典型兽用抗生素在奶牛粪便堆肥过程中的消减规律研究

Study on the Reduction Patterns of Typical Veterinary Antibiotics During the Composting Process of Cow Feces

摘要

为了研究典型兽用抗生素在粪便堆肥过程中的消减规律及最终残留量，评价其生态风险，以奶牛粪便及典型兽用抗生素（四环素类、β-内酰胺类、喹诺酮类、磺胺类）为试验材料，通过高温堆肥发酵，分别在发酵起始、升温期、高温期、降温期、陈化期、发酵结束6 个阶段采集堆肥样品，分析不同发酵阶段几种典型抗生素的消减规律、养分含量及酶活性变化，明确抗生素的消减规律及残留量。结果表明：①在堆肥升温期抗生素总量呈现直线下降的趋势，堆肥高温期结束时抗生素总量消减72.7%，发酵降温期至陈化期，抗生素消减速度减缓，直至发酵结束抗生素总量去除率为96.3%。其中四环素类抗生素去除率在95%以上；β-内酰胺类和喹诺酮类抗生素去除率接近100%；磺胺类抗生素中，磺胺嘧啶去除率为100%，磺胺间甲氧嘧啶去除率为96.2%。②至发酵结束总养分质量比保持在40 g/kg，有机质质量分数随着堆肥发酵进程推移逐渐降低至33.24%，全盐质量比逐渐增加至43.8 g/kg。③过氧化物酶活性与脲酶活性随着堆肥进程推移逐渐分别增加至4.49 mg/（g·2 h）和3.47 mg/（g·24 h），蛋白酶在堆肥高温期活性最高，最大值为20.8 mg/（g·24 h）。

Abstract

In order to investigate the reduction patterns and final residues of typical veterinary antibiotics during the composting process of cow feces， and to evaluate their ecological risks， cow feces and typical veterinary antibiotics （tetracyclines， β-Lactams， quinolones， and sulfonamides） were used as experimental materials. Through high-temperature composting fermentation， samples were collected at six stages： starting fermentation， heating period， high-temperature period， cooling period， maturation period， and fermentation end. The reduction patterns of various typical antibiotics， nutrient content， and enzyme activity changes at different fermentation stages were analyzed to clarify the reduction patterns and residual levels of antibiotics. The results showed that： ① the total amount of antibiotics showed a linear decreasing trend during the heating period with a reduction of 72.7% by the end of the high-temperature period. During the cooling period to the maturation period， the reduction rate of antibiotics slowed down， and by the end of fermentation， the total removal rate reached 96.3%. Among them， the removal rate of tetracycline antibiotics was over 95%， while β-lactams and quinolones approached 100%. In sulfonamides， the removal rate was 100%， and the removal rate of sulfamethoxazole was 96.2%. ② By the end of fermentation， the total nutrients remained at 40 g/kg， the mass fraction of organic matter gradually decreased to 33.24% as the composting process progressed， and the total salt mass ratio gradually increased to 43.8 g/kg. ③ The activities of oxidase and urease gradually increased to 4.49 mg/（g·2 h） and 3.47 mg/（g·24 h） during the composting process， respectively； while protease exhibited the highest activity during the high-temperature period of composting， with a maximum value of 20.8 mg/（g·24 h）.

Graphical abstract

关键词

兽用抗生素 / 奶牛粪便 / 堆肥过程 / 消减规律 / 生态风险

Key words

veterinary antibiotics / cow feces / composting process / reduction law / ecological risk

兽用抗生素能够明显促进动物生长^[1]，预防动物疾病发生。随着集约化畜牧业的快速扩展及复配饲料工业的不断发展，抗生素作为饲料的重要添加剂在全球范围内被广泛应用。2020年我国使用的兽用抗生素总量为32 776.298 t^[2]，虽然我国抗生素的使用量正在逐步下降，但在全球抗生素使用量的占比仍然较高，预计到2030年我国的兽用抗生素使用量将占全球兽用抗生素使用量的43%^[3]。使用量排名前3位的抗生素分别为四环素类、磺胺类、β-内酰胺类，占比分别为30.52%、13.08%、12.55%。这些兽用抗生素并不能完全被动物体所吸收，其中30%~90%会以原药或者代谢产物的形式随畜禽粪尿排出体外，导致多种抗生素在畜禽粪污中残留^[4-6]。残留抗生素能够通过各种途径进入土壤和水体环境中，不但对土壤中土著微生物的活性造成影响，破坏生态平衡，还会引起抗性菌和抗性基因的产生及传播，给人类身体健康和生态系统安全带来巨大的负面效应。因此，充分、有效消减畜禽粪污中的兽药抗生素十分重要且迫切。

