帕金森病动物模型的研究进展

Research advances in animal models of Parkinson disease

摘要

帕金森病（PD）主要影响中枢神经系统的运动功能。PD的发病机制复杂，且缺乏有效的治疗方法，一直是神经科学的研究热点。近年来，PD的动物模型研究取得了显著进展。神经毒素模型可诱导多巴胺神经元损伤，常用于神经保护药物筛选，但未能完全重现PD的病理特征。转基因模型有助于发现潜在的治疗靶点，但缺乏多巴胺神经元的明显退化这一特征。组合模型可以产生更多样的运动和非运动症状，更全面地模拟PD病理过程。α突触核蛋白诱导模型能出现明显的病理蛋白聚集，更接近PD的典型病理表现。新兴模型可在体外重现PD病理特征，助力于个性化治疗的发展。越来越多的研究表明，PD更可能是一种综合征，非运动症状的研究逐渐受到重视。对PD非运动症状动物模型的研究有望在疾病早期发现生物标志物，并为严重非运动症状提供治疗方法。该文综述了各种PD动物模型的优势和局限性，为研究人员提供参考，帮助他们根据实验目的选择合适的模型。同时，该文旨在为深入理解PD发病机制和开发新的治疗方法提供理论支持。

Abstract

Parkinson disease （PD） mainly affects the motor functions of the central nervous system， and due to its complex pathogenesis and a lack of effective therapies， it has always been a research hotspot in neuroscience. In recent years， significant progress has been made in the development of animal models for PD. Neurotoxin⁃induced models can cause dopaminergic neuronal injury and are often used for the screening of neuroprotective drugs， but they fail to fully represent the pathological features of PD. Transgenic models help to identify potential therapeutic targets， but with a lack of significant degeneration of dopaminergic neurons. Composite models can generate a wider range of motor and non⁃motor symptoms and comprehensively simulate the pathological process of PD. Models induced by α⁃synuclein can exhibit significant pathological protein aggregation， which closely resembles the typical pathological manifestations of PD. Emerging models can display the pathological features of PD in vitro and facilitate the development of individualized treatment. An increasing number of studies have shown that PD is more likely to be a syndrome， and the research on non⁃motor symptoms has gained more and more attention. Studies on animal models of non⁃motor symptoms have the potential to identify biomarkers in the early stage and provide therapies for severe non⁃motor symptoms. This article reviews the advantages and limitations of various animal models of PD， so as to provide a reference for researchers and help them select appropriate models based on experimental objectives. In addition， this article provides theoretical support for a deeper understanding of the pathogenesis of PD and the development of new therapies.

关键词

帕金森病 / 动物模型 / 研究进展

Key words

Parkinson disease / animal model / research advance

帕金森病（Parkinson disease， PD）目前的病因及确切发病机制尚不清楚，涉及多种因素的相互作用，包括α突触核蛋白（α⁃synuclein， α⁃Syn）的异常聚集、黑质多巴胺神经元的退化、遗传（如SNCA、LRRK2等基因）与环境因素（重金属、农药等）、线粒体功能障碍以及神经炎症等^［1］。PD的主要临床症状包括运动症状（运动迟缓、静止性震颤、肌强直和姿势步态异常等）和非运动症状（自主神经功能障碍、嗅觉障碍、便秘和快速眼动期睡眠行为障碍等）。

PD的病理特点以黑质纹状体变性和路易小体形成为主^［1］。尽管多巴胺能系统是PD发病的关键，但非多巴胺、非儿茶酚胺和非运动系统也参与其中。此外，早在黑质致密部（substantia nigra pars compacta， SNc）之前，神经变性已经影响到几个核团的神经元，如蓝斑、中缝核和迷走神经背侧运动核（dorsal nucleus of vagus nerve， DMV），这在一定程度上解释了早期发生的非运动性症状^［2］。

迄今为止，PD相关的任何一种动物模型，均尚未能完全复制出PD在人脑内的病理状态以及发病后的运动特征。为了更深入了解PD的发病机制，针对不同实验目的选择实验模型，并进一步加强对PD的防治诊断及病理特征的研究，本综述总结了近些年来的动物模型的制备方法及其优缺点。以期能在疾病早期对PD做出诊断，并加以控制^［3］。

1 神经毒素和化合物模型

基于神经毒素的模型可诱导黑质纹状体多巴胺神经元的快速变性，模拟散发性PD。引入1⁃甲基⁃4⁃苯基⁃1，2，3，6⁃四氢吡啶（1⁃methyl⁃4⁃phenyl⁃1，2，3，6⁃tetrahydropyridine， MPTP）、6⁃羟基多巴胺（6⁃hydroxydopamine， 6⁃OHDA）、鱼藤酮（rotenone， RT）、百草枯（paraquat， PQ）、代森锰（maneb， MB）等^［4］，可以建立基于神经毒素的模型。此外，脂多糖（lipopolysaccharide， LPS）诱导的免疫模型也被用于研究PD的神经炎症机制。随着神经毒素的加入，会产生氧化应激，进一步导致多巴胺神经元群体的细胞死亡。然而，神经毒素模型的主要缺点是缺乏PD的主要病理标志：路易小体的形成。尽管存在局限性，神经毒素模型对了解PD的疾病过程和治疗靶点做出了重大贡献^［5］。

