宁夏部分地区葡萄霜霉菌群体遗传多样性

摘要

为明确宁夏部分地区葡萄霜霉菌群体的遗传变异规律，对采自宁夏部分葡萄产区的80株葡萄霜霉菌菌株进行DNA提取，采用12对SSR引物进行遗传多样性研究。结果表明：12对SSR引物共检测出54个等位基因，各引物之间杂合度存在差异，等位基因多样性丰富，且具有多态性。将80株葡萄霜霉菌菌株进行聚类分析，可分为3个类群；根据PCoA主坐标结果，可明确黄羊滩HYT群体、玉泉营YQY群体和白寺滩BST群体之间遗传距离小，亲缘关系近，平吉堡PJP群体和红寺堡HSP群体有部分重合，遗传距离较小，具有较近的亲缘关系，原州区YZQ群体与其他5个群体亲缘关系较远。根据遗传群体结构分析，将80株葡萄霜霉菌菌株分为5个亚群，每个亚群之间都存在一定的基因交流，但又有明显的分化，其中第5亚群遗传组分复杂，与其他亚群都有基因渗透。这表明宁夏部分地区葡萄霜霉菌群体出现了一定的遗传分化现象。

Graphical abstract

关键词

葡萄霜霉菌群体 / SSR引物 / 遗传多样性 / 宁夏

葡萄霜霉菌（Plasmopara viticola）是葡萄上的主要病害，病情严重时可造成葡萄大量减产。葡萄霜霉菌喜多雨潮湿环境，有时可造成大量侵染。宁夏葡萄产区在每年7月中下旬至8月下旬高发葡萄霜霉病，且连续多年有不同程度的葡萄霜霉菌侵染^[1]。早在2015年有学者研究我国不同地区葡萄霜霉菌群体的遗传分化现象，明确了不同地区葡萄霜霉菌种群存在多样性^[2]。遗传多样性是重要的生物资源，任何物种都有其独特的基因信息库和遗传形式。遗传多样性的研究方法^[3]主要有形态学标记（morphological markers）、细胞学标记（cytological markers）、生化标记（biochemical markers）和分子标记等，其中分子标记又分为限制性片段长度多态性（RFLP）、随机扩增多态性DNA（RAPD）、扩增片段长度多态性（AFLP）和微卫星标记（又称简单重复序列，SSR）。如今分子生物技术不断发展，分子标记方法大多用来研究病原菌群体的遗传多样性。目前，关于宁夏地区葡萄霜霉菌的报道多为防治抗病研究，对葡萄霜霉菌群体遗传多样性的相关报道较少，尚不明确葡萄霜霉菌各群体间的遗传结构和亲缘关系。因此，本试验利用SSR分子标记技术对宁夏平吉堡、黄羊滩、玉泉营、红寺堡、白寺滩、原州区等地区的葡萄霜霉菌群体进行遗传多样性研究，分析宁夏部分地区葡萄霜霉菌群体的遗传结构，从而明确宁夏部分地区葡萄霜霉病的发生流行情况，揭示群体间遗传分化情况，推测宁夏部分地区葡萄霜霉菌群体的发展趋势，为葡萄霜霉病的预测和田间防控提供重要依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料与仪器

1.1.1 供试植物材料

试验材料为采集自西夏区平吉堡中科院试验地（38°40´N、106°03´E）、永宁黄羊滩农场（38°26´N、106°01´E）、永宁玉泉营农场（38°26´N、106°02´E）、吴忠红寺堡汇达酒庄（37°43´N、106°06´E）、吴忠白寺滩龙二基地（37°98´N、106°21´E）、固原原州区葡萄园（36°00´N、106°29´E）的葡萄霜霉菌病叶，寄主葡萄品种均为红地球。每个地区采集45片病叶为1株菌株，西夏区平吉堡4株，永宁黄羊滩11株，永宁玉泉营37株，吴忠红寺堡10株，吴忠白寺滩17株，固原原州区1株，共80株菌株。采集后保存在4 ℃冰箱备用。

1.1.2 接种材料

病原菌的纯化选用宁夏大学科技园试验地的新鲜、无杂菌污染、健康的葡萄品种赤霞珠嫩叶。

1.1.3 试剂及仪器

主要仪器：超低温保存箱（青岛海尔生物医疗股份有限公司）、电热恒温鼓风干燥箱（上海跃进医疗器械有限公司）、Eppendorf Mastercycler Gradient 梯度PCR仪（西安昊兴生物科技有限公司）、DYY-6D型电泳仪（北京六一生物科技有限公司）。

