不同产奶量遗传潜力后备牛瘤胃微生物区系的比较

Comparative Study on the Rumen Microbiota of Replacement Heifers with Different Genetic Potentials for Milk Production

摘要

为研究不同产奶量遗传潜力后备牛瘤胃发酵参数和瘤胃细菌群落的差异，选择14 头体况相近、发育状况良好的7 月龄后备牛在同一牛舍进行散栏饲养，喂食相同日粮。根据试验牛基因组综合育种值及其母亲上一胎次产奶量，将试验牛分为高产奶量遗传潜力组（H）和低产奶量遗传潜力组（L），晨饲前采集瘤胃液，对瘤胃发酵参数和瘤胃细菌群结构进行分析比较。结果表明：L组瘤胃乙酸、丙酸、丁酸和总挥发性脂肪酸的浓度显著高于H组（P<0.05）；L组瘤胃细菌丰富度显著高于H组（P<0.05），细菌群落多样性无显著差异。在细菌门水平上，拟杆菌门和厚壁菌门是7 月龄不同产奶量遗传潜力后备牛瘤胃的优势菌门，L组变形菌门的相对丰度显著高于H组（P<0.01）；在属水平上，不同产奶量遗传潜力后备牛瘤胃细菌相对丰度差异不显著（P>0.05）。可见，在采食相同日粮条件下，不同产奶量遗传潜力后备牛瘤胃细菌群落结构的差异小。

Abstract

In order to investigate the differences in rumen fermentation parameters and rumen bacterial communities of heifers with different genetic potentials for milk production， 14 heifers of similar body condition and good development at 7 months of age were selected and raised in a loose housing system， fed the same diet. Based on the comprehensive breeding values of the experimental heifers’ genomes and the milk production of their mothers in the previous lactation， the heifers were divided into a high genetic potential group for milk production（H） and a low group（L）. Rumen fluid was collected before morning feeding to analyze and compare rumen fermentation parameters and rumen bacterial community structures. The results showed that the concentrations of acetate， propionate， butyrate， and total volatile fatty acids in the rumen of the L group were significantly higher than those in the H group （P<0.05）； the rumen bacterial richness in the L group was significantly higher than that in the H group （P<0.05）， while there was no significant difference in bacterial community diversity. At the phylum level， Bacteroidetes and Firmicutes were the dominant phyla in the 7-month-old heifers with different genetic potentials for milk production， with the relative abundance of Proteobacteria in the L group being significantly higher than that in the H group （P<0.01）. At the genus level， there were no significant differences in rumen bacteria among heifers （P>0.05）. It can be seen that under the same dietary conditions， the differences in the rumen bacterial community structures of heifers with different genetic potentials for milk production are minimal.

Graphical abstract

关键词

遗传潜力 / 7月龄后备牛 / 发酵参数 / 瘤胃细菌

Key words

genetic potential / 7-month-old heifers / fermentation parameters / rumen bacteria

后备牛作为成年牛的生产群体，其生长发育对成年牛的健康情况、产奶潜能和生理繁殖等至关重要。良好的瘤胃发育是后备牛培育的重要目标。大量研究表明，饲粮对瘤胃微生物种群的丰富度和多样性产生影响，近些年越来越多的证据表明，宿主因素（品种、遗传变异等）也会影响牛瘤胃微生物组的组成和功能。有研究发现，在相同的饲养管理下饲喂相同高谷物日粮的泌乳中期奶牛存在核心和非核心瘤胃细菌组^[1]。Weimer等^[2]首次提出了宿主对瘤胃微生物组的影响。

一些瘤胃微生物分类群已被证明是可遗传的^[3]。马利鑫^[4]的研究表明，在采食相同日粮条件下，不同单产水平奶牛的瘤胃细菌在不同分类水平上存在较大差异。而不同产奶量奶牛在生长发育阶段其瘤胃细菌是否已经存在差异尚未见报道，本试验的目的是研究高产奶量遗传潜力后备母牛和低产奶量遗传潜力后备母牛的瘤胃细菌组成是否存在差异，旨在为奶牛生产提供有效参考。

1 材料与方法

1.1 试验动物的选择及试验设计

选择14头体况相近、发育状况良好的7 月龄健康后备母牛，根据其基因组综合育种值（TPI），结合其母亲上一胎次305 d产奶量，将这14 头后备母牛分为高产奶量遗传潜力组（H）和低产奶量遗传潜力组（L），每组各7 头。试验牛基本情况见表1。将所有试验牛在同一牛舍进行散栏式饲养，采食相同日粮，每天喂食2次TMR（全混合日粮），自由饮水。试验牛日粮成分及营养水平（干物质基础）见表2。

1.2 瘤胃液的采集及微生物区系的测定

1.2.1 瘤胃液样品的采集

在清晨饲喂前使用瘤胃液采样器通过口腔采集瘤胃液约100 mL，经4 层无菌棉纱布过滤后收集滤液。将部分滤液分装于无菌离心管内，在-20 ℃下保存，用以检测瘤胃发酵参数，将剩余部分分装在无菌离心管中保存于-80 ℃冰箱，用于瘤胃微生物区系的测定。