1.1 MPTP

MPTP是目前使用最多的神经毒素之一，该化合物本身没有毒性，是一种亲脂分子，能穿过血脑屏障。系统给药后，转化为1⁃甲基⁃4⁃苯基吡啶（MPP⁺），在突触体囊泡中积累，直至超过阈值，可导致SNc和纹状体中黑质纹状体多巴胺神经元发生细胞死亡^［6］。非人类灵长类动物模型一般仅用于临床前评估。小鼠MPTP模型是更实用和更容易获得的选择。对MPTP中毒最敏感的小鼠品系是C57 BL/6。此外，为了获得最佳且可重复的PD结果，必须从相同来源获得≥8周龄、平均体重22 g和相同小鼠品系的同性别小鼠^［7］。关于给药部位，许多研究认为腹膜内途径是理想的非运动症状模型之一，因为通过该途径给药后，会出现显著的运动功能损害，并可诱导出多巴胺神经元损伤。啮齿类动物鼻内给药MPTP可导致其短暂性嗅觉障碍，且暴露于MPTP可减少肠道多巴胺神经元的数量，并引起胃肠道功能障碍^［8］。关于腹膜内注射MPTP时是否出现路易小体样胞质包涵体，存在相互矛盾的报道，低剂量MPTP可能不足以促进路易小体的形成^［9］。

1.2 6⁃OHDA

6⁃OHDA是另一种广泛应用于实验动物模型中诱导PD的神经毒素，不能穿透血脑屏障。6⁃OHDA是一种高度可氧化的多巴胺类似物，可被多巴胺转运蛋白捕获，进而导致SNc中多巴胺神经元的选择性损伤。6⁃OHDA注射至靶点后经历快速的非酶自动氧化，并产生活性氧来诱导产生氧化应激，但6⁃OHDA的细胞毒性机制尚未完全了解，且该模型不伴有α⁃Syn聚集或路易小体样包涵体的形成。6⁃OHDA注射到纹状体中会破坏纹状体中的轴突终末，随后SNc中的多巴胺神经元会发生可逆性变性，症状相对较轻，进展缓慢。然而，6⁃OHDA注射到内侧前脑束和SNc中，却能导致快速和大量的多巴胺神经元变性，从而发生严重的症状。因此，应在明确的依据下选择实验所用的靶点^［5］。

因为双侧损毁会造成严重的运动障碍甚至死亡，所以6⁃OHDA大鼠单侧损毁模型使用较多，该模型主要用于药物筛选，如神经保护剂等的快速研究^［10］。在6⁃OHDA处理的大鼠模型中，睡眠期间肌肉张力增加，这提示该模型存在快速眼动睡眠期行为障碍（rapid⁃eye⁃movement sleep behavior disorder， RBD）样表型。在该模型中，RBD相关区域没有明显的病理改变，相比之下，SNc中酪氨酸羟化酶阳性神经元数量减少了95%以上^［8］。此外，在采用双侧颈总动脉结扎模拟典型神经毒素6⁃OHDA诱导的PD大鼠模型中发现，慢性脑低灌注导致神经鞘磷脂在前额叶皮质中的积聚，通过干扰鞘磷脂代谢加重了6⁃OHDA损伤大鼠的PD痴呆样症状和病理^［11］。

1.3 农药

农药暴露与PD的发展高度相关，并对PD发病有显著影响。流行病学研究发现，在农田工作和接触农药与PD发病风险增加呈正相关。RT、PQ、MB常被用作神经毒素，用于制备PD动物模型^［9］。

1.3.1 RT

RT全身给药（皮下、腹膜内、口服或脑内）后，亲脂性使RT能够穿过血脑屏障，并扩散穿过神经元细胞膜，抑制线粒体复合物Ⅰ和蛋白酶体活性，进一步诱导氧化应激和α⁃Syn积累。到目前为止，通过新型递送载体引入的低剂量RT连续给药约30 d已被证明是一种良好的RT研究模型，具有降低动物病死率和稳定的运动障碍表现。此外，在SNc中给予RT也可观察到嗅觉障碍，长期给大鼠低剂量RT后，α⁃Syn主要聚集在小肠肌肠神经节，给药6个月后小肠神经元数量减少，胃肠道运动减弱。在皮下注射RT的大鼠模型中，可观察到胃排空时间变长，粪便频率一过性减少，但未见病理性α⁃Syn积累^［8］。

1.3.2 PQ和MB

PQ是一种季铵盐类除草剂，通过改变谷胱甘肽和硫氧还蛋白的氧化还原循环，从而损害细胞保护自身免受氧化应激的能力。研究证实，PQ在小鼠／大鼠模型中，具有破坏黑质多巴胺神经元的能力。此外，PQ毒性的一个重要特征是对SNc多巴胺神经元表现出高选择性，多次注射后可导致多巴胺神经元几乎50%的损失。该研究还证明了老年小鼠／大鼠对该农药表现出更强的耐受性。长期服用PQ会导致慢性神经变性和多巴胺消耗，这可以用于研究PD临床前阶段。PQ模型的一个特殊特征是可以与MB联合使用，成年小鼠同时暴露于这两种化学物质会导致明显的多巴胺纤维丢失、多巴胺转化改变和运动能力降低^［9］。