试剂与耗材：真菌基因组DNA快速抽提试剂盒（B518229）、100~2 000 bp DNA Marker、琼脂糖等试剂、耗材均购自生工生物工程（上海）股份有限公司。2X M5 HiPer plus Taq HiFi PCR mix（without dye）、无酶0.2 mL透明PCR无裙边96孔板等购自杨凌轩瑞生物科技有限公司，β-巯基还原剂（Biotoppd）购自银川昕泰昌盛生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株纯化

葡萄霜霉菌的纯化方法参考石洁^[4]的方法。

将田间采集的新鲜、无杂菌污染、健康的赤霞珠嫩叶先用次氯酸钠（φ=1%）消毒30 s，后用无菌水冲洗2~3次。在超净工作台内，用打孔器（直径15 mm）将采集的叶片打成叶盘，叶面向下贴放于水琼脂培养基上，在叶盘中心位置滴15 μL无菌水，挑取不同地区来源的病原菌单孢囊梗接种。每个培养皿接种15个叶盘，1株菌株接种2个培养皿，共接种160个培养皿。接种后，将其放于培养箱内（21 ℃，24 h 黑暗），24 h后取出，用灭菌滤纸条吸去多余菌液后用封口膜封口，继续培养（21 ℃，16 h光照/8 h黑暗）至其长出新鲜霉层即为分离的葡萄霜霉菌单孢囊梗纯培养物。接种后能够重新长出新鲜霉层，即可判断葡萄霜霉菌具有活力。

1.2.2 DNA的提取

利用1.2.1的方法得到纯培养的新鲜霉层，用排笔将新鲜霉层刷至2 mL离心管中，放置于-80 ℃冰箱保存24 h后放入烘箱进行干燥处理。干燥后的菌丝体混合适量的石英砂，加入液氮，研磨成粉末，将研磨好的菌丝利用真菌基因组DNA快速抽提试剂盒提取菌株DNA，提取方法参照试剂盒说明书。提取出的80个菌株DNA样本在-20 ℃下保存备用。

1.2.3 SSR分子标记方法

参考Delmotte等^[5]、Rouxel等^[6]、Gobbin等^[7]的方法，初选23对SSR引物进行毛细管电泳检测。筛选出的引物由北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成，用5′HEX、5′ROX、5′6-FAM、5′TAMRA 4种荧光进行标记。以提取的80个菌株DNA作为模板，使用12对SSR引物进行PCR反应。

PCR反应体系与扩增程序参考王境杨等^[8]的方法。PCR反应采用20 µL体系：2×Taq mix 10 µL，ddH₂O 8 µL，DNA模板1 µL，上下游引物各0.5 µL。

PCR反应扩增程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循环35次；72 ℃再延伸10 min；最后在4 ℃下保存。

扩增反应结束后将扩增产物进行1.5 %琼脂糖凝胶电泳检测，检测合格后送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行毛细管电泳检测。

1.2.4 数据统计与分析

运用GenAlEx 6.502软件计算12对SSR引物的5个遗传多样性参数^[9]，分别为等位基因数（Na）、有效等位基因数（Ne）、Shannon’s信息指数（I）、观测杂合度（Ho）、期望杂合度（He），随后进行主坐标分析（PCoA），进一步分析各菌株群体间的亲缘关系。

运用PowerMarker 3.25软件计算各引物标记位点的多态性信息含量（PIC），基于非加权组平均法（UPGMA）进行遗传聚类分析，通过MEGA软件生成聚类分析图。

运用Structure 2.3.4按每个独立个体的遗传背景进行群体结构划分，选择混合祖先模型^[10]。将缺失数据标记为-9，并设定“length of burnin period”为10 000，使用马尔科夫蒙特卡洛（MCMC）法进行100 000次迭代，设定K值（亚群数）范围为2~8，每个K值重复运行10次，其他参数为默认选项，并在Structure Harvester网站上查看结果，得出最大自然值K。

2 结果与分析

2.1 引物筛选

初选23对引物进行毛细管电泳检测，筛选引物标准为条带清晰、单一，并且各引物条带之间有差异。随后用筛选出的12对SSR引物（表1）随机选取1个菌株DNA进行琼脂糖凝胶电泳检测，如图1所示，12对引物条带清晰、单一，且引物条带均有差异，最终可确定这12对SSR引物适用于宁夏部分地区葡萄霜霉菌遗传多样性的研究。

