番茄细菌性溃疡病病原菌检测鉴定及在植株体内分布规律研究

Detection and Identification of the Pathogens Causing Bacterial Canker Disease in Tomatoes and Study of Its Distribution within Plant Tissues

摘要

对密执安棒形杆菌密执安亚种（Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis，简称Cmm）侵染番茄引起的细菌性溃疡病进行田间调查，采用胶体金试纸条和PCR方法，对田间疑似番茄细菌性溃疡病的植株及其根、茎、叶等不同组织进行Cmm检测和鉴定。结果表明：番茄苗期至成株期均可发生溃疡病；病情随生育期推移而加重，露地生产的发病程度重于设施栽培的发病程度。分离菌株均为Cmm，随病情加重，病菌随维管束扩散至全株，主要分布在番茄根部、茎秆、叶片、叶柄和果实等组织中，试纸条检测和PCR检测结果一致。

Abstract

A field study was conducted on the bacterial canker disease caused by Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis （Cmm） in tomatoes. Colloidal gold test strips and PCR methods were employed to detect and identify Cmm in tomato plants suspected of bacterial canker disease， as well as in different tissues such as roots， stems， leaves and others. The results showed that the canker disease could occur from the seedling stage to the maturity stage of tomatoes. The severity of the disease worsened with the extension of the growth period， with a higher incidence observed in field-grown tomatoes compared to those cultivated in facilities. All isolated strains were identified as Cmm， and as the disease progressed， the bacteria spread through the vascular bundles to the entire plant， primarily distributing in the roots， stems， leaves， petioles， and fruits of the tomato. The results from the test strips and molecular detection were consistent.

Graphical abstract

关键词

番茄细菌性溃疡病 / 病原菌鉴定 / 胶体金试纸条检测 / PCR / 植株体内分布

Key words

tomato bacterial canker pathogen / pathogen identification / colloidal gold test strip detection / distribution within plant tissues

番茄细菌性溃疡病是由密执安棒形杆菌密执安亚种（Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis，简称Cmm）侵染番茄引起的一种细菌性病害，别名萎蔫病、溃疡病^[1-2]。1954年俞大绂等首次在大连某市场上发现疑似番茄溃疡病症状的番茄果实，1958年和1993年北京市平谷和东北地区发现番茄溃疡病^[1，3-4]，随后河北、山西、内蒙古、黑龙江、吉林、山东、四川、甘肃、新疆、宁夏等地陆续报道了该病害的发生^[5-6]。该病害影响番茄生长，降低品质和产量，严重发生时可造成绝产，是番茄生产中最具破坏性的病害之一^[1-2，4]，对番茄产业构成严重威胁。1982年欧洲植物保护组织（EPPO）将该病原菌列为检疫性生物^[7]，1997年我国也将其列入《中华人民共和国进境植物检疫潜在危险性病、虫、杂草名录（试行）》^[1]。

番茄细菌性溃疡病在番茄整个生育期均会发生，病菌侵染叶片、果实和茎秆等器官，表现不同的症状^[1，8-9]，尤其是侵染维管组织，极易造成番茄整株萎蔫，严重影响番茄生长^[10]。作为维管束病害，病原菌在植株体内的定植和移动方式对番茄生长及病情发展的影响至关重要。研究者普遍认为番茄溃疡病菌在植株体内随木质部液流向上部移动^[11-12]，Chalupowicz^[10]等利用绿色荧光蛋白（GFP）标记技术明确了溃疡病菌在番茄植株内的定植模式和运动方式，利用CLSM（激光共聚焦显微镜）技术观察到病原菌广泛定植在木质部导管内腔和附着在螺旋状次生壁增厚处，该种现象的揭示为病菌侵染番茄导致叶片萎蔫的机制提供了细胞学证据。亦有研究表明人工接种后，病菌在番茄体内既可以沿维管束向茎的上部传播，也可以通过维管束向茎的下部传播，但是向下的扩散速度显著低于向上的扩散速度^[2]。为了进一步研究该现象，为科学防控及揭示病原菌的致病机制提供依据，本试验采用胶体金试纸条和PCR（聚合酶链式反应）方法，对田间不同严重度的番茄细菌性溃疡病植株的根、茎、叶等组织进行检测和鉴定，从而明确病菌在番茄植株体内的分布规律，以期为番茄溃疡病的田间快速诊断和检测提供技术支撑，为制定科学防控措施提供指导。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 番茄植株

感染番茄细菌性溃疡病菌的植株采集自宁夏银川市金凤区良田镇设施蔬菜园区。

1.1.2 胶体金试纸条

番茄细菌性溃疡病免疫检测试纸条（Immunostrip Cmm）购自美国Agdia公司。

1.1.3 化学试剂

523固体培养基：蔗糖10 g、胰蛋白胨8 g、酵母膏4 g、K₂HPO₄ 2 g、MgSO₄ 0.3 g、琼脂15~20 g、水1 000 mL。革兰氏染色：结晶紫、碘液、番红、95%酒精。