1.4 LPS

在PD患者的大脑中，可发现密集的反应性小胶质细胞和星形胶质细胞，并伴有促炎细胞因子的增加，提示神经炎症可能在发病机制中起关键作用。LPS是一种强大的促炎原，是革兰氏阴性菌外膜的主要成分。LPS能够激活肠道和中枢神经系统中的Toll样受体4（Toll⁃like receptor 4， TLR4）信号通路，从而引发炎症反应^［12］。在肠道中，LPS首先被血清中的LPS结合蛋白识别，并传递给CD14，随后被转导给TLR4/MD⁃2复合物^［13］。这一过程激活了两条主要的信号通路：一是髓样分化因子88依赖通路，通过激活核因子κB，促进炎症因子的产生；二是TIR结构域含有蛋白接头因子依赖通路，通过激活干扰素调节因子3促进Ⅰ型干扰素的表达^［13］。类似地，在中枢神经系统中，LPS能够穿过受损的血脑屏障或通过某些转运机制进入脑组织，并被小胶质细胞或星形胶质细胞表面TLR4/MD⁃2复合物识别。LPS激活这些细胞中的TLR4后，同样会启动髓样分化因子88依赖通路和TIR结构域含有蛋白接头因子依赖通路，引发炎症反应^［14］。此外，LPS诱导的髓样分化因子88依赖通路还会调节细胞代谢，促进糖酵解和脂肪酸合成，为炎症因子的产生提供能量和物质基础，从而进一步加剧炎症反应^［12］。在大鼠纹状体内和神经内注射LPS，可导致SNc中多巴胺在1个月内发生严重的神经退行性病变，纹状体多巴胺神经元减少，发生运动障碍，且使用老年大鼠可增加表型的严重程度。通过腹腔注射给小鼠全身注射LPS可导致多巴胺神经元丢失、运动缺陷和α⁃Syn积累。通过鼻腔途径给药LPS在小鼠中，在SNc中可见约50%的多巴胺神经元丢失，并伴随着纹状体多巴胺数量减少。此外，还可以通过双侧给药来增加该表型的严重程度。因此，有必要利用LPS、凝血酶原、神经黑色素等形成的PD相关免疫模型，了解这些物质对黑质纹状体系统变性的潜在作用，以帮助开发新的PD 治疗方法^{［15⁃16］}。

神经毒素及化合物动物模型相关情况汇总见表1^{［17⁃18］}。

2 转基因遗传模型

许多基因已被确定为PD发病的危险因素，以及一些特发性PD的特征相关因素。在动物中，这些基因中的大多数都可以模拟特发性PD的一些特征，如路易小体形成，以及溶酶体和线粒体功能障碍。其中最密切相关的基因是SNCA基因，编码α⁃Syn，与遗传性和散发性PD均有关^［5］。与α⁃Syn编码异常或α⁃Syn清除功能受损相关的基因均可导致PD，后者包括与自噬–溶酶系统缺陷、泛素酶系统缺陷和线粒体功能障碍相关的基因。这些都有助于建立和理解遗传性PD的分子机制。虽然在PD中可观察到的遗传和突变相当少，仅占诊断病例的10%，但具有突变基因的动物模型非常重要，因为这些基因代表了潜在的治疗靶点^［7］。然而，遗传模型的主要缺陷之一是未能产生足够的多巴胺神经元损失。

基因编辑包括外源突变基因的转基因、同源基因敲除、效应基因敲除、敲低或基因沉默，通过过表达、消除或修饰基因产物来改变基因功能，以产生所需的性状。根据这些PD相关基因构建的遗传缺陷动物模型，可以复制PD的致病分子途径，准确反映PD的发病机制，再现PD的病理特征，对PD的研究具有重要意义^［19］。

2.1 <italic>SNCA</italic>缺陷模型

2.1.1 <italic>SNCA</italic>小鼠缺陷模型

最常用的是SNCA A53T和SNCA A30P 转基因小鼠。与SNCA A30P 转基因小鼠相比，SNCA A53T转基因小鼠α⁃Syn的病理表现更突出，神经退行性病变更严重，运动障碍更明显。在非运动症状方面，SNCA A53T转基因小鼠可表现为异常睡眠和嗅觉功能障碍。在朊病毒启动子下，胃肠道运动在3个月时减弱，6个月时表现出气味辨别和气味检测的缺陷，这表明可能是运动症状前胃肠道功能障碍的可行模型^［20］。在Thy1启动子下，3～5月龄时可出现嗅球中α⁃Syn含量低的现象，4月龄时可出现焦虑，9～10月龄时可出现睡眠障碍，12月龄时可出现结肠功能障碍。该模型适用于测试将疾病进展从前驱期减缓到运动期的治疗方法，以及测试对前驱症状的干预对运动症状发展的影响^［21］。内源性α⁃Syn缺失背景下的野生型人类SNCA BAC转基因雄性小鼠可表现出便秘样表型。SNCA A53T α⁃Syn BAC转基因小鼠表现出RBD样表型和嗅觉障碍，在无运动症状的情况下，SNc中酪氨酸羟化酶阳性神经元的数量减少了18%。这种表型表明，这是一个前驱PD小鼠模型^［22］。然而，除了上述SNCA A53T α⁃Syn BAC转基因小鼠外，尚无基于α⁃Syn的遗传动物模型被报道表现出RBD。在大鼠模型中，野生型α⁃Syn BAC转基因大鼠在3个月时出现嗅觉功能障碍，6个月时纹状体多巴胺含量下降30%，16个月时运动表型下降。该模型也表现出类似焦虑的行为^［8］。SNCA A30P转基因小鼠可表现为视网膜和嗅球异常以及焦虑等。SNCA转基因小鼠在反映α⁃Syn聚集和α⁃Syn异常折叠的毒性方面具有显著优势。通过调节基因载体滴度，SNCA转基因小鼠也可用于评价多巴胺神经元疾病的进展，以及研究神经损伤的内源性代偿机制^［19］。以SNCA为靶点的基因治疗是PD的治疗途径之一。反义寡核苷酸是一种潜在的靶向SNCA的基因疗法，其治疗效果已在SNCA缺陷模型中得到验证^［19］。