2.2 引物多态性

运用PowerMarker 3.25软件计算12对引物各标记位点的基因多样性、杂合性以及多态信息量（PIC），PIC取决于标记位点的等位基因数和频率分布。

如表2所示，12对引物标记位点基因多样性范围为0.410 1~0.802 3，杂合性范围为0.012 5~0.925 0，PIC范围为0.368 3~0.773 8。其中Pv16的基因多样性最低，Pv139的基因多样性最高；Pv145和ISA的杂合性最低，Pv61的杂合性最高；Pv139的PIC最高且等位基因较大，多态性较丰富，Pv145的PIC最低，等位基因较小，多态性单一。综上所述，Pv139的基因多样性和多态性较为丰富，Pv145的杂合性和多态性较为单一。

如表3所示，12对SSR引物在80个菌株DNA中共检测出54个等位基因，引物等位基因数范围为2~8，等位基因平均数为4.5，位点多样性最丰富的是Pv88（Na=8），位点多样性最单一的是Pv145（Na=2）。引物观测杂合度（Ho）范围为0.013~0.937，期望杂合度（He）范围为0.380~0.793。由此可知，各引物之间杂合度存在差异，等位基因多样性比较丰富，且具有多态性。

2.3 贺兰山东麓葡萄霜霉菌群体的遗传聚类分析

运用PowerMarker 3.25软件计算12对引物各标记位点的PIC，基于UPGMA进行聚类分析，通过MEGA生成聚类分析图（图2）。如图2和表4所示，将80株葡萄霜霉菌菌株分为3个类群，第Ⅰ类群由8株HYT菌株、17株YQY菌株、3株HSP菌株、12株BST菌株组成；第Ⅱ类群由4株PJP菌株、3株HYT菌株、20株YQY菌株、7株HSP菌株、5株BST菌株组成；第Ⅲ类群为1株YZQ菌株。

运用GenAlEx 6.502软件进行主坐标分析，如图3所示，前2个坐标轴能够解释52.97%的遗传变异。HYT群体、YQY群体与BST群体具有较高的混合度，表明这3个群体之间遗传距离小，菌源交流频繁，具有较近的亲缘关系；PJP群体和HSP群体有部分重合，说明这2 个群体之间遗传距离较小，具有亲缘关系；YZQ群体与其他5个群体几乎没有重合，亲缘关系较远。

2.4 贺兰山东麓葡萄霜霉菌群体的遗传分化与遗传结构

运用Structure 2.3.4进行群体结构划分，如图4、图5所示，K=5时获得最大∆K值，表明80株葡萄霜霉菌菌株被划分为5个亚群，如表5所示。第1亚群包括YQY（4株菌株）、BST（4株菌株）、YZQ（1株菌株）；第2亚群包括PJP（1株菌株）、HSP（6株菌株）；第3亚群包括HYT（1株菌株）、YQY（15株菌株）；第4亚群包括HYT（8株菌株）、YQY（17株菌株）、HSP（3株菌株）、BST（12株菌株）；第5亚群包括PJP（3株菌株）、HYT（2株菌株）、YQY（1株菌株）、HSP（1株菌株）、BST（1株菌株）。每个亚群之间都存在一定的基因交流，但又有明显的分化，其中第5 亚群遗传组分复杂，与其他亚群都有基因渗透。

3 讨论与结论

研究病原菌遗传多样性是为了更好地明确病原菌群体的遗传组成与遗传结构，进而明确病原菌之间的亲缘关系。目前SSR分子标记技术广泛应用于葡萄霜霉菌群体遗传结构和遗传多样性的研究，SSR技术具有易操作、数据分析简便等优点，受到很多学者的青睐。Taylor等^[11]对50对葡萄霜霉菌SSR引物进行了研究，表明引物具有多态性。本研究中12对SSR引物共检测出54个等位基因，表明各引物之间杂合度存在差异，等位基因多样性比较丰富，且具有多态性，与其研究结果一致。

近年来，我国不同地区葡萄霜霉菌的遗传多样性报道不断增多，很多学者认为葡萄霜霉菌的遗传多样性可能与葡萄品种有关，也可能与地域性有关。赵雪艳^[2]研究葡萄霜霉病的遗传分化，分析了葡萄品系之间的遗传相似性，结果表明山葡萄、刺葡萄与欧亚、美洲杂种的亲缘关系较远，山葡萄和刺葡萄亲缘关系较近，且都属于东亚种群。周婷婷^[12]利用5对SSR引物对新疆部分地区19株葡萄霜霉菌菌株进行遗传分析，结果表明葡萄霜霉菌群体间亲缘关系与地理分布有一定的关系。贾姝等^[13]利用SRAP技术分析采自全国19个省（市）的69株葡萄霜霉病菌的遗传多样性，结果表明辽宁省和黑龙江省的菌株分布于不同类群，且具有较丰富的遗传多样性；而云南省、河北省、陕西省、福建省和山东省的菌株亲缘关系较近，遗传分化程度较低。王境杨^[14]采用7对SSR引物对西南地区6个产区的257株葡萄霜霉病菌进行了霜霉菌群体遗传多样性研究，并分析了霜霉菌群体遗传结构与地域性之间的关系，结果表明西南地区各葡萄产区霜霉菌群体的遗传多样性水平较丰富，群体遗传结构与地理距离之间存在一定相关性。

