外源性硫化氢对脑缺血再灌注损伤大鼠氧化应激的影响

Effect of exogenous hydrogen sulfide on oxidative stress in rats with cerebral ischemia⁃reperfusion injury

摘要

目的 探究外源性硫化氢［以硫氢化钠（NaHS）为供体］对大鼠大脑中动脉闭塞（MACO）模型的神经保护效应及机制。 方法 将60只Sprague⁃Dawley大鼠均分为假手术组、缺血再灌注（I/R）模型组、NaHS治疗组。假手术组仅不栓塞大脑中动脉，余操作同I/R模型组（MACO模型）；NaHS治疗组在脑缺血后再灌注前20 min腹腔注射6.4 mg/kg的NaHS。通过2，3，5⁃三苯基氯化四氮唑染色检测脑组织梗死体积，酶联免疫吸附分析测定超氧化物歧化酶（SOD）活性及丙二醛（MDA）含量，实时定量聚合酶链反应检测Nrf2 mRNA表达，免疫印迹法分析核转录因子红系2相关因子2（Nrf2）蛋白磷酸化程度。 结果 与假手术组相比，I/R模型组神经功能缺损评分增加，脑梗死体积增加，SOD活性升高，MDA含量升高，缺血周边区Nrf2 mRNA表达上调，p⁃Nrf2/Nrf2蛋白比值升高（均P<0.05）。与I/R模型组相比，NaHS治疗组神经功能缺损评分降低，脑梗死体积减小，SOD活性增强，MDA含量降低，Nrf2 mRNA表达升高，p⁃Nrf2/Nrf2比值下降（均P<0.05）。 结论 外源性硫化氢能抑制脑I/R氧化应激过度激活，减小脑组织梗死体积，发挥神经保护作用，为硫化氢用于缺血性脑卒中的临床干预提供了理论依据。

Abstract

Objective To investigate the neuroprotective effect and mechanism of exogenous hydrogen sulfide ［using sodium hydrosulfide （NaHS） as a donor］ in a rat model of middle cerebral artery occlusion （MCAO）. Methods A total of 60 Sprague⁃Dawley rats were randomly divided into sham⁃operation group， cerebral ischemia/reperfusion （I/R） model group， and NaHS treatment group. The rats in the sham⁃operation group were given the same treatment as the model group except for middle cerebral artery occlusion， and those in the NaHS treatment group were given intraperitoneal injection of 6.4 mg/kg NaHS 20 minutes before reperfusion after cerebral ischemia. 2，3，5⁃triphenyltetrazolium chloride （TTC） staining was used to measure cerebral infarct volume； ELISA was used to measure the activity of superoxide dismutase （SOD） and the content of malondialdehyde （MDA）； quantitative real⁃time PCR was used to measure the mRNA expression level of Nrf2， and Western blotting was used to measure the phosphorylation level of Nrf2 protein. Results Compared with the sham⁃operation group， the I/R model group had significant increases in neurological deficit score and cerebral infarct volume， a significant increase in the activity of SOD， and significant increases in the content of MDA， the mRNA expression level of Nrf2 in the peri⁃ischemic area， and p⁃Nrf2/Nrf2 protein ratio （all P<0.05）. Compared with the I/R model group， the NaHS treatment group had significant reductions in neurological deficit score and cerebral infarct volume， a significant increase in the activity of SOD， significant reductions in the content of MDA， significant increase in the mRNA expression level of Nrf2， and significant reductions in the p⁃Nrf2/Nrf2 ratio （all P<0.05）. Conclusions Exogenous hydrogen sulfide can inhibit the excessive activation of oxidative stress in cerebral I/R injury， reduce cerebral infarct volume， and exert a neuroprotective effect， which provides a theoretical basis for the application of hydrogen sulfide in the clinical intervention of ischemic stroke.