2.1.2 果蝇模型

在果蝇模型中，SNCA E46K、SNCA H50Q、SNCA G51D和SNCA A53T转基因的果蝇可表现出运动障碍，SNCA E46K转基因果蝇可表现出明显的神经毒性，是异常α⁃Syn编码的良好模型。果蝇中不同的SNCA突变体在性状上存在差异，这些突变体是否具有不同的致病性还有待进一步研究。

2.2 α⁃Syn清除受损：自噬–溶酶体途径缺陷

自噬–溶酶体途径是清除细胞内受损和功能失调的细胞器以及错误折叠蛋白质的主要机制。在PD中，这一途径的功能障碍导致α⁃Syn及其他有害物质的积累，从而推动神经退行性病变的发生^［23］。此外，溶酶体的酸化对于其水解酶的活性至关重要，而在PD中溶酶体pH值升高会降低这些酶的活性，进而导致蛋白质降解功能受损^［24］。再者，溶酶体功能障碍还会影响细胞内钙离子的稳态，从而对细胞信号传导以及导致细胞死亡的相关通路产生影响^［23］。由于神经元具有终末分化的特性以及高度极化的形态，特别容易受到自噬–溶酶体功能缺陷所造成的干扰，尤其是在大脑衰老的过程中^［23］。总之，自噬功能障碍是PD发病的主要因素。

2.2.1 <italic>LRRK2</italic>

LRRK2编码富亮氨酸重复激酶2。LRRK2 G2019S 转基因小鼠可表现出显著增强的神经毒性和PD表型年龄依赖性。LRRK2 G2019S/SNCA A53T双转基因小鼠α⁃Syn积累加速，提示LRRK2突变降低了酶活性，影响了α⁃Syn的清除效率^［25］。在非运动症状方面，LRRK2 R1441C敲入小鼠在8～10月龄时出现焦虑样行为，在18～20月龄时出现运动和嗅觉功能障碍。在LRRK2 R1441G BAC转基因小鼠中，胃肠道功能障碍在6个月时开始出现，随后在16个月时出现轻度运动障碍，但未观察到其他非运动表型。

LRRK2 R1441C和LRRK2 G2019S转基因大鼠出现进行性运动和认知缺陷，只有LRRK2 R1411C模型出现步态异常，两种模型均未出现SNc多巴胺神经元丢失或神经病理^［26］。

哺乳动物多巴胺神经元代偿机制复杂，LRRK2⁃PD的临床症状和神经病理与散发性PD相似。正如临床LRRK2⁃PD病例具有高度异质性一样，一些LRRK2缺陷模型也缺乏明显的PD症状。与其他遗传性PD相比，LRRK2⁃PD发病较晚，因其复杂的代偿机制，早期仅表现为突触损伤。果蝇和秀丽隐杆线虫的简单多巴胺系统可能具有更稳定的性状表达。LRRK2 G2019S和LRRK2 R1441C秀丽隐杆线虫，可出现多巴胺神经元变性、多巴胺水平降低和运动功能障碍，且LRRK2突变介导的神经变性依赖于GTP酶或激酶活性^［27］。此外，LRRK2 G2019S 转基因果蝇表现出丰富的PD表型，并且对RT敏感，这可能为神经毒素联合建模提供思路。

2.2.2 <italic>VPS35</italic>

VPS35编码液泡蛋白分离⁃35，是逆转录酶复合体的重要组成部分，在质膜和内溶酶体水平上控制跨膜蛋白的稳态。VPS35 D620N导致溶酶体损伤，自噬导致PD，VPS35缺陷大鼠和小鼠表现为多巴胺神经元病变。VPS35 D620N同源基因敲除小鼠线粒体异常导致运动缺陷。VPS35 D620N转基因小鼠显示溶酶体形态改变，却未出现运动症状，但两者对PD相关细胞应激的敏感性均增加^［28］。但VPS35突变体在PD中的作用有待进一步研究。

2.2.3 <italic>ATP13a2</italic>

ATP13a2编码跨膜溶酶体p5型ATP酶，参与溶酶体膜上二价金属阳离子和多胺的转运，维持重金属离子、蛋白质和多胺的稳态，并促进过量α⁃Syn和多胺的消除。ATP13a2缺陷动物表现运动和认知功能障碍、情绪异常、脑内路易小体和α⁃Syn积聚，但未观察到多巴胺神经元损伤。无论是ATP13a2效应基因敲除／h⁃SNCA转基因小鼠，还是ATP13a2效应基因敲除小鼠，在嗅球中注射α⁃Syn均未表现出更严重的病理改变。ATP13a2效应基因敲除／SNCAA30P转基因小鼠的运动缺陷与ATP13a2缺乏小鼠相比，与α⁃Syn过表达小鼠更相似，提示ATP13a2缺乏导致的异常α⁃Syn清除是主要的病理机制^［29］。

2.2.4 <italic>GBA</italic>

GBA编码葡萄糖脑苷脂酶。GBA突变导致葡萄糖脑苷脂酶活性降低，从而削弱溶酶体的效率，进一步阻碍病理性α⁃Syn的降解。GBA的纯合突变和杂合突变均可导致戈谢病，这是一种与PD密切相关的糖脂代谢家族性疾病^［30］。GBA N370S和GBA L444P转基因果蝇均表现出年龄依赖性运动障碍和多巴胺神经元丢失，并伴有葡萄糖脑苷脂酶4活性降低和内质网应激增强^［31］。虽然GBA N370S转基因小鼠未出现异常，但MPTP处理的GBA L444P转基因小鼠和GBA基因沉默／h⁃SNCA转基因小鼠均出现神经变性和SNc中α⁃Syn聚集。MPTP处理的GBA L444P转基因小鼠也表现出严重的线粒体缺陷、蛋白酶体活性降低和自噬抑制，这表明GBA缺乏症增加了多巴胺神经元的易损性，并加速PD的进展^［32］。