1.2.2 测定瘤胃液各发酵参数

pH：在采集瘤胃液后，随即使用便携式酸度计[希玛（Hima）pH848]测定pH。

NH₃-N质量浓度：利用比色法测定NH₃-N质量浓度^[5]。

VFA（挥发性脂肪酸）浓度：使用气相色谱仪（日本岛津GC-2014C）分别测定乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸和总挥发性脂肪酸的浓度^[6]。

1.2.3 测定瘤胃微生物区系

利用HiPure Soil DNA提取试剂盒（广州美基生物科技有限公司）提取瘤胃液总DNA，通过ρ=1.2 %的琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取质量。将质检合格样品于-20 ℃下冷冻保存。取适量检测合格的DNA样品于离心管中进行稀释，以稀释后的DNA作为模板，以V3-V4区为DNA扩增目的片段（测序引物为341F：CCTACGGGNGGCWGCAG，806R：GGACTACHVGGGTATCTAAT）进行PCR扩增，使用Vazyme VAHTSTM DNA Clean Beads对扩增产物进行纯化回收，使用Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit试剂在Microplate reader（Bio Tek，FLx800）上进行荧光定量，以荧光定量结果为依据，按照每一个样本测序量的需求，将各样本按一定比例混合。采用Illumina公司的TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit制备测序文库。上机测序前将文库在Agilent Bioanalyzer上采用Agilent High Sensitivity DNA Kit进行质检，之后使用Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit试剂在Promega Quanti Fluor荧光定量系统上对文库进行定量，将符合要求的各上机测序文库进行不同梯度稀释后，依据所需测序量按相应比例混合，然后经NaOH变性成单链进行上机测序^[7]。

1.3 数据统计与分析

使用QIIME 2（2019.4）软件进行测序数据处理，分析样本在门水平和属水平上的分类组成。使用Excel 2016对试验数据进行初步整理，采用SPSS 21.0软件进行统计学处理分析，P>0.05为差异不显著，P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著。

2 结果与分析

2.1 试验牛瘤胃发酵参数的变化

由表3可知，在采食相同日粮条件下，试验牛高产奶量遗传潜力组与低产奶量遗传潜力组瘤胃液pH和NH₃-N质量浓度无显著差异（P>0.05）。低产奶量遗传潜力组瘤胃液乙酸、丙酸、丁酸和总挥发性脂肪酸（TVFA）的浓度均显著高于高产奶量遗传潜力组（P<0.05），而2组间异丁酸、异戊酸和戊酸的浓度均差异不显著（P>0.05）。

2.2 瘤胃细菌Alpha多样性指数的变化

由图1可知，高产奶量遗传潜力组和低产奶量遗传潜力组瘤胃液样品覆盖率均超过98%，表明该测序结果代表了样品中微生物的真实情况。低产奶量遗传潜力组瘤胃微生物区系的Chao1指数和Observed_species指数显著高于高产奶量遗传潜力组（P<0.05），其他指数差异不显著（P>0.05），表明低产奶量遗传潜力组瘤胃微生物丰富度显著高于高产奶量遗传潜力组，但2组间瘤胃微生物的多样性差异不显著。

2.3 瘤胃细菌Beta多样性指数的变化

如图2所示，各组样品间距离越远，说明样品之间的微生物组成结构差异越大，差异显著性越大。由图2可知，在主坐标分析（PCoA）中，主成分贡献值分别为18.5%、17.6%，将样本矩阵投射到Axis1、Axis2构建的二维平面上，95%的置信区间基本重合，无明显分离，说明高产奶量遗传潜力组和低产奶量遗传潜力组瘤胃细菌群落的相似度高。

2.4 试验牛瘤胃细菌群落结构

2.4.1 门水平

本试验在门水平上对试验牛瘤胃细菌鉴定出25 个门，表4为相对丰度排名在前15 位的细菌门类。由表4可知，试验牛拟杆菌门和厚壁菌门的相对丰度总和分别占细菌总和的92.32%和91.94%，说明这2个门是试验牛瘤胃的优势菌门。低产奶量遗传潜力组瘤胃变形菌门的相对丰度比高产奶量遗传潜力组的高，且差异显著（P<0.05），其他菌门的相对丰度在2组间均差异不显著（P>0.05）。

2.4.2 属水平

本试验在属水平上对试验牛瘤胃细菌鉴定出239个属，相对丰度排名在前20位的属见表5。由表5可知，在属水平上，高产奶量遗传潜力组和低产奶量遗传潜力组瘤胃细菌的相对丰度均无显著差异（P>0.05），相对丰度排名在前10位的瘤胃细菌属分别为普雷沃氏菌属、拟杆菌科未鉴定属、未鉴定BS11、梭菌科未鉴定属、瘤胃球菌科未鉴定属、解琥珀酸弧菌属、未鉴定S24-7、瘤胃球菌属、毛螺菌科未鉴定属和丁酸弧菌属。