从源头上切断畜禽粪便中的抗生素进入环境意义重大。2021年10月，中华人民共和国农业农村部发布《全国兽用抗菌药使用减量化行动方案（2021—2025年）》，其中以生猪、蛋鸡、肉鸡、肉鸭、奶牛、肉牛、肉羊等畜禽品种为重点，稳步推进兽用抗菌药使用减量化行动，并规定到2025年末，50%以上的规模养殖场实施养殖减抗行动。虽然国家对畜禽养殖过程中减抗、禁抗、替抗的呼声日渐高涨，但在实际生产中抗生素减量化需要循序渐进，减抗也并不意味着完全放弃使用抗生素，兽用抗生素带来的潜在风险依然存在。高温好氧堆肥作为一种主要的畜禽粪便处理方式在国内外被广泛使用，通过高温好氧发酵后完全腐熟的堆肥能够使粪便得到无害化资源化利用，发酵条件合适时可以显著地减少抗生素在粪便中残留的浓度^[7]。赵彬涵等^[8]研究发现，堆体含水量、温度、抗生素种类和浓度、微生物等与堆肥过程中抗生素的降解率密切相关。Backhaus等^[9]研究发现，混合抗生素的生态风险远高于单一抗生素。刘鹏霄等^[10]研究也发现多种抗生素常以复合共存的形式出现，其危害远大于单一抗生素。但是，目前针对抗生素污染风险的评估和抗生素降解菌的筛选多在单一种类抗生素下进行，而畜禽养殖过程中使用的抗生素种类多，且典型抗生素在堆肥过程中的消减规律尚不明确。因此，研究典型兽用抗生素在畜禽粪便堆肥过程中的消减规律，摸清各类抗生素的残留种类和浓度，对生态风险评价及安全生产养殖具有重大意义。

本试验在实地取样化验检测以及对前期大量堆肥发酵试验获取的最佳发酵参数进行总结的基础上，将奶牛粪便与葡萄枝条粉混合发酵，研究典型兽用抗生素在高温好氧堆肥发酵过程中的消减规律及最终残留量，以期为畜禽养殖业及有机肥加工业对兽用抗生素的使用及污染防控提供有效参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试牛粪及辅料

试验所用的奶牛粪采购自银川市某大型奶牛养殖场，葡萄枝条选用某酒庄秋剪葡萄枝条，经晾晒粉碎后水分为15%左右，细度为6 mm左右。原料基本养分及抗生素质量比见表1、表2。

1.1.2 供试抗生素

四环素类（土霉素、四环素、多西环素）、β-内酰胺类（青霉素、阿莫西林、头孢噻呋）、喹诺酮类（环丙沙星、恩诺沙星）、磺胺类（磺胺嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶）抗生素购自银川市西北农资城兽药专卖店，均为100%纯剂。

1.2 试验设计

堆肥试验于2022年6月1日—7月10日在宁夏青铜峡市宁夏顺宝现代农业股份有限公司进行，以奶牛粪为主料，以葡萄枝条粉为辅料，使用稀硫酸调节堆体pH，使堆体w_C与w_N起始比例为30、pH为7.1、水分为65%，添加有机物料腐熟剂0.1%，将自购兽用抗生素与原料充分混合后装入1 m×1 m×1.2 m自主研发的封闭式强制曝气堆肥发酵仓，进行3次重复。堆体起始各类抗生素质量比见表3。

