01），pH对EC为极显著和显著正影响（λ=0.40、0.41，P<0.001、P<0.05）；BC和FDM配施处理中，ED对TC为极显著负影响（λ=-0.33，P<0.001），Mnp对TC为显著负影响（λ=-0.32，P<0.01），Mnp对TN为极显著负影响（λ=-0.66，P<0.001），EG对pH为极显著负影响（λ=-0.48，P<0.001），Lac对pH为显著正影响（λ=0.33，P<0.01），EG、Mnp对GI为显著正影响（λ=0.32、0.22，P<0.01、P<0.05），ED对GI为显著正影响（λ=0.46，P<0.01），Lip对GI为显著正影响（λ=0.28，P<0.05），TC对GI为极显著负影响（λ=-0.41、-0.46，P<0.001），pH对GI为极显著负影响（λ=-0.22，P<0.001）。

3 讨论

3.1 BC添加量对FDM纤维素酶、木质素酶活性的影响

BC纳米孔隙丰富、比表面积大，能提高环境pH和全碳含量，减少氮素损失，同时增强环境的通气性，调节环境的理化性质^[27]。故BC可直接或间接影响微生物的生存及代谢^[28]。不容忽视的是，BC制作过程中形成的多环芳烃物质对微生物具有毒性作用^[29]。因此，有必要确定目标微生物适宜的BC用量。目前，促进植物纤维降解的微生物菌剂和用于环境修复的BC均已被大量应用^[30]。但是，BC在堆肥调控方面的研究起步较晚，其对植物纤维降解菌核心功能酶活性的影响规律还有待深入研究。已知堆肥物料的ED、EG、BG、Lip、Lac和Mnp活性及其动态变化是判断植物纤维素和木质素降解效果的重要指标^[31]。本试验利用纤维降解菌开展研究，发现随着BC添加量增加，各纤维降解酶的活性随之改变，且在添加量为3.0%时酶活性出现峰值，可能是因为适量的BC能为功能菌提供栖息空间，同时改善堆肥物料的通气性，提高堆温、浓缩养分等，间接促进功能菌的生物活性^[32]。本研究采用已知具有纤维素和木质素降解功能的微生物，研究结果为BC促进此类功能菌的酶活性提供了直接证据。

3.2 添加BC和FDM对堆肥理化性状及CO₂、NH₃排放的影响

为加速堆肥的腐熟进程，减少碳氮损失，Awasthi等^[33]在污泥堆肥中添加生物炭，发现堆肥周期缩短3周；王道泽等^[34]、吴晓东等^[35]在鸡粪堆肥中分别接种外源菌剂、添加生物炭发现堆肥周期缩短2~4 d。本研究在玉米秸秆堆肥中同时添加BC和FDM，发现堆肥高温期延长2~5 d，堆肥周期缩短5~10 d。羊粪堆肥添加BC和菌剂，与CK相比，腐熟物料的pH降低，EC显著升高^[11]。本试验获得相似结论，与CK相比，BC和FDM使堆肥pH显著降低，EC显著升高，且pH降低和EC增加的幅度均较大。原因一方面是试验采用的BC烧制温度较低（400 ℃），pH和生物毒性都较低^[36]；另一方面是BC和FDM的配施使物料中的微生物活性增强，促进有机物降解和无机物积累，导致EC增加^[11]。堆肥的pH和EC呈现先增加后降低的趋势，前期，由于堆肥温度升高促进微生物分解秸秆及生物炭的碱性作用使pH上升，且微生物和生物炭吸附离子的释放致EC升高。后期，NH⁴⁺转化、有机酸积累等使pH下降，养分转化等使EC降低^[37]。研究人员利用羊粪、猪粪开展好氧堆肥研究发现，添加BC和FDM分别使NH₃排放量减少38.68%和18.41%，且BC添加9%~12%时保氮效果最佳^[38-39]。本试验得出，与CK相比，同时添加BC和FDM使堆肥的CO₂和NH₃排放量分别降低61.9%~70.5%和43.9%~62.8%，获得较好的CO₂、NH₃减排效果。原因主要是BC具有丰富的孔隙结构、巨大的比表面积，既能改善堆肥通气性和保水性，显著缩短堆肥腐熟时间，其表面的酸性官能团还可吸附NH₄⁺和NH₃，从而有效降低堆肥过程的碳氮损失^[40]。而堆肥前期随着堆体温度和pH的升高，有机质和铵态氮会转化为CO₂和NH₃致使二者的排放量升高^[41]。堆肥后期，NH₃排放量下降，一方面原因是堆体温度及pH的下降，限制了硝化生物的生长，削弱了硝化作用，从而使NH₃的释放减少^[42]。