Graphical abstract

关键词

缺血性脑卒中 / 硫化氢 / 再灌注损伤 / 氧化应激 / 大鼠

Key words

cerebral ischemic stroke / hydrogen sulfide / reperfusion injury / oxidative stress / rat

脑缺血再灌注（ischemia⁃reperfusion， I/R）损伤是指脑血流因各种原因中断数分钟至数小时后，当恢复脑组织血流灌注时，反而出现组织损伤加剧和功能进行性退化的病理过程。氧化应激作为I/R损伤进程中的核心环节，本质是机体氧化负荷超出抗氧化防御能力，导致活性氧（reactive oxygen species， ROS）大量生成并引发核酸、蛋白质、细胞膜及细胞器损伤。ROS 的过度积累能够激活丝裂原活化蛋白激酶（mitogen⁃activated protein kinases， MAPK）和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin， mTOR）信号通路，诱导细胞凋亡^［1］。MAPK家族主要包括c⁃Jun氨基末端激酶（c⁃Jun N⁃terminal kinase， JNK）、P38丝裂原活化蛋白激酶（P38MAPK）和胞外信号调节激酶1/2（extracellular signal⁃regulated kinase 1/2， Erk1/2）。有研究显示，抑制JNK、P38MAPK和Erk1/2的磷酸化，可有效逆转炎症反应与氧化应激状态^［2］。由于I/R损伤的病理机制极为复杂，当前临床药物治疗效果仍存在局限性。因此，深入探究I/R损伤机制，并开发新型治疗药物，成为亟待解决的医学难题。

硫化氢（hydrogen sulfide， H₂S）作为继一氧化碳和一氧化氮之后被发现的第3种内源性气体信号分子，在神经调节领域发挥着重要作用。生理浓度的H₂S能够上调超氧化物歧化酶（superoxide dismu⁃tase， SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶、B细胞淋巴瘤／白血病⁃2等抗氧化及抗凋亡蛋白的表达水平，同时降低丙二醛（malondialdehyde， MDA）、B细胞淋巴瘤／白血病⁃2相关X蛋白和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶 3的含量^［3］。硫氢化钠（sodium hydrosulfide， NaHS）作为常用的外源性H₂S供体，可有效提升体内H₂S浓度。目前，通过干预MAPK信号通路实现神经保护已成为脑血管疾病研究的突破方向。本研究通过构建大鼠局灶性缺血再灌注模型，并采用NaHS进行干预，旨在测定外周血ROS水平，观察缺血周边区JNK、P38MAPK、Erk1/2及核转录因子红系2相关因子2（nuclear factor⁃erythroid 2⁃related factor 2， Nrf2）的磷酸化表达，进而揭示外源性H₂S神经保护作用的分子机制。

1 材料与方法

1.1 研究材料

实验所用NaHS和2，3，5⁃三苯基氯化四氮唑（2，3，5-Triphenyltetrazolium chloride， TTC）购自美国Sigma⁃Aldrich公司；实时定量聚合酶链反应（real⁃time quantitative polymerase chain reaction， qPCR）试剂购自日本Takara Bio公司；SOD和MDA检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；一级多克隆抗体采购自美国细胞信号技术公司（Cell Signaling Technology， America）；二级抗体购自中国CMCTAG公司；免疫组化相关试剂购自北京金桥科技有限公司。

1.2 研究方法

1.2.1 实验动物分组与模型制作

选用健康成年雄性Sprague⁃Dawley大鼠，采用随机数字表法将其分为假手术组、I/R模型组、NaHS治疗组，每组20只。

I/R模型组通过参照Longa线栓法，实施右侧大脑中动脉栓塞2 h后进行再灌注操作，在再灌注前20 min腹腔注射生理盐水。假手术组进行相同手术操作，但线栓仅插入右侧大脑中动脉8～10 mm，不造成血管阻塞。NaHS组同样构建右侧大脑中动脉栓塞2 h再灌注模型，于再灌注前20 min腹腔注射6.4 mg/kg的NaHS溶液。实验所用线栓为直径0.26 mm的单丝尼龙钓鱼线，栓塞2 h后拔除，形成再灌注，随后对颈部手术切口进行严密缝合与消毒处理。