1.3 试验方法

1.3.1 采样时间与方法

分别在堆肥发酵不同阶段（发酵前、升温期、高温期、降温期、陈化期、发酵结束）采样，监测关键阶段堆肥粪便中典型抗生素种类构成及质量比。

整个发酵过程中，根据温度、湿度检测数据调整通气量和通气时间间隔。分别于每天08：00、17：00用温度计现场测量各处理的温度和外界环境的温度。测量堆体内部温度时，用温度计测量堆体上、中、下层温度，统计时取3点平均数。每隔3 d对堆肥进行采样，采样方式为多点混合法，即在堆体的上、中、下层3处分别取等量发酵样品，混合均匀，每份样品1 kg左右，装入自封袋中，立即冷冻保存备用。

1.3.2 检测指标与方法

1）典型抗生素的测定。四环素类、β-内酰胺类、喹诺酮类、磺胺类抗生素采用高效液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS/MS）测定。通过固相小柱进行萃取，称取1.0 g样品，利用EDTA-McIlvaine缓冲液浸提，然后用草酸甲醇溶液洗脱净化，经氮气吹干后定容，随即采用液相色谱-串联质谱法测定。

2）基本理化指标的测定。温度：采用温度计测定；全氮（TN）：采用全自动凯氏定氮仪测定；全磷（TP）：采用H₂SO₄-H₂O₂消煮，钼锑抗比色法测定；全钾（TK）：采用火焰光度法测定；有机质（OM）：采用重铬酸钾容量法测定；全盐：新鲜的堆肥样品和去离子水以1∶10（m∶v）的比例混合，在25 ℃、150 r/min条件下振动2 h，取振动液在4 000 r/min离心机中离心15 min，得到上清液，用电导率仪测定电导率（EC）。

3）酶活性的测定。纤维素酶活性：采用硝基水杨酸比色法测定；脲酶活性：采用靛酚蓝比色法测定；蛋白酶活性：采用改良茚三酮比色法测定；过氧化物酶活性（Per）：采用邻-苯三酚比色法测定。

1.4 数据处理

数据经Excel整理后利用SPSS 25.0进行方差分析、主成分分析。

2 结果与分析

2.1 堆肥过程中堆体温度的变化

堆肥发酵过程中堆体温度随时间推移的变化情况如图1所示。堆体温度在发酵第2天迅速达到64.5 ℃，并且维持50 ℃以上超过20 d，这可以灭杀物料中所含病原菌，达到堆肥卫生学指标和腐熟的标准。在发酵25 d时堆体温度逐渐降低并趋于室外温度，待发酵33 d时，堆体开始处于后熟期并趋于发酵结束。

2.2 堆肥过程中四环素类抗生素的消减规律

堆肥发酵过程中四环素类抗生素的消减规律见图2。分别采集堆肥发酵不同阶段的样品，测定样品中土霉素、四环素、多西环素质量比。由图2可知，3种抗生素质量比均随着堆肥发酵时间的推移呈现明显下降趋势，尤其是在堆体高温期各种抗生素质量比急速降低，随着发酵进程的推移，至发酵结束土霉素、四环素、多西环素的去除率分别为97.97%，95.38%、97.26%，3种抗生素的总质量比仅为0.15 mg/kg。

2.3 堆肥过程中β-内酰胺类抗生素的消减规律

β-内酰胺类抗生素质量比随着堆肥进程推移的变化规律见图3。3种抗生素质量比随着堆肥时间的推移均呈现直线下降的趋势，待发酵33 d，即发酵结束时头孢噻呋残留量为6.2 μg/kg，未检测出青霉素、阿莫西林。

2.4 堆肥过程中喹诺酮类抗生素的消减规律

兽用喹诺酮类抗生素主要以恩诺沙星和环丙沙星为主，这2种抗生素在堆肥过程中的变化规律见图4。恩诺沙星和环丙沙星质量比均在堆肥高温期时快速降低，在堆肥发酵至12 d时，恩诺沙星消减85.2%，环丙沙星消减74.3%。在堆肥降温期2种抗生素质量比下降得较为缓慢，在发酵结束时恩诺沙星、环丙沙星的去除率分别为99.7%、99.6%。

2.5 堆肥过程中磺胺类抗生素的消减规律

兽用磺胺类抗生素主要以磺胺嘧啶和磺胺间甲氧嘧啶为主，这2 种抗生素在堆肥过程中的消减规律如图5所示，同样也是在发酵升温期至发酵高温期迅速消减，并随着发酵时间推移质量比逐渐降低，待堆肥发酵结束时磺胺嘧啶和磺胺间甲氧嘧啶的去除率分别为100%和96.2%。