3.3 BC和FDM对堆肥纤维降解酶活性的影响

堆肥的酶活性变化可反映有机质降解、微生物活性和物料腐熟情况。为了缩短堆肥腐熟期，现代堆肥工艺通常添加纤维素和木质素降解菌，增加堆肥相关酶的活性^[43-44]。研究表明，BC能增加微生物群落多样性、调节关键功能菌和相关酶基因表达，故添加BC可促进堆肥中纤维降解酶活性的提高^[45]。本试验获得相似结论。一方面，本试验所用功能菌具有分泌纤维素、木质素酶的能力，且明确了w（BC）为3.0%时对功能菌的酶活性具有最佳促进作用；另一方面，BC有利于堆肥的酶活性表达，最终表现为BC与FDM配施显著促进了堆肥酶活性提高。本试验还发现，纤维素酶和木质素酶活性整体趋势为先上升后下降。堆肥初期，菌剂中微生物因以秸秆的木质素和纤维素为碳源而大量繁殖，分泌纤维素酶，细菌参与木质素分解，生物炭又改善环境，提供附着位点并保持养分水分，促进酶分泌，活性上升^[46]。后期，秸秆易分解成分被消耗，纤维素与木质素减少限制微生物生长代谢，且温度、湿度、pH等环境条件改变，中间代谢产物与有害物质积累，抑制微生物，酶分泌减少，活性降低^[47]。

堆肥涉及复杂的生化反应，不同反应具有一定的程序性和时空差异性^[48]。通常，纤维素酶中的ED和EG最先表达，催化大分子纤维素降解为可溶性寡聚葡萄糖，再由BG催化将其降解为葡萄糖^[49]。研究表明，木质素酶中的Lac催化范围更广泛，异源表达性强，故最先启动反应发挥其催化活性^[50]。木质素酶来源广泛，在真菌和细菌中均能发现，且稳定性较高，即使在温度变化的堆肥中仍能表达较高的活性，且反应迅速^[51]。本研究获得一致的结果。在棉秆堆肥中，Mnp起主导作用^[52]。本试验中Lac和Mnp共同起主导作用，可能是因为底物成分和微生物功能差异所致。同时发现，与纤维素酶活性相比，堆肥中的木质素酶活性对BC和FDM的添加具有更强烈的反应。可能原因，一方面是堆肥环境适合微生物及其纤维降解酶活性。物料和FDM中的功能菌都来源于当地，而宁夏土壤为碱性和强碱性^[53-54]；另一方面，与组成FDM的功能菌产酶特性有关。解蛋白芽孢杆菌X51菌株为耐高温沼渣降解菌，在高温下仍具有较高的木质素酶活性^[15]；长梗木霉Z8-2具有较好的纤维素降解能力^[17]。二者构建的FDM在培养基中表现较高的酶活性，BC可促进其酶活性增加。堆肥试验中的酶活性变化规律与培养试验相似，进一步验证了BC对目标菌株产酶的促进作用。具体机制还有待进一步研究。

3.4 BC、FDM对提升玉米秸秆堆肥品质的影响

堆肥常被视为一个微生态系统，其中有机质含量、pH、EC等因素都会影响堆肥中微生物的活性^[55-56]。研究表明，BC与菌剂配施可降低堆肥pH，增加EC^[40]。本试验得到相似结论。Lac、Lip有利于EC的升高。EG对EC的影响在各处理中表现不同，在单加FDM和单加BC时，EG分别呈现促进和抑制作用。这可能与BC对游离盐离子具有吸附固定作用有关^[57]。

