沙鞭PvAQP基因克隆及耐旱功能验证

Cloning and Drought Tolerance Functional Validation of PvAQP Gene in Psammochloa villosa (Poaceae)

摘要

为解析沙鞭（Psammochloa villosa）水通道蛋白（Aquaporin，AQP）基因AQP响应耐旱过程的功能和作用，利用三代全长转录组数据，采用RT-PCR技术克隆沙鞭AQP基因，对其进行生物信息学及干旱胁迫下表达模式和转基因烟草（Nicotiana tabacum）的耐旱分析。结果显示：（1）成功克隆到沙鞭AQP基因，命名为PvAQP（GenBank号：ON792207），其序列全长为867 bp，编码288个氨基酸，隶属疏水性蛋白。（2）PvAQP具有明显的跨膜结构，是一个跨膜蛋白，存在1个完整的MIP结构域。（3）PvAQP编码蛋白的二级结构主要由α-螺旋、不规则卷曲、延伸链和β-转角构成，三级结构主要由α-螺旋和不规则卷曲组成。（4）PvAQP无信号肽结构，无可能的糖基化位点，含有19个磷酸化位点。（5）亚细胞定位分析表明，PvAQP蛋白定位于细胞核中。（6）不同物种间AQP基因氨基酸序列同源性为95.34%，沙鞭与沙生针茅（Stipa caucasica）亲缘关系最近。（7）PvAQP基因表达具有组织特异性，根、茎、叶中的表达量存在较大差异。（8）随模拟干旱胁迫时间增加，转PvAQP基因型和野生型烟草中抗氧化酶（SOD、POD和CAT）活性及脯氨酸（PRO）含量呈先升高后降低趋势，转PvAQP基因型烟草中抗氧化酶活性及PRO含量更高；丙二醛（MDA）含量都呈上升趋势，且转PvAQP基因型烟草中MDA含量显著低于野生型（P<0.05）。研究结果表明，PvAQP基因可能参与了沙鞭的耐旱生理过程，为将来揭示沙鞭PvAQP基因响应耐旱分子机制提供了理论依据。

Abstract

In order to clarify the function and role of the AQP gene of Psammochloa villosa in response to drought tolerance， the AQP gene of P. villosa was cloned by using the three generations full transcriptome data and RT-PCR， and the bioinformatics and expression patterns of AQP gene under drought stress and drought tolerance in transgenic tobacco（Nicotiana tabacum） were analyzed， respectively. The results indicated that： （1）the AQP gene of P. villosa was successfully cloned， named PvAQP（GenBank number： ON792207）， CDS length of PvAQP was 867 bp， encoding 288 amino acids and belonging to hydrophobic protein. （2）PvAQP had obvious transmembrane structure with a complete MIP domain， which was a transmembrane protein. （3）The secondary structure of PvAQP encoded protein included α-helix， irregular curls， extended chains and β-fold， while the tertiary structure was mainly composed of α-helix and irregular curls. （4）PvAQP gene had no signal peptide structure， no glycosylation sites， and contained 19 phosphorylation sites. （5）Subcellular localization analysis showed that PvAQP protein was localized in the nucleus. （6）Among different species， the homology with amino acid sequences of PvAQP gene was 95.34%. P. villosa had the closest genetic relationship with Stipa caucasica. （7）The expression of PvAQP gene was tissue-specific， with significant differences in the roots， stems， and leaves of P. villosa. （8）With the increase of simulated drought-stress time， the activities of superoxide dismutase（SOD）， peroxidase（POD） and catalase（CAT）， and the content of proline（PRO） first increased and then decreased in transgenic tobacco and wild type tobacco. Compared with wild type tobacco， the express levels in the transgenic tobacco were higher， while the content of malondialdehyde（MDA） showed an increasing trend， and the content of MDA in transgenic PvAQP gene-type was significantly lower than that of wild type. The results suggested that PvAQP gene might be involved in the physiological process of drought tolerance within P. villosa， and provided the theoretical evidence for revealing the molecular mechanism of PvAQP gene responding to drought tolerancein the future.

Graphical abstract

关键词

沙鞭 / AQP基因 / 基因克隆 / 干旱胁迫 / 功能验证

Key words

Psammochloa villosa / AQP gene / gene cloning / drought stress / functional validation