2.6 堆肥过程中典型抗生素总量的消减规律

典型兽用抗生素总量随着堆肥进程推移的变化规律如图6所示。随着堆肥升温期温度的急速上升，抗生素总量呈现直线下降的趋势，在堆肥发酵12 d时，抗生素总量消减72.7%，说明堆肥高温期是抗生素消减的最佳阶段。到发酵降温期至陈化期，抗生素消减速度减缓，直至发酵结束抗生素总量去除率为96.3%。

2.7 堆肥过程中堆体养分及酶活性的变化

2.7.1 堆肥过程中堆体养分的变化

不同发酵阶段堆肥氮、磷、钾养分质量比波动变化，如图7所示。在堆肥升温期全氮质量比迅速降低，主要是因为在好氧堆肥初期，微生物快速降解矿化物料中的有机氮，其中一部分转化为氨气直接挥发。随着时间推移，物料中的有机物分解矿化，水分蒸发，物料发生浓缩效应，堆体体积随之减小，因此在堆肥发酵结束时全氮、全磷、全钾质量比因堆体被浓缩而增加，至发酵结束总养分质量比保持在40 g/kg，总氮质量比降低10.6%。堆肥发酵过程中有机质质量分数和全盐质量比的变化规律见图8。随着堆体不断腐殖化，有机质质量分数逐渐下降，堆肥结束时有机质质量分数为33.24 %。全盐质量比随着堆肥进程的推移逐渐增加，至发酵降温期基本维持稳定，在发酵结束时全盐质量比增长至43.8 g/kg。

2.7.2 堆肥过程中酶活性的变化

堆肥过程中酶活性的变化规律如图9所示。堆体过氧化物酶活性与脲酶活性随着堆肥进程的推移逐渐增加，待堆肥发酵结束时，过氧化物酶和脲酶活性分别增加至4.49 mg/（g·2 h）和3.47 mg/（g·24 h）。纤维素酶活性在堆肥升温期和高温阶段活性较强，随着堆肥进程的推移，纤维素酶活性逐渐下降，与堆体有机质质量比的变化趋势一致。整个堆体发酵过程中蛋白酶始终处于比较活跃的状态，其活性呈现先升高后降低的趋势，在堆肥高温期酶活性最高，最大值为20.8 mg/（g·24 h），蛋白酶活性的变化规律和堆体温度的变化规律一致。

3 讨论

黄红卫等^[11]从2个奶牛养殖场取样研究发现，宁夏规模养殖场畜禽粪便干物质中含有多种抗生素，其中奶牛粪渣中四环素类抗生素残留量较高，土霉素、四环素及金霉素质量比分别为0.098、0.068、0.086 mg/kg。本试验分别从5个不同规模的奶牛养殖场取样检测，奶牛粪渣中土霉素、四环素、金霉素质量比分别为0.185、0.064、0.076 mg/kg，研究结果与黄红卫等的相近，说明不同规模奶牛养殖场的粪便中稳定存在大量不被动物吸收利用的抗生素。好氧堆肥能够稳定堆肥营养物质，减少畜禽粪便中的病原微生物和臭气，同时也是畜禽养殖废弃物资源化肥料化再利用的一种有效方法，在某些特定条件下能够显著降低兽用抗生素在粪便中的浓度^[7]。此外，不同类型兽用抗生素由于其分子结构和理化性质不同，在堆肥底物上的吸附性和对底物中微生物的抑制性等存在差异，而抗生素在好氧堆肥过程中的消减主要是靠生物降解而起到降低作用^[11]，因此不同类型抗生素在堆肥过程中降解的程度不同。大量研究发现，好氧堆肥对四环素类抗生素的去除率可达40.9%~100%，对磺胺类抗生素的去除率可达0.1%~100%，而对喹诺酮类抗生素的去除率仅为45.3%~76.1%^[12-13]。本试验表明，在堆肥发酵结束后土霉素、四环素、多西环素的去除率分别为97.97%、95.38%、97.26%；头孢噻呋的去除率为99.2%、青霉素、阿莫西林的去除率均为100%，恩诺沙星、环丙沙星的去除率分别为99.7%、99.6%，磺胺嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶的去除率分别为100%、96.2%，这和前人的研究结果相近^[12-13]。Feng等^[14]研究了高温（52 ℃）和低温（15 ℃）条件下红霉素在猪粪厌氧堆肥中的去除情况，结果表明温度升高可有效缩短红霉素的半衰期，降低红霉素的残留量，这与本试验结果相符，在堆肥高温期各类抗生素的消减速度较快，随着堆肥进程的推移，抗生素的消减速度逐渐下降；但是，在堆肥发酵结束时，不同类型抗生素的残留量不同，这可能是由于堆肥发酵技术的操作过程不完全一致导致的。今后要进一步研究多种抗生素残留的风险及其转化物的生态风险。