本实验方案严格遵循美国国立卫生研究院发布的实验动物使用指南，并通过中南大学湘雅医院医学伦理委员会审批（批准号：2023111437）。

1.2.2 神经功能缺损评分

采用Longa的5级评分标准。在大鼠苏醒后即刻进行首次神经功能评分，并于术后第5天进行第2次评分。

评分标准如下：0分为无神经功能缺损症状；1分为不能完全伸展对侧前肢；2分为向对侧转圈；3分为向对侧倾倒；4分为不能自发行走，且意识丧失。

实验过程中，评分结果为0分或4分、出现呼吸困难症状、提前死亡，以及处死时发现存在蛛网膜下腔出血的大鼠均予以剔除；同时，对于手术过程中出血量过大的大鼠也进行淘汰处理，并在后续实验中按随机原则补足样本数量。

1.2.3 TTC染色

在大脑中动脉闭塞（middle merebral artery occlusion， MCAO）造模后24 h，每组随机选取5只大鼠，经10%水合氯醛腹腔注射麻醉后取脑，将脑组织置于⁃20℃冰箱冷藏15～20 min，待标本适度硬化后，沿冠状面切成厚度约2 mm的脑片，立即放入2%的TTC溶液中，置于37℃恒温避光水浴30 min，随后转移至4%多聚甲醛溶液中固定6 h。采用数码相机对染色后的脑片进行扫描成像，采用Image⁃pro plus 6.0图像分析软件测定各脑片的体积及梗死面积。脑梗死体积通过公式V=t （A₁ + A₂ + … + An）⁃（A₁ + An） t/2进行计算，其中t为切片厚度，A为各层切片的梗死面积。

1.2.4 酶联免疫吸附测定

采用酶联免疫吸附测定法，检测各组大鼠血浆中SOD活性及MDA含量。具体操作严格按照上海碧云天生物技术有限公司提供的试剂盒说明书进行，采用分光光度计在450 nm波长处测定吸光度值，进而计算SOD和MDA的浓度。

1.2.5 免疫印迹测定

取缺血半暗带脑组织，在液氮环境下充分研磨成粉末状，将粉末均匀分散于含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液中，冰上裂解30 min。随后将裂解液于4℃、16 000 r/min离心10 min，收集上清液用于蛋白定量。经十二烷基硫酸钠–聚丙烯酰胺凝胶电泳、转膜后，p⁃ERK1/ 2（1∶1 000，购自CST公司）、p⁃JNK（1∶800，购自CST公司） 、p⁃P38MAPK（1∶1 000，购自CST公司）、p⁃Nrf2（1∶500，购自CST公司）和内参照甘油醛⁃3⁃磷酸脱氢酶（glyceraldehyde⁃3⁃phosphate dehydrogenase， GAPDH；1∶1 000，购自碧云天公司）一抗和辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔/小鼠二抗（1∶2 000）分别进行孵育。孵育结束后，将化学发光显影剂均匀滴加于膜表面，采用Quantity One软件（Bio⁃Rad）对免疫印迹图像进行分析，通过计算目的蛋白条带灰度值与内参蛋白GAPDH灰度值的比值，确定各组目的蛋白的相对表达水平。

1.2.6 qPCR

运用qPCR技术检测缺血半暗带脑组织中Nrf2和内参基因GAPDH的表达水平。取缺血半暗带脑组织，在液氮中研磨后，使用TRIzol试剂进行总RNA提取，采用氯仿–异戊醇法纯化RNA，并利用A⁃Plus细菌聚腺苷酸聚合酶为RNA添加polyA尾。qPCR反应采用SYBR预混物Ex⁃Taq⁃qPCR试剂盒，GAPDH正向引物序列为5’⁃AGAACATCATCCCTGCCATCC⁃3’，反向引物序列为3’⁃TGGATACATTGGGGGTAGGA⁃5’；Nrf2正向引物序列为5’⁃CAGCGACGGAAAGAGTATGA⁃3’，反向引物序列为3’⁃TGGGCAACCTGGGAGTAG⁃5’。扩增反应在Applied Biosystems Prism 7500实时荧光定量PCR仪上进行，反应程序设置为：预变性阶段，95℃ 30 s；循环阶段（40个循环），95℃ 5 s、55℃ 30 s、72℃ 45 s；熔解曲线阶段，95℃ 15 s、60℃ 1 min。目标基因Nrf2的表达水平以GAPDH为内参进行相对定量分析。