2.3 α⁃Syn清除受损：泛素–蛋白酶体系统异常

泛素–蛋白酶体系统（ubiquitin⁃proteasome system， UPS）是一种依赖ATP的蛋白质降解机制，具有高度的底物特异性，主要负责细胞内老化、受损和错误折叠蛋白质的降解，从而维持细胞内蛋白质稳态^［33］。UPS功能障碍与PD的发病机制密切相关。主要表现为：首先，当UPS功能受损时，α⁃Syn无法被有效降解，导致其异常积累，并形成路易小体。其次，UPS功能障碍会影响线粒体的质量控制，导致线粒体损伤和功能障碍^［34］。再次，线粒体功能障碍会进一步加剧细胞内的氧化应激，促进 α⁃Syn 的聚集。此外，UPS功能障碍还会引发神经炎症，激活小胶质细胞并导致促炎细胞因子的释放，从而进一步损伤神经元^［34］。总之，UPS功能障碍被认为是PD发病机制中的关键环节之一，这为疾病的治疗提供了潜在的靶点。

2.3.1 <italic>Parkin</italic>

Parkin编码一种称为Parkin的泛素⁃ e3连接酶，通过催化泛素向蛋白质底物的转移，来调节线粒体自噬。异常的Parkin表达可破坏UPS稳态，增强细胞底物蛋白泛素化，产生细胞毒性，损害多巴胺神经元的正常功能。Parkin基因的缺失和突变都与PD的发病机制有关。然而，Parkin效应基因敲除啮齿动物并未表现出明显的PD表型^［7］。只有Parkin外显子3效应基因敲除小鼠，表现出多巴胺转运蛋白和囊泡单胺转运蛋白降低，这可能与啮齿动物的保护机制有关^［35］。果蝇的神经系统简单且对线粒体缺陷敏感，Parkin缺陷导致果蝇线粒体老化、线粒体网络破裂、线粒体自噬减少。Parkin效应基因敲除果蝇寿命缩短、严重运动缺陷和雄性不育明显超出PD的范畴。低等脊椎动物斑马鱼被认为是最好的Parkin效应基因敲除模型。Parkin外显子9效应基因敲除斑马鱼表现出明显的多巴胺神经元损伤，对MPP⁺的敏感性增加，线粒体呼吸链复合物Ⅰ活性下降，与临床PD患者相似，但仍未表现出运动症状。与Parkin效应基因敲除模型相比，Parkin R275W、Parkin G311X、Parkin T240R转基因果蝇和Parkin G311X转基因小鼠等Parkin转基因模型是更好的选择，因为这些模型都可表现出类似PD的退化缺陷^［19］。

2.3.2 泛素羧基末端水解酶L1

泛素羧基末端水解酶L1（ubiquitin carboxyl⁃terminal hydrolase L1， UCHL1）基因编码UCHL1蛋白，该蛋白在大脑中高度表达，主要功能是调节神经元内游离泛素的水平^［36］。与PD相关的常见变异包括UCHL1 I93M、UCHL1 S18Y和UCHL1 E7A。携带UCHL1 I93M突变的小鼠可导致UPS异常，进而导致泛素显著积累，这可能会进一步引发神经元损伤和退化^［37］。UCHL1同源基因敲除小鼠可表现为早发性、选择性和进行性皮质脊髓运动神经元退化^［38］。然而，有些UCHL1转基因模型并未表现出多巴胺损伤，反而能有效抑制MPTP诱导的多巴胺神经毒性，显示出神经保护能力^［39］。Buneeva等^［40］提出了关于UCHL1在PD中作用的新观点，认为UCHL1的作用取决于其催化活性与众多与活性无关的蛋白质–蛋白质相互作用的平衡。此外，UCHL1的S⁃亚硝基化修饰会破坏其结构稳定性，并加重PD小鼠模型中α⁃Syn的积累。目前，UCHL1与PD之间的关系仍然存在争议，这在一定程度上限制了UCHL1缺失模型的应用^［41］。

2.3.3 F⁃盒蛋白7

F⁃盒蛋白7（F⁃box protein 7， FBXO7）基因编码F⁃盒蛋白家族成员FBXO7，是SCF泛素连接酶复合体的组成部分，参与多种底物的泛素化，并调节线粒体自噬、细胞生长和蛋白酶体功能。FBXO7功能障碍可能会增加线粒体烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化还原指数，降低电子传递链中的复合体Ⅰ活性^［42］。这会导致线粒体膜电位和ATP含量降低，同时增加细胞质中活性氧的产生。

FBXO7第四外显子效应基因敲除小鼠表现出纹状体多巴胺释放异常、运动障碍、蛋白酶体活性降低以及核糖体感应通路抑制减少。这些变化可能会阻碍线粒体自噬，并增加细胞应激^［43］。然而，FBXO7缺陷会导致小鼠发育障碍和早亡。此外，尽管黑质细胞的丢失是不可逆的，但由于代偿机制，纹状体多巴胺纤维的再生几乎完全恢复^［44］。这些情况，加上FBXO7缺陷比较罕见，因此，很少用到FBXO7敲除模型。