进行畜禽粪便好氧堆肥无害化处理的同时，要尽量降低有效养分的损失，提高堆肥质量。在堆肥过程中，全氮含量因NH₄⁺-N在高温条件下转化为NH₃而降低^[15-16]。本试验表明发酵前期即高温期总氮质量比急速下降，主要是因为好氧堆肥初期，微生物快速降解矿化物料中的有机氮，其中一部分转化为NH₃直接挥发，这与前人^[15-16]的研究结果相符。刘超等^[17]研究表明，在高温堆肥结束时，全磷、全钾含量比堆肥初始有所增加，原因是堆肥过程中磷素和钾素不会挥发损失，而堆体的总干物质下降。本试验表明，在堆肥发酵结束时全磷、全钾质量比因堆体浓缩而增加，这与刘超等^[17]的研究结果一致。堆肥过程是在各种酶的参与下进行的系列生物化学变化^[18-19]，在堆肥过程中酶活性的变化反映了堆肥过程的生物化学过程。多种氧化还原酶（过氧化物酶）和水解酶（脲酶、纤维素酶、蛋白酶）都与碳、氮、磷等物质的代谢密切相关，有关酶的活性变化趋势可以反映堆肥的演替过程^[20]。在堆肥复杂系统中过氧化物酶和脲酶的活性增加意味着堆肥的稳定性提高，这也是堆肥腐熟度的评价指标。本试验表明，随着堆肥进程推移，过氧化物酶和脲酶活性逐渐升高，直至堆肥发酵结束过氧化物酶和脲酶活性趋于稳定，说明发酵基本结束，这与谭小琴等^[20]关于堆肥过程脲酶活性变化趋势的研究结果相符。纤维素酶活性的变化可以反映堆肥过程中碳素物质的降解情况，在发酵高温期微生物比较活跃，能够将大量纤维素分解，随着堆肥进程推移，纤维素含量逐渐降低，微生物活性随之降低。堆肥过程中，微生物利用蛋白酶可将堆体中的蛋白质转化为氨基酸^[21]，在堆肥前期堆体中含氮有机物较多，蛋白酶活性较高，待发酵后期随着堆体含氮有机物被分解，酶活性也相应降低，这与姜继韶等^[22]的研究结果相符。

4 结论

1）典型兽用抗生素总量在堆肥升温期呈直线下降的趋势，在堆肥发酵12 d时，抗生素总量消减72.7%。到发酵降温期至陈化期，抗生素消减速度减缓，直至发酵结束抗生素总量去除率为96.3%。其中未检测出青霉素、阿莫西林和磺胺嘧啶。

2）堆肥过程总氮质量比降低10.6%，总养分质量比因堆肥浓缩而增加，至发酵结束总养分保持在40 g/kg，全盐质量比增至43.8 g/kg，有机质质量分数在发酵结束时降至33.24%。

3）堆肥过程中堆体过氧化物酶活性与脲酶活性随着堆肥进程推移逐渐增加，待堆肥发酵结束时，过氧化物酶和脲酶活性分别增加至4.49 mg/（g·2 h）和3.47 mg/（g·24 h）。

参考文献

[1] OGLE M.In Meat We Trust：An Unexpected History of Carnivore America[M]. Boston： Houghton Mifflin Harcourt，2013.