1.3 统计学方法

采用SPSS 19.0统计软件对实验数据进行分析处理。计量资料以均数±标准差（x-±s）表示，2组间差异比较采用成组t检验；多组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用Newman⁃Student检验。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 NaHS对大鼠缺血再灌注损伤后神经功能缺损的影响

在右侧MCAO 2 h再灌注后， I/R模型组和NaHS治疗组大鼠均出现不同程度的神经功能缺损症状，主要表现为提尾悬空时对侧肩部内旋受限、前肢屈曲内收且肌力明显下降，其中I/R模型组症状最为显著。在术后第24小时及第5天两个时间点，NaHS治疗组的神经功能评分均低于I/R模型组（P<0.05）。假手术组未出现任何神经功能缺损症状，评分始终为 0 分，故不纳入统计分析。见表1。

2.2 NaHS对大鼠缺血再灌注后脑梗死体积的影响

假手术组大鼠脑组织经TTC染色后呈均匀红色，未发现梗死区域。I/R模型组右侧脑组织可见大小不等的苍白色梗死灶，主要集中于距离嗅球尖端3～10 mm的区域，左侧脑组织染色正常。与I/R模型组相比，NaHS 治疗组脑梗死体积显著减小。见图1。

在I/R 24 h后，I/R模型组脑梗死比例为（46.2±2.6）%，而NaHS治疗组该比例降低至（31.2±2.0）%，差异具有统计学意义（P=0.022），且NaHS治疗组在各时间点的脑梗死体积减小趋势与神经功能改善情况一致。

2.3 酶联免疫吸附测定法检测大鼠血浆中SOD和MDA的表达

与假手术组相比， I/R模型组和NaHS治疗组大鼠血浆中SOD活性增高及MDA含量升高（P<0.01）。进一步组间比较显示，与I/R模型组相比，NaHS治疗组血浆中SOD活性增强，MDA含量降低，差异具有统计学意义（P<0.01）。见图2A、图2B。

2.4 qPCR检测NaHS对大鼠缺血再灌注后缺血周边区Nrf2表达的影响

与假手术组相比， I/R模型组和NaHS治疗组大鼠在再灌注24 h后，缺血周边区脑组织中Nrf2 mRNA表达水平均显著上调（P<0.01）。与I/R模型组相比，NaHS治疗组Nrf2 mRNA表达水平升高（P<0.01）。见图3。

2.5 免疫印迹法检测NaHS对大鼠缺血再灌注后缺血周边区Erk1/2、JNK和P38MAPK蛋白表达的影响

与假手术组相比，I/R模型组和NaHS治疗组大鼠在再灌注24 h后，缺血周边区脑组织中磷酸化JNK（p⁃JNK）与JNK比值、磷酸化P38MAPK（p⁃P38MAPK）与P38MAPK比值、磷酸化Nrf2（p⁃Nrf2）与Nrf2比值均显著升高。与I/R模型组相比，NaHS治疗组缺血周边区脑组织中p⁃JNK/JNK、p⁃P38MAPK/P38比值下调（P<0.05），而p⁃Nrf2/Nrf2比值上调（P<0.01）。见图4、图5。

3 讨论

近年来，脑卒中在我国的发病率呈逐年攀升态势，其极高的致残率与致死率已给社会医疗体系及家庭照料带来沉重负担^［4］。随着急性缺血性脑卒中静脉溶栓、机械取栓技术以及颅内外大血管慢性闭塞开通术等介入治疗的广泛应用，临床中I/R损伤的发生率显著增加。氧化应激作为I/R损伤的核心病理环节，可在短时间内破坏脑内稳态平衡：缺血缺氧阶段三磷酸腺苷迅速耗竭，再灌注后引发钙超载，继而诱发脂质过氧化级联反应、ROS与炎症因子大量蓄积、线粒体功能障碍及细胞凋亡级联激活^［5］，形成“再灌注损伤瀑布”。因此，靶向调控氧化应激成为减轻I/R损伤、改善患者预后的关键策略。