水通道蛋白（Aquaporin，AQP）是生物体内广泛存在的一种具有典型跨膜结构域、可辅助水和小分子物质进行跨膜运输的膜内在蛋白^［1］。研究认为，植物水通道蛋白（AQPs）位于植物细胞的质膜和液泡上，具有高效且专一的水分跨膜双向运输功能，能够参与细胞伸长、种子萌发等多种生理过程^［2］，尤其在参与植物响应非生物胁迫中发挥重要作用^［3］。AQP通常以四聚体形式存在，每个单体主要由6个跨膜螺旋形成孔道，螺旋间由5个亲水短环的A-E相连，经折叠形成中心对称的“水漏 模型”，它们共同参与水分和小分子调节^［4］。自1993年Maurel等^［5］从拟南芥（Arabidopsis thaliana）中分离到第一个植物水通道蛋白AtTIP1；1以来，国内外学者相继在水稻（Oryza sativa）^［6］、玉米（Zea mays）^［7］、番茄（Solanum lycopersicum）^［8］等作物中鉴定到AQP基因，然而已有研究^［9］主要聚焦于AQP基因结构特征、表达模式及非生物胁迫中的调节等。张丹等^［10］研究发现，沙蒿（Artemisia ordosica）AQP基因随干旱胁迫强度提高呈现规律性变化，在根、茎、叶中表达均上调，且叶中表达量上调幅度最大，沙蒿AQP基因的结构特征及其表达模式均是其对干旱胁迫的一种适应。Ye等^［11］从沙棘（Hippophae rhamnoides）中鉴定到92个AQP基因，发现AQP基因在转录水平上表达降低，认为这些基因的关闭能够限制水分流失，达到维持细胞内水分平衡的作用，从而提高沙棘干旱胁迫下的耐受性。上述研究说明，植物AQP基因能够通过调节内环境的水分平衡来增强植物非生物胁迫条件下的耐逆性。

沙鞭（Psammochloa villosa）是一种主要分布于我国内蒙古高原及其毗邻沙区的多年生草本植物，隶属禾本科（Poaceae）针茅族（Stipeae）沙鞭属（Psammochloa）。沙鞭有较强的耐旱、耐寒特性，根状茎发达，对流动沙丘生态适应性极强；籽实富含粗蛋白和粗纤维，可作为沙漠地区的优质牧草，具有较高的饲用价值^［12］。迄今为止，国内外学者对沙鞭的研究主要集中于形态特征^［13-14］、种质资源^［15］、生理特性^［16］、地理分布^［17］、遗传结构^［18-19］、染色体核型^［20］、SSR位点特征及引物开发^［21］、内参基因筛选与验证^［22］、基因克隆与功能验证^［23-24］及种群空间分布格局^［25-26］等领域。其中，张雨等^［24］基于沙鞭三代转录组数据，采用RT-PCR技术克隆到DREB基因，分析了其表达模式、功能和作用，结果发现，PvDREB基因在沙鞭响应干旱胁迫过程中具有重要作用。然而，目前关于西北地区主要优势种和建群种的荒漠植物沙鞭AQP基因耐旱功能的研究鲜见报道。据此，本研究利用三代全长转录组数据，采用RT-PCR技术克隆沙鞭AQP基因，并对其进行生物信息学、亚细胞定位和表达特性分析以及功能验证，以期探究PvAQP基因调控沙鞭耐旱的功能和作用，为系统解析沙鞭耐旱的分子机制奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1　试验材料

本研究材料为青海师范大学系统与进化植物学实验室前期筛选的抗旱性最强的沙鞭居群P16幼苗，成熟种子采自内蒙古阿拉善左旗乌力吉苏木（40°37´N，104°35´E，海拔1 276 m）；本氏烟草（Nicotiana benthamiana）为青海省青藏高原生物多样性形成机制与综合利用重点实验室保存；RNAprep Pure植物总RNA提取试剂盒、pMD19-T载体、限制性内切酶EcoR I、限制性内切酶BamHⅠ、T4 DNA连接酶、TB Green^® Premix Ex Taq^TMⅡ（Tli RNaseH Plus）和PrimeScript™ RT reagent Kit with gDNA Eraser购于宝日医生物技术（北京）有限公司；质粒小提试剂盒和SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒购于天根生化科技（北京）有限公司；PCAMBIA2300载体和农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）LBA4404购于博瑞德生物科技有限公司；超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）、脯氨酸（PRO）和丙二醛（MDA）试剂购于苏州科铭生物技术有限公司。

1.2　试验方法

1.2.1　总RNA提取及cDNA合成

依据RNAprep Pure提取试剂盒说明书对沙鞭总RNA进行提取，再用DNA酶去除总RNA样品中的DNA，然后通过1.0%的琼脂糖凝胶电泳评估RNA的完整性，采用岛津紫外可见分光光度计（BioSpec-nano，日本）测定RNA浓度；质检合格后，用M-MLV反转录酶按照说明书合成沙鞭干旱胁迫0、6、12、24、48、72 h时的cDNA，并在冰箱中-20 ℃保存备用。