6种纤维降解酶的作用机制不同。ED作用于微纤维的非结晶区，暴露末端供外切酶使用。EG作用于纤维素链末端，产生纤维二糖，促进纤维素快速转化为葡萄糖。BG将纤维二糖水解成葡萄糖，促进物质转化效率提高^[58]。Lip依靠结构中的亚铁血红素直接与芳香底物反应，或通过氧化低分子量中介体而间接发挥作用，促进物质转化和堆肥腐熟^[59]。Lac利用分子氧作为电子受体氧化多种类型的有机物，促进物质转化^[60]。Mnp将酚类化合物氧化为苯氧基，继而裂解，促使碳氮转化加速^[61]。因此，6 种酶在有机物碳、氮转化和促腐熟效果上具有不同的作用。

本试验中，单加FDM可促进酶活性增加，其中ED和Mnp显著抑制TN增加，即促进氮转化和释放。说明FDM的添加有利于堆肥物料微生物活性和丰度的增加^[62]，促进纤维降解酶活性升高，显著促进氮的转化。单加BC与单加FDM相比，ED和Mnp对TN的负影响降低，Lac有利于保氮，即减少氮的转化，原因可能是BC具有强吸附力，有利于氮的固持^[63]。在堆肥中施用不同添加剂，其共同作用导致堆肥性状发生改变^[64]。本试验发现，FDM与BC配施与单加FDM相比，Mnp对TC的影响减弱。原因是BC通过其表面复杂的有机矿物相互作用，将易分解的含碳化合物封闭在其大分子组合中，从而降低此类化合物的可用性，发挥保碳作用^[65]。

在腐熟度方面，ED、EG和Mnp活性与GI的关系呈典型的叠加效应。生物碳与FDM配施较单加FDM、单加BC相比，Lip对GI表现为显著促进。可能原因是，一方面添加FDM促进堆肥中Lip活性增加；另一方面，BC和FDM可以改变堆肥中原有微生物类群的关系，包括细菌多样性的增加和真菌群落多样性的降低等，导致相关酶活性随之改变，加快腐熟进程^[66]。单加FDM时，Lac对腐熟度呈现显著抑制作用，可能由于Lac不利于氮素转化和释放，堆体有机氮难以被转化为无机氮，不利于GI提高^[67]。而在添加BC的2 组处理中，Lac对GI无显著影响，原因可能是BC对微生物代谢的调控抵消了Lac的部分影响。其具体机制有待进一步研究。

本试验选用2种纤维降解菌和BC开展玉米秸秆堆肥研究，聚焦于堆肥理化性质和酶活性的变化规律及其相关性。未来可以利用分子技术深度解析功能菌和BC对堆肥微生物群落多样性的影响机制。

4 结论

1）添加w（BC）为3.0%时能显著促进FDM（X51/Z8-2活菌数比为2.5∶1）酶活性增加。

2）与CK相比，BC和FDM配施能促进玉米秸秆堆肥升温，延长高温期2~5 d，提前10 d腐熟，w（有机碳）、w（全氮）分别增加36.2%~65.6%%和37.8%~91.0%，CO₂和NH₃的排放量分别降低61.9%~70.5%和43.9%~62.8%，减少了碳氮损失及CO₂、NH₃的排放，提高了堆肥品质，其中w（生物炭）为3%时效果最佳。

3）BC和FDM配施通过增加纤维降解酶活性，促进堆肥碳氮转化，减少碳氮损失及CO₂、NH₃的排放，有利于堆肥品质提高。在6 种纤维降解酶中，ED和Mnp在碳氮转化上发挥主要作用，Lac具有一定保氮作用。BC和FDM配施对堆肥的影响具有叠加作用。

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基金资助

宁夏回族自治区重点研发计划项目(2018BBF02004)

宁夏回族自治区重点研发计划项目(2019BFF02002)