1.1.4 引物

PCR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物信息见表1。PCR执行行业标准：SNT 2568—2010。

1.2 试验方法

1.2.1 田间调查及病样采集

田间调查病害发生严重度，观察记录果实、茎秆、叶片及番茄整株的症状特征，拍照；依据严重度分级标准采集病样，连根挖出，整株装入洁净的采集袋，标记后带回实验室用于检测鉴定及致病菌的分离，每个级别分别取3株。严重度分级标准划分为轻、中、重3个级别^[2，13]：轻度为植株仅下部叶片叶缘出现坏死斑；中度为植株中下部叶片叶缘坏死，轻度萎蔫；重度为除新梢外植株其余部位叶片叶缘坏死，萎蔫。采集时间为2023年3月中旬，采集地点为宁夏银川市金凤区良田镇设施蔬菜园区。

1.2.2 病原菌检测和鉴定

1）取样。取发病程度为轻、中、重植株的主根和侧根，距地面20、80、140 cm处的茎秆以及对应茎秆部位的复叶、叶柄、果实。发病重的果实取果梗、中轴、胎座组织、表皮和汁液5 部分进行检测。

2）胶体金试纸条检测。使用一次性刀片取上述所取样本的病健交界组织1~2 cm进行检测。检测方法依据试纸条使用说明，每个样本重复3次。

3）PCR检测。对试纸条检测为阳性的样本进行PCR分子检测。

1.2.3 病原菌分离培养鉴定

1）病原菌分离培养。在不同发病程度番茄植株上选择具有典型症状的7个样本，使用灭菌解剖刀切取样本病健交界组织1~2 cm，先用无菌水冲洗干净，再经φ（NaClO）=1%消毒5 min，后用无菌水清洗3次；将消毒后的茎段置于灭菌研钵中，加1~2滴无菌水，挤压研磨使组织液渗出；用灭菌接种环蘸取组织液在培养基平板上划线，将平板置于28 ℃恒温箱中培养2~3 d后，挑取疑似番茄溃疡病病原菌的单菌落进行纯化培养，依据文献[4]、[14]观察、记录菌落形状、大小、颜色等形态特征。

2）病原菌革兰氏染色。通过革兰氏染色对分离得到的病菌进行染色鉴定^[1，13]。

3）病原菌鉴定。用番茄溃疡病病菌特异性引物ClaF1/ClaR2和PSA-8/PSA-R对分离得到的病原菌进行鉴定。挑取纯化培养得到的单菌落到1 mL无菌水中作为PCR反应模板。采用表1中的引物进行PCR扩增，反应体系（20 μL）：菌悬液1 μL，上、下游引物各1 μL，ddH₂O 7 μL，Es Tap Master Mix 10 μL。反应程序：94 ℃/3 min；94 ℃/30 s，62.5 ℃/45 s，72 ℃/30 s，循环30 次；72 ℃/5 min，保存。对扩增产物进行电泳检测^[4，15]。

2 结果与分析

2.1 番茄溃疡病症状特征

田间调查结果表明，露地和设施栽培番茄从苗期至成株期均可发生溃疡病，露地种植的发病程度重于设施栽培的发病程度。叶片和茎秆发病严重，果实偶见发病，以青果为主（图1）。田间番茄植株首先从下部叶片发病，叶缘黑色或褐色，似火烧（图1-a、图1-b），俗称火烧叶，并逐渐向上蔓延。撕开下部茎秆皮层可见韧皮层褐色（图1-h）。随生育期推移植株下部枝条萎蔫并枯死（图1-g）。青果发病果实表面形成具有白色晕圈的典型鸟眼状病斑（图1-d）。调查还发现青幼果果梗处易被病菌侵染，果实色白极易脱落（图1-f）。红色果实表面多个鸟眼状病斑聚集似火山状（图1-e）。发病中后期，植株下部叶片坏死，垂萎，但是不脱落（图1-c）。

无论是露地还是设施栽培，发病率随生育期推移而逐渐增加，程度由轻到重，发病严重的田块发病率高达95%，最低的为65%，平均发病率为82%，发病程度均达到中度以上，严重的提前拉秧。这严重影响了番茄生长，造成产量和品质大幅下降，甚至绝产。

2.2 病原菌鉴定

2.2.1 病原菌分离与菌落形态学观察

对检测样本进行分离获得7株菌株，培养48 h后，通过纯化培养的菌落形态（图2）可以看出，7株菌株菌落形态基本一致，菌落直径1~3 mm，表面平滑黏稠，呈淡黄色，边缘光滑无锯齿状。菌落的形态特征与已有的研究结果一致，因此可初步确定分离得到的7个菌株均为Cmm。