1.2.2　沙鞭AQP基因克隆

以沙鞭AQP基因Unigene309645的cDNA为模板，采用软件Primer Premier 5.0进行扩增引物设计，即PvAQP-F（5'-ATGGAGGGGAAGGAGGAGGA-3'）和PvAQP-R（5'-TTAAGACTTGCTCTTGAATG-3'），引物合成由北京六合华大基因科技有限公司完成；利用Taq DNA聚合酶进行PCR扩增获得目的基因片段PvAQP基因。PCR反应体系（25 µL）及条件如下：2.00 µL cDNA、PvAQP-F和PvAQP-R引物各1.00 µL、0.25 µL Taq PCR聚合酶、2.50 µL 10×buffer、2.00 µL dNTP、16.25 µL灭菌水；94 ℃预变性5 min，94 ℃变性50 s，54.5 ℃退火1 min，72 ℃延伸5 min，72 ℃再延伸10 min，36个循环。PCR扩增产物通过1.0%的琼脂糖凝胶电泳检验后，采用DNA胶回收试剂盒纯化目的DNA片段，将回收产物连接至pMD19-T载体并转化到天根的大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α感受态细胞中，随机挑取阳性单克隆菌株送北京六合华大基因科技有限公司测序。

1.2.3　沙鞭AQP基因生物信息学分析

运用在线软件ORF Finder（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）分析查找沙鞭AQP基因序列中的开放阅读框；利用在线软件ExPASy-ProtParam（https：//web.expasy.org/protparam/）和ExPASy-Protscale（https：//web.expasy.org/protscale/）分别预测PvAQP基因家族蛋白的理化性质（如分子量、理论等电点等）及亲疏水性；采用在线软件SOPMA（https：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）和SWISS-MODEL（https：//swissmodel.expasy.org/interactive/）预测蛋白质二级、三级结构；运用NCBI-CD-Search（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）在线软件预测基因的保守结构域；采用在线软件NetNGlyc 1.0（https：//services.healthtech.dtu.dk/services/NetNGlyc-1.0/）和NetPhos 3.1（https：//services.healthtech.dtu.dk/services/NetPhos-3.1/）分析编码蛋白糖基化位点和磷酸化位点；利用在线软件SignalP 4.1（https：//services.healthtech.dtu.dk/services/SignalP-4.1/）和TMHMM 2.0（https：// services.healthtech.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）分析编码蛋白信号肽和跨膜域；采用在线软件PSORT（https：//www.genscript.com/psort.html）进行沙鞭AQP基因的亚细胞定位预测；利用软件DNAMAN比对基因氨基酸序列。此外，运用软件MEGA 5.0和邻接法（Neighbor-Joining，NJ）构建PvAQP基因的系统发育树，其中bootstrap值设为1 000。

1.2.4　沙鞭AQP基因表达模式分析

采用200 mL的20% PEG-6000溶液浇灌长势一致、生长期4个月的沙鞭幼苗来模拟干旱胁 迫。胁迫处理0（CK）、6、12、24、48、72 h时，分别剪取幼嫩、健康的沙鞭根、茎和叶，迅速置于液氮中速冻，并立即投入冰箱中-80 ℃保存。所有待测样品均设置3次重复。利用植物RNA提取试剂盒提取待测样品的RNA，并分别进行反转录；以PvGAPDH为内参基因（PvGAPDH-F：5'-GAATTTGGCTTATTGAGGGTC-3'；PvGAPDH-R：5'-GCTTTC-ACATCATCATAAGAGGC-3'），cDNA为模板来检测PvAQP基因（PvAQP-F：5'-CGCCAGGGACTCCC-ATGTTC-3'；PvAQP-R：5'-AAGGGCAGCACCGATGAAGG-3'）的相对表达量；反转录条件如下：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s，58 ℃退火34 s，40个循环，设置3次重复。采用2^-ΔΔCt相对定量法计算相对表达结果。

1.2.5　过表达载体构建及烟草遗传转化

采用具有限制性内切酶BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点的引物扩增PCAMBIA2300-PvAQP载体，并使用这些酶对含有酶切位点的载体和目的基因片段进行载体连接和双酶切，随后转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，菌培过夜后随机挑取阳性单克隆菌落测序和验证，得到植物过表达载体PCAMBIA2300-PvAQP。利用冻融法将上述过表达载体导入农杆菌菌株LBA4404，经叶盘法转化烟草并通过卡那霉素抗性筛选和PCR检测、鉴定，获得阳性转基因型烟草植株。

1.2.6　转基因型烟草株系耐旱性鉴定

用10%和20% PEG-6000溶液对生长时期和植株大小几乎完全相同的转基因型和野生型烟草进行模拟干旱胁迫，分别于处理0、3、6、12、24、48 h时分别剪取样品叶片0.1 g用于测定抗氧化酶活性及PRO和MDA含量，每个胁迫处理时间梯度设置3组生物学重复，每组生物学重复均测定3次。采用氮蓝四唑（NBT）法、愈创木酚法和钼酸铵比色法分别测定SOD、POD和CAT活性，微量法测定PRO和MDA含量^［27］。

2 结果与分析

2.1　 PvAQP基因克隆

以反转录合成的沙鞭第一条单链cDNA作为模板，利用特异性引物PvAQP-F/R进行PCR扩增，本研究从沙鞭中克隆到目的基因片段，其序列全长为867 bp，产物回收纯化后与pMD19-T载体连接与转化，挑选阳性菌落（图1）测