3 讨论

3.1 不同产奶量遗传潜力后备牛瘤胃发酵参数

瘤胃液pH是衡量瘤胃生理功能的重要指标，一般为5.5~7.5。瘤胃液pH反映反刍动物瘤胃的发酵状况，维持瘤胃内生物群落结构，其变化主要受营养水平及日粮结构的影响^[8]。Liu等^[9]研究不同NFC（非纤维性碳水化合物）/NDF（中性洗涤纤维）水平日粮对山羊瘤胃液pH的影响，结果显示，随着NFC/NDF的提高，瘤胃液pH显著降低。魏德泳等^[10]研究表明，牦牛瘤胃液pH随着NFC/NDF的提高而显著降低。本试验中，不同产奶量遗传潜力组后备牛瘤胃液pH为6.6~6.8，这与试验中日粮NDF含量较高而淀粉含量低有关。瘤胃液NH₃-N是日粮含氮物质在瘤胃内被微生物消化代谢的主要产物，也是合成瘤胃微生物蛋白质的主要原料，其质量浓度在一定程度上提示了蛋白质在瘤胃中分解与合成的平衡状态。瘤胃液NH₃-N质量浓度为6.3~27.5 mg/100 mL时最适合微生物生长^[11]。NH₃-N质量浓度偏高则说明氨的生成速度快于微生物所需的速度，这会造成氮的浪费；过低又会影响瘤胃微生物的生长活动^[12]。李丽红^[13]研究发现，NH₃-N浓度会随日粮蛋白质水平升高而上升。本试验中瘤胃液NH₃-N质量浓度为12~15 mg/dL，表明后备牛日粮CP水平较为适宜，适合微生物的生长活动。

乙酸、丙酸和丁酸是瘤胃主要的挥发性脂肪酸（VFA）^[14]。VFA浓度可以反映瘤胃微生物对日粮中碳水化合物消化吸收的情况^[15]。日粮中的纤维性碳水化合物和非纤维性碳水化合物发酵的主要产物分别是乙酸和丙酸^[16]。反刍动物饲粮中精料比例高， 则瘤胃发酵倾向于丙酸发酵，反之则倾向于乙酸发酵^[17]。本试验中，后备牛饲粮中粗饲料占70.27%，饲粮中NDF含量较高而淀粉含量较低，瘤胃挥发性脂肪酸中乙酸比例较高而丙酸比例较低，这与上述研究结果一致。

3.2 不同产奶量遗传潜力后备牛瘤胃微生物区系

瘤胃微生物多样性指标由菌群内的种类数与个体数所构成，可反映微生物群落的特性和功能。有研究发现，瘤胃细菌的Alpha多样性指数与饲料效率有关，低效率的个体具有更复杂和多样性的微生物群落^[12]。而具有较高产奶量、较低乳脂以及高乳蛋白产量奶牛的瘤胃微生物群的丰富度较低^[1，18]。本试验也发现高产奶量遗传潜力后备母牛瘤胃细菌的丰富度较低，而不同产奶量遗传潜力组之间细菌群落多样性变化的差异不显著。研究表明，影响反刍动物瘤胃微生物菌群差异的主要原因有宿主年龄^[19]、宿主基因型、宿主饲粮等^[20-21]。Li等^[22]对瘤胃微生物分类学特征的中等遗传力估计和从GWAS（全基因组关联分析）中鉴定出的微生物类群相关SNP（单核苷酸多态性）的研究表明，肉牛瘤胃微生物定植可能受到宿主加性遗传效应的影响，并存在与瘤胃微生物区系相关的SNP。因此，牛可能通过基因控制其瘤胃微生物群，从而影响其瘤胃发酵^[22]。在多项研究中，牛瘤胃中厚壁菌门的相对丰度高于拟杆菌门且二者均为优势菌种^[4，23-24]。马利鑫^[4]的研究表明，高产奶量组奶牛放线菌门、浮霉菌门相对丰度显著高于低产奶量组，而螺旋体门、梭杆菌门显著低于低产奶量组。本试验中，拟杆菌门和厚壁菌门是7 月龄后备母牛瘤胃细菌的优势菌门，且拟杆菌门的相对丰度高于厚壁菌门，低产奶量遗传潜力组变形菌门的相对丰度显著高于高产奶量遗传潜力组，这与上述研究结果不一致，原因可能是奶牛在不同的生长阶段，其瘤胃内微生物不同。Jami等^[25]发现即使6 月龄牛和2 岁牛采食相同日粮，它们的微生物群落仍然存在显著差异。赵烨婵等^[26]在呼伦贝尔羊上的研究表明，随着羊的生长发育，其瘤胃微生物菌群的构成也随之发生变化。

4 结论

在相同日粮条件下，拟杆菌门和厚壁菌门是7月龄后备母牛瘤胃的主要细菌，但不同产奶量遗传潜力后备牛7 月龄时的瘤胃细菌菌群差异小。

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基金资助

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