已有研究证实，H₂S可通过增强心肌细胞线粒体膜稳定性，提升细胞对缺氧环境的耐受性^［6］。Shui等^［7］研究显示，H₂S能通过抑制Beclin⁃1介导的自噬通路，减少缺血半暗带自噬细胞积累，进而缩小脑梗死体积，并改善神经功能评分。在全脑I/R大鼠模型中，外源性H₂S供体NaHS可通过抑制caspase⁃3活化，减轻血脑屏障破坏与神经元凋亡。本研究结果显示，局灶性I/R可导致大鼠脑梗死区域ROS活性显著升高，而NaHS干预能缩小脑梗死体积，并降低ROS水平，这与上述研究^［7］的结论高度一致。这提示H₂S对脑I/R氧化应激损伤具有广谱保护效应。

线粒体功能紊乱是氧化应激的重要诱因。有研究通过膜电位荧光探针检测发现，缺血再灌注过程中神经元线粒体跨膜电位（Δψm）快速去极化，伴随呼吸链电子泄漏增加，导致超氧阴离子爆发性生成^［8⁃9］。本研究中，I/R模型组大鼠血浆MDA水平较假手术组升高，而SOD活性仅呈代偿性升高。NaHS干预后，MDA水平显著降低，同时，SOD活性进一步提升。这一结果表明，NaHS可能通过维持线粒体膜完整性，减少ROS生成，并增强抗氧化酶系统活性，形成“双重保护机制”。

MAPK信号通路在氧化应激信号转导中起枢纽作用。本研究发现，I/R可诱导缺血周边区Erk1/2、JNK、P38MAPK磷酸化水平升高，而NaHS干预显著抑制了JNK和P38MAPK的磷酸化激活，而对Erk1/2通路无显著影响。这一现象与Zhao等^［10］的研究结果一致。Zhao等^［10］的研究显示，JNK抑制剂SP600125可通过阻断c⁃Jun 磷酸化，减少肿瘤坏死因子α诱导的小胶质细胞活化^［10］。值得注意的是，活化的P38MAPK可通过激活核因子κB通路，促进中性粒细胞趋化因子（如白细胞介素⁃8）的转录^［11］。而NaHS对P38MAPK的抑制可能同时发挥抗炎与抗氧化双重效应^［12］。

Nrf2是氧化应激防御的核心转录因子^{［13⁃14］}。Nrf2激活机制在本研究中得到进一步阐释：I/R刺激可使Nrf2 mRNA表达升高，而NaHS干预使其进一步升高，同时p⁃Nrf2与Nrf2比值也会增加。这提示NaHS可能通过抑制Keap1泛素连接酶活性，解除NaHS对Nrf2的胞质锚定作用，促进Nrf2与抗氧化反应元件的结合^［15］。这与Li等^［16］的研究结果“Nrf2激活可降低MDA水平”一致。

综上所述，本研究揭示了H₂S通过“双轨调控”发挥脑保护作用的新机制：一方面抑制JNK/P38MAPK通路介导的氧化应激信号转导，另一方面激活Nrf2/ARE抗氧化防御系统。这种多靶点干预模式为缺血性脑卒中的治疗提供了新思路。值得关注的是，H₂S对Erk1/2通路的选择性调控机制仍需深入研究，其在不同脑区的浓度梯度效应也有待进一步探索。未来可结合蛋白质组学技术，全面解析H₂S调控的氧化应激相关信号网络，为H₂S作为脑保护剂的临床转化提供更坚实的实验依据。

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基金资助

湖南省自然科学基金(2024JJ5600)

国家自然科学基金青年基金(81501023)