2.4 线粒体相关基因缺陷模型

线粒体在神经细胞的功能活动中起着核心作用。线粒体合成、线粒体自噬、活性氧释放、钙离子运输、神经炎症等分子事件均与线粒体脱落直接或间接相关。许多PD致病基因，如SNCA、LRRK2、VPS35和GBA，均与线粒体功能障碍有关。在本节中，只讨论由编码产物表达，并作用于线粒体的基因构建的基因缺陷模型，如PINK1、DJ⁃1、CHCHD2和HTRA2。

2.4.1 <italic>PINK1</italic>

PINK1编码PTEN诱导的激酶1，是一种主要存在于细胞线粒体和溶质的神经保护激酶。PINK1缺陷小鼠的表型与Parkin效应基因敲除模型相似，未出现明显的多巴胺神经元损伤。PINK1外显子4～7效应基因敲除小鼠在同一模型中表现出多巴胺释放减少和早发性运动和感觉障碍，如肢体缺陷、发声、发音和吞咽受损。PINK1效应基因敲除大鼠表现出明显的运动症状，尤其是口腔和咽喉肌肉的异常运动^［45］。这些运动症状与线粒体损伤的积累有关。PINK1效应基因敲除对线粒体变化特别敏感，表现为雄性不育、凋亡性肌肉变性、线粒体形态异常、昼夜节律改变以及对各种应激（包括氧化应激）的敏感性增加。PINK1缺陷模型的运动症状与线粒体神经元损伤导致的能量供应不足有关。PINK1效应基因敲除果蝇表现出明显的电生理异常。然而，PINK1和Parkin效应基因敲除不影响果蝇和小鼠的线粒体自噬^［46］。在灵长类动物模型中，单独丢失PINK1不会改变大脑中线粒体蛋白和形态，但会导致神经元变性。PINK1基因编辑猴模型仅导致黑质中约40%的多巴胺神经元丢失，不足以表现出PD症状。然而，PINK1/DJ⁃1 co⁃基因编辑猴模型，则可失去超过64%的多巴胺神经元，并表现出典型的PD症状^［47］。

2.4.2 <italic>DJ⁃1</italic>

DJ⁃1编码DJ⁃1蛋白，属于肽酶C56家族，作为氧化应激传感器和抗氧化剂广泛表达于细胞质、细胞核和线粒体中。DJ⁃1通常被认为是一种神经元保护因子，可以增加线粒体解偶联蛋白UCP4和UCP5的表达，降低线粒体膜电位，抑制活性氧的产生，优化线粒体功能。DJ⁃1的错义突变，包括DJ⁃1 M26I、DJ⁃1 L166P和DJ⁃1 D149A，可引起多巴胺神经病变^［48］。DJ⁃1缺陷大鼠模型最早和最显著的症状是运动功能障碍，主要是口腔和肢体运动功能障碍，随后发生进行性多巴胺神经元丢失。DJ⁃1效应基因敲除果蝇和斑马鱼的多巴胺神经元均未表现出明显损伤，但表现出异常的运动性和对促氧化剂的高敏感性。DJ⁃1效应基因敲除斑马鱼的蛋白质组学分析显示，DJ⁃1缺乏会影响线粒体代谢、自噬、应激反应和炎症蛋白^［49］。果蝇DJ⁃1缺乏导致氨基酸代谢、碳水化合物代谢、糖酵解、三羧酸循环和尿素循环活性的变化^［50］。

2.4.3 <italic>HTRA2</italic>

HTRA2编码丝氨酸蛋白酶，存在于线粒体膜间隙中，并监测蛋白质折叠。当受到外界信号刺激时，HTRA2被释放到线粒体基质中，并与凋亡和自噬信号通路相互作用，调节细胞死亡。HTRA2缺陷模型（包括HTRA2效应基因敲除小鼠和HTRA2 S276C转基因小鼠）最显著的特征是错误折叠蛋白质的聚集，这也证明了HTRA2在清除异常蛋白质中的重要作用^［51］。由于脑内线粒体中错误折叠蛋白质的积累，HTRA2效应基因敲除小鼠出现线粒体功能障碍，活性氧水平升高，C/EBP同源蛋白表达增强，对线粒体应激的敏感性增加，出现多巴胺神经元丢失和运动障碍^［19］。

2.4.4 <italic>CHCHD2</italic>

CHCHD2编码coiled⁃helix⁃coiled⁃helix结构域2，主要位于线粒体膜间隙，其功能与线粒体嵴的形成密切相关。CHCHD2缺乏会影响线粒体嵴结构，导致细胞凋亡和氧化磷酸化。CHCHD2效应基因敲除果蝇和小鼠表现出线粒体结构异常和氧呼吸受损，导致慢性氧化应激、运动功能障碍、多巴胺神经元凋亡等PD表现^［52］。

转基因动物模型相关情况汇总见表2。

3 α⁃Syn模型

α⁃Syn是突触小泡循环的重要蛋白，其异常聚集可能与PD的发生有关。α⁃Syn模型的基础是靶向大鼠、小鼠或非人灵长类动物的黑质或纹状体，并促进α⁃Syn的过度表达和聚集，形成路易小体和路易轴突包涵体。α⁃Syn的表达和扩散水平决定了疾病的严重程度，并引发了可靠的运动障碍和非运动症状。α⁃Syn聚集的倾向基于许多因素，如翻译后修饰、基因复制和三倍体驱动的过度表达、单点突变和环境变化。有几种方法可以促进α⁃Syn聚集：①基因修饰；②蛋白酶体和溶酶体抑制；③α⁃Syn预形成的纤维（preformed fibrils， PFF）；④AVV腺病毒载体。