本试验针对宁夏6个地区的葡萄霜霉菌群体进行了遗传多样性研究，将80株葡萄霜霉菌菌株进行遗传聚类分析，可分为3个类群；根据PCoA主坐标结果，黄羊滩HYT群体、玉泉营YQY群体和白寺滩BST群体之间遗传距离小，亲缘关系近；平吉堡PJP群体和红寺堡HSP群体有部分重合，遗传距离较小，具有较近的亲缘关系；原州区YZQ群体与其他5 个群体几乎没有重合，亲缘关系较远。这表明菌株群体遗传结构与地理距离之间存在相关性，试验结果与周婷婷^[12]、贾姝等^[13]、王境杨^[14]的研究结果相符。根据遗传群体结构分析，将80株葡萄霜霉菌菌株分为5个亚群，每个亚群之间都存在一定的基因交流，但又有明显的分化，其中第5亚群遗传组分复杂，与其他亚群都有基因渗透。本试验中，由于原州区YZQ群体样本数小，无法准确判断与其他群体之间的遗传距离以及亲缘关系，今后还将增加原州区YZQ群体样本数以及其他群体样本数，以进一步明确各群体间的遗传关系。本研究只是针对宁夏部分地区葡萄霜霉菌群体的遗传多样性分析，对于宁夏全区葡萄霜霉菌群体间的遗传多样性还有待深入研究，以进一步明确各地区葡萄霜霉菌群体间的亲缘关系。

参考文献

[1] 杨璐嘉，初炳瑶，邓杰，等.宁夏葡萄霜霉病菌致病型鉴定及葡萄品种抗性评价[J].植物保护学报，2020，47（6）：1321-1332.

[2] 赵雪艳.中国境内部分区域葡萄霜霉病菌（Plasmopara viticola）的遗传分化[D].保定：河北农业大学，2014.

[3] 任旭琴.遗传多样性及其研究方法[J].淮阴工学院学报，2002，11（5）：6-8.

[4] 石洁.葡萄霜霉病菌与寄主品种相关的遗传分化研究[D].北京：中国农业科学院，2016.

[5] DELMOTTE F， CHEN W J， RICHARD- CERVERA S， et al. Microsatellite DNA markers for Plasmopara viticola， the causal agent of downy mildew of grapes[J].Molecular Ecology Notes，2006，6（2）：379-381.

[6] ROUXEL M， PAPURA D， NOGUEIRA M， et al. Microsatellite markers for characterization of native and introduced populations of Plasmopara viticola， the causal agent of grapevine downy mildew[J].Applied and Environmental Microbiology，2012，78（17）：6337-6340.

[7] GOBBIN D， PERTOT I， GESSLER C. Identification of microsatellite markers for Plasmopara viticola and establishment of high throughput method for SSR analysis[J].European Journal of Plant Pathology，2003，109（2）：153-164.

[8] 王境杨，张昊，孔繁芳，等.云南省葡萄霜霉病菌群体遗传结构的SSR分析[J].植物保护，2023，49（2）：170-175.

[9] PEAKALL R， SMOUSE P E. GenAlEx 6.5： genetic analysis in excel. population genetic software for teaching and research： An update[J].Bioinformatics，2012，28（19）：2537-2539.

[10] PRITCHARD J K， STEPHENS M， DONNELLY P. Inference of population structure using multilocus genotype data[J].Genetics，2000，155（2）：945-959.

[11] TAYLOR A S， LAZAR K， WHITE D， et al. Evaluation of microsatellite primers developed for grapevine downy mildew， Plasmopara viticola， on Australian isolates[J].Australasian Plant Pathology，2018，47（2）：189-193.

[12] 周婷婷.新疆地区葡萄霜霉病菌致病性分化研究[D].石河子：石河子大学，2015.

[13] 贾姝，于舒怡，刘长远，等.葡萄霜霉病菌遗传多样性和致病力分化研究[J].沈阳农业大学学报，2021，52（4）：473-479.

[14] 王境杨.西南地区葡萄霜霉病菌群体遗传多样性分析[D].昆明：云南农业大学，2022.

基金资助

宁夏回族自治区重点研发计划项目(2022BBF03004)