[2] 2020年中国兽用抗菌药使用情况报告[N].中国畜牧兽医报，2021-11-14（003）．

[3] TISEO K， HUBER L， GILBERT M，et al.Global trends in antimicrobial use in food animals from 2017 to 2030[J].Antibiotics，2020，9（12）：918.

[4] LI X W， XIE Y F， WANG J F， et al. Influence of planting patterns on fluoroquinolone residues in the soil of an intensive vegetable cultivation area in northern China[J].Science of the Total Environment，2013，458：63-69.

[5] HALLER M Y， MÜLLER S R， MCARDELL C S， et al. Quantification of veterinary antibiotics （sulfonamides and trimethoprim） in animal manure by liquid chromatography-mass spectrometry[J].Journal of Chromatography A，2002，952（1/2）：111-120.

[6] HALLING-SØRENSEN B.Inhibition of aerobic growth and nitrification of bacteria in sewage sludge by antibacterial agents[J].Archives of Environmental Contamination and Toxicology，2001，40（4）：451-460.

[7] 成登苗，李兆君，张雪莲，等.畜禽粪便中兽用抗生素削减方法的研究进展[J].中国农业科学，2018，51（17）：3335-3352.

[8] 赵彬涵，孙宪昀，黄俊，等.微生物在有机固废堆肥中的作用与应用[J].微生物学通报，2021，48（1）：223-240.

[9] BACKHAUS T， KARLSSON M.Screening level mixture risk assessment of pharmaceuticals in STP effluents[J].Water Research，2014，49：157-165.

[10] 刘鹏霄，王旭，冯玲.自然水环境中抗生素的污染现状、来源及危害研究进展[J].环境工程，2020，38（5）：36-42.

[11] 黄红卫，吴彦虎，李晓梅，等.宁夏规模养殖场畜禽粪便养分含量和重金属、抗生素残留量测定及安全性评估[J].农业科学研究，2018，39（2）：1-8.

[12] TONG Z Y， LIU F W， TIAN Y， et al. Effect of biochar on antibiotics and antibiotic resistance genes variations during co-composting of pig manure and corn straw[J].Frontiers in Bioengineering and Biotechnology，2022，10：960476.

[13] CUI P， CHEN Z， ZHAO Q， et al. Hyperthermophilic composting significantly decreases N₂O emissions by regulating N₂O-related functional genes[J].Bioresource Technology，2019，272：433-441.

[14] FENG L， CASAS M E， OTTOSEN L D M，et al.Removal of antibiotics during the anaerobic digestion of pig manure[J].Science of the Total Environment，2017，603：219-225.

[15] 李帆，钱坤，武际，等.过磷酸钙用量对猪粪堆肥过程及磷形态变化的影响[J].植物营养与肥料学报，2017，23（4）：1037-1044.

[16] 胡雨彤，时连辉，刘登民，等.添加硫酸对牛粪堆肥过程及其养分变化的影响[J].植物营养与肥料学报，2014，20（3）：718-725.

[17] 刘超，王若斐，操一凡，等.不同碳氮比下牛粪高温堆肥腐熟进程研究[J].土壤通报，2017，48（3）：662-668.

[18] 时红蕾，王晓昌，李倩.四环素对人粪便好氧堆肥过程中酶活性及腐熟的影响[J].环境化学，2018，37（2）：209-215.

[19] 朴哲，崔宗均，苏宝林.高温堆肥的生物化学变化特征及植物抑制物质的降解规律[J].农业环境保护，2001，20（4）：206-209.

[20] 谭小琴，邓良伟，伍钧，等.猪场废水堆肥化处理过程中微生物及酶活性的变化[J].农业环境科学学报，2006，25（1）：244-248.

[21] 李淑娴，姚玉峰.细菌体内的蛋白质降解[J].微生物学报，2015，55（5）：521-528.

[22] 姜继韶，雷建森，王洋，等.双氰胺对污泥堆肥过程中酶活性和细菌群落演变的影响[J].环境科学学报，2021，41（4）：1478-1486.

基金资助

宁夏自然科学基金项目(2022AAC03450)

宁夏农业科技自主创新专项(NKYJ-22-02)

宁夏重点研发计划项目(2022BEG02004)