3.1 PFF诱导模型

PFF首先由单体重组α⁃Syn生成，PFF经超声破碎后，可磷酸化为内源性α⁃Syn而进入病理状态。PFF是错误折叠的蛋白质的聚集体，被认为是PD发展的主要因素。PFF诱导的α⁃Syn动物模型是一种用于研究α⁃Syn的PFF样聚集体对脑的影响的动物模型，多用于研究PD的病因、发病机制和进展^［71］。此外，该模型还用于评估PD的潜在治疗策略^［7］。然而，PFF的注射部位在α⁃Syn的接种和扩散方面具有重要意义。用PFF接种啮齿动物肠道会导致中脑多巴胺神经元丢失、α⁃Syn组织病理学和运动功能障碍^［5］。

3.2 RAAV腺病毒载体

重组腺相关病毒（recombination adeno⁃associated virus， RAAV）载体可作为携带特定基因的载体，大多数情况下，不会整合到宿主DNA中，因此不会因随机／非靶标插入而导致基因缺陷。与仅传播几毫米的慢病毒相比，RAAV颗粒比慢病毒小，并且在立体定向递送后可以传播到更大的区域。因较小的体积，还可以在注射体积中产生更高的病毒浓度或滴度。RAAV可用于过表达野生型或突变型（如A53T或A30P）α⁃Syn。黑质内局部注射RAAV可感染黑质多巴胺神经元，此种模型促进了α⁃Syn的病理，可以帮助对α⁃Syn毒性的治疗。此外，病毒介导的过表达也已被用于研究身体优先型PD的反序列传播模式。靶向病毒载体介导的人类突变体A53T⁃α⁃syn在蓝斑神经元中过度表达，在9周内可引发进行性去甲肾上腺素能神经元变性，同时导致轴突内广泛表达异构蛋白。该模型有望成为研究α⁃Syn介导的去甲肾上腺素能变性的动物模型中具有代表性的“异构蛋白”相关模型^［71］。

3.3 乳胞素

天然化合物如放线杆菌产生的乳胞素不可逆转地阻止蛋白酶体的蛋白分解活性，广泛用于蛋白酶体抑制剂模型^［18］。该模型基于使用蛋白酶体抑制剂来扰乱蛋白质稳态，引起并触发黑质多巴胺能神经退行性病变^［72］。啮齿动物因具有高度复杂的神经系统以及便于评估的行为特征，适合作为模式生物来研究蛋白酶体抑制剂的多巴胺能神经毒性。此外，使用转基因小鼠揭示体内蛋白酶体抑制诱导神经变性的新机制。非人灵长类动物是代表人类中枢神经系统的近似物，对于研究致病机制和在进入临床试验之前验证有希望的治疗药物都是必不可少的^［72］。

4 非运动症状模型

PD以黑质多巴胺神经元的丧失和随后的运动症状为特征，但各种非运动症状往往先于运动症状。Braak的肠道优先假说认为α⁃Syn病变可能起源于肠道神经系统，并通过副交感和交感神经连接传播到DMV^［73］。这一假说是基于散发性PD的脑病理分期，其最初的病理是在DMV和嗅核中观察到的。非运动症状作为识别PD前驱期患者的线索受到了广泛关注，这是实施疾病治疗的绝佳切入点。这些前驱的非运动症状主要包括嗅觉丧失、便秘和睡眠障碍。

4.1 肠道优先接种模型

肠道优先接种模型旨在重现沿着迷走神经和交感神经的病理学从肠道到大脑的传播。将PFF或富含路易小体的PD脑匀浆接种到胃肠道（如幽门和近端十二指肠），不仅会诱导迷走神经将注射物质转运到大脑中，而且还会植入内源性反同步蛋白。然而，长期随访的研究发现，异构蛋白积累的缺少，这可能与单次注入致病性反同步蛋白后被分解有关。且使用老年野生型啮齿动物似乎可以更好地概括体优先型PD，并且可能在临床上优化老年患者的诊断和治疗^［73］。

4.2 其他接种途径模型

除了肠道外，还有其他外周途径（肌内、静脉内、鼻内和舌内）。大多数研究采用M83转基因小鼠模型，该模型表达具有A53T突变的人类异构蛋白，纯合M83小鼠从8个月大开始出现运动缺陷^［74］。一些研究还使用表达由小鼠朊病毒蛋白启动子驱动的野生型人类反义蛋白的M20转基因小鼠，这些小鼠从6月龄起也会出现运动障碍。肌内注射较静脉注射以及口服诱导PD病理的效率更高^［75］。这些模型能够在明显疾病阶段（而不是前驱疾病阶段）对新型PD疗法进行更快速、更具成本效益的临床前测试。最近的研究重点是对运动前身体优先型PD进行建模，其特点是存在非运动障碍，且缺乏运动症状。

5 组合模型

PD的病理机制复杂，单一的动物模型往往难以全面模拟人类疾病的特征。近年来，组合模型的开发为研究PD提供了更接近人类病理的平台。将神经毒素应用于基因操纵的动物的组合模型已经开始使用，这些模型是基于一些遗传模型更容易受到神经毒素的影响而建立的。如MPTP在DJ⁃1基因敲除小鼠中比在野生型小鼠中诱导更多的神经元丢失。这样的实验可能有助于捕捉PD的多方面性质，并可能揭示与PD相关的基因突变^［4］。此外，通过将α⁃Syn PFF注射到小鼠脑内，并结合低剂量的MPTP处理，可以显著增强α⁃Syn的传播，增加蛋白酶K抵抗性纤维的形成，并导致黑质多巴胺神经元的死亡。这种组合模型不仅能够模拟PD的病理特征，还能在较短时间内用于测试抑制α⁃Syn传播的潜在治疗分子^［7］。