2.2.2 革兰氏染色反应

由图3可以看出，分离得到的病原菌革兰氏染色反应结果为紫色，与伯杰系统鉴定手册对番茄细菌性溃疡病病原菌的定义一致。

2.2.3 病原菌分子生物学鉴定

由图4可以看出，2 种引物均能扩增出特异条带，得到的目的片段为250、268 bp，与目标片段一致。因此，可以确定分离得到的菌株均为Cmm。阴性对照（清水）无扩增条带出现。

2.3 检测结果

2.3.1 试纸条检测

试纸条检测结果表明（表2），发病轻的番茄植株20 cm处茎秆及对应的叶柄、叶片、果实的检测结果均为阳性，80、140 cm处组织的检测中，仅有80 cm处茎秆及对应的叶柄检测结果为阳性，其余组织的检测结果为阴性。发病程度为中和重的植株检测的所有组织结果均为阳性，表明中度和重度发病植株上的所有组织都有病原菌的存在，其中对重度发病植株果实的果梗、中轴、胎座组织和表皮4 个部位的检测结果均为阳性，而番茄汁液的检测结果为阴性（图5）。这表明随严重程度增加，溃疡病菌在全株扩散，通过维管束进入果实组织。

2.3.2 PCR检测

分子检测结果表明，所检测样本中，发病轻的植株，80 cm处叶片、果实，140 cm处所有组织的结果均为阴性，其余组织检测结果均为阳性（表3）。不同发病程度的植株均由Cmm侵染引起番茄溃疡病，发病程度轻的植株中上部未检测到病菌，证明未被病菌侵染；发病程度为中度和重度的全株检测结果为阳性，表明病菌已侵染整株植株。分子检测结果与试纸条检测结果一致。

2.4 番茄细菌性溃疡病病菌在植株体内的分布特征

根据胶体金试纸条和分子检测结果，番茄受到Cmm侵染，随着程度加重，呈现全株扩散趋势，主要分布在根部、茎秆、叶片、叶柄及果实的果梗、中轴、胎座和表皮等组织内，而果实汁液中未发现Cmm。发病轻的植株中上部的组织未检测到病原菌，中度和重度发病植株整株均检测到Cmm，表明病原菌通过木质部导管移动，自下部向上扩散，移动到茎秆、叶柄、叶片和果实等部位后继续增殖，随液流侵染健康部位，使得病菌存在于除番茄果实汁液外的所有部位。

3 讨论与结论

田间调查观察到的番茄叶片、茎秆、果实所表现的典型症状与已有研究结果相符^{[1，3，8-9，15]}。发病叶片大多自植株下部向上部蔓延，表现的症状为叶缘开始干枯萎蔫，与缺水症状相近，症状严重时类似火烧，最终整个叶片坏死，但是不会从茎秆上脱落；茎秆内部韧皮层变色是该病害常见的症状，病情严重时茎秆一般会开裂呈溃疡状，直至整株枯萎死亡，但是本课题组在实地调查过程中没有发现茎秆开裂这一症状，而普遍观察到韧皮层的变色。鸟眼斑症状是番茄果实感染溃疡病的典型症状，果实表面多个鸟眼状病斑聚集在一起形成类似疤痕的症状^[8，16-18]，鸟眼斑形成之前会出现白色晕圈，这一症状多发生在青果上，但是发病率极低，这可能与农户施药有关。火烧叶与茎秆韧皮层变色是生产中普遍发生的症状。

检测样本中，胶体金试纸条检测和分子检测的结果一致，表明试纸条检测结果的准确性较高，该方法操作简单、方便快捷，更适宜于田间病害的快速检测。Cmm在被侵染植株的大多数组织中均有分布，病原菌自下向上的移动方式也与之前研究^[2，10]得到的结果一致。Cmm在生长后期会通过气孔、排水器等自然开口侵染植株^[19]，且植株表面的伤口也是病原菌侵染的途径，病原菌通过自然孔口与伤口移动到维管组织并增殖，系统地移动到番茄植株的每个组织^[20]，遭受Cmm侵染的植株根部、木质部和韧皮部的功能会被破坏，从而导致番茄生长受到影响。该病害一旦在番茄幼苗上发生，会直接导致幼苗死亡^[21-23]。根据Cmm在植株体内分布的情况，感病植株出现的伤口处会有病菌存在，而飞溅的水珠、修剪使用的工具或农户操作的手都会将病菌传播给周围健康植株，因此农户在操作时应做好剪刀、手套等一切接触植物的工具的消毒工作，尤其是在已发病区域工作后。此外，修剪侧枝时应保留5 cm左右茎秆，以避免在主茎秆上造成伤口，这可以减少健康植株因农事操作受到的Cmm侵染^[1，24-25]。

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基金资助

农业外来入侵物种发生危害及扩散风险等调查（宁夏）项目(13210383)