6 非人类灵长类动物模型

非人类灵长类动物在基因组成和生理功能方面与人类有着相似之处，能更好地帮助理解和洞察潜在的疾病机制，是进行临床前治疗评估的优越模型。但该模型的使用受到伦理问题、费用以及管理所需的精力和劳动力的限制。常用的非人类灵长类动物包括猕猴、狨猴、松鼠猴、狒狒和非洲绿猴。与其他动物模型类似，PD可以通过神经毒素（MPTP、6⁃OHDA等）或转基因干预在非人类灵长类动物中诱导。转基因干预包括注射编码α⁃Syn和LRRK2（常染色体显性基因）过表达的病毒载体，以及敲除或敲低PINK1、Parkin和DJ⁃1（常染色体隐性基因）的模型。非人类灵长类动物模型可表现出与人类相似的疾病症状（如舞蹈病或肌张力障碍）。除此之外，非人类灵长类动物还有与人类相似的睡眠模式和周期^［7］。在这些方面，与啮齿类动物相比，非人类灵长类动物是更好的动物模型。神经成像研究和分析表明，非人类灵长类动物模型是高度可信的，且与其他模型相比，只能在非人类灵长类动物中可观察到路易小体。

7 新兴模型

人类诱导多能干细胞（human induced pluripotent stem cell， hiPSC）技术为PD的研究和治疗提供了重要的平台。hiPSC技术能够从PD患者的体细胞中生成具有患者特异性的多能干细胞，进而分化为多巴胺神经元，且hiPSC衍生的多巴胺神经元能够表现出PD的典型病理特征。hiPSC诱导的模型不仅有助于研究PD的病理机制，还是大规模药物筛选的理想选择，可以帮助缩小潜在的药物靶点，以便在动物模型中进一步验证^［74］。研究表明，hiPSC衍生的多巴胺神经元在动物模型中能够存活并形成功能性连接，显著改善动物的运动功能，这为PD的细胞替代疗法提供了可能^［74］。此外，自体hiPSC衍生的细胞移植能够避免免疫排斥反应，为PD的个性化治疗提供了新的方向。然而，hiPSC的局限性是存在个体间的明显差异，且培育时间较长，更易发生突变。体细胞的直接神经转化技术可以解决上述问题。与hiPSC生成相比，直接神经元转换技术要快得多，大约3周的时间可从起始细胞产生诱导性神经细胞。但其也具有转化效率低、产生的细胞异质性、转化的细胞可能仍然保留起始体细胞的一些表观遗传记忆等局限性^［76］。

类器官模型是一种三维细胞培养系统，利用hiPSC进一步开发了中脑类器官，这些类器官能够模拟中脑的发育和功能，特别是多巴胺的生成，也为PD的病理研究提供了更接近人类生理的模型^［77］。中脑类器官可用于构建PD的遗传模型和毒素模型。如引入PINK1^［78］和GBA^［79］等基因突变，能够在中脑类器官中模拟PD的病理特征，并探索PD对神经元功能的影响。此外，中脑类器官还可用于药物筛选。Kim等^［80］的研究表明，通过使用一种富亮氨酸重复激酶2活性抑制剂（GSK2578215A）进行治疗，或者通过敲低硫氧还蛋白相互作用蛋白的表达，均可减少LRRK2 G2019S 突变的中脑类器官中α⁃Syn的积累。Jarazo等^［81］也发现，使用羟丙基⁃β⁃环糊精化合物进行治疗可改善PINK1和PRKN基因突变的中脑类器官中多巴胺神经元的分化。

Kim等^［80］开发了一种光遗传学辅助的α⁃Syn聚集诱导系统，通过将光敏蛋白引入神经元，实现了对神经元活动的精确控制。该系统还被用于研究PD中神经调控的潜力，能够进一步探索其对运动功能障碍的影响，为开发新型神经调控疗法提供了理论基础。此外，该系统可在PD的hiPSC⁃中脑多巴胺神经元和中脑类器官中快速诱导α⁃Syn聚集和毒性，以筛选出能够增强自噬清除病理α⁃Syn聚集的化合物^［81］。

8 小结与展望

目前，PD的发病机制仍不明确，不可逆性神经退行性病变仍无法有效缓解。现在还没有动物模型可以概括这一复杂疾病的所有方面。神经毒素诱导的动物模型仍然是研究的重要工具，能够模拟多巴胺神经元的退化和运动障碍。转基因模型通过模拟PD相关基因突变，为研究疾病机制提供了重要工具，也为发现潜在治疗靶点提供了分子基础。α⁃Syn模型可见明显的α⁃Syn聚集，对研究α⁃Syn传播机制及潜在治疗方法有独特优势。组合模型通过结合多种诱导因素，更全面地模拟PD的病理及运动特征。非运动症状模型有望在疾病前期发现有效的生物标志物及治疗方法，阻止疾病的进一步恶化。新兴模型如hiPSC、中脑类器官提供了更接近人类生理的病理模型，为个性化治疗提供了新的方向。未来的动物模型可以利用hiPSC和基因编辑技术，开发针对个体患者的PD模型，以更好地模拟患者的病理特征和药物反应。此外，还可以将神经毒素模型、转基因模型、类器官模型和光遗传学技术等相结合，更全面地模拟PD的复杂病理机制。

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基金资助

湖南省卫生健康委员会重点指导课题(C202303076574)

湖南省中医药管理局重点课题(A2023039)

株洲市科技局课题(2021⁃009)

湖南中医药高等专科学校附属第一医院优秀科研创新团队(B2021⁃003)

2022年湖南中医药大学校院联合基金项目(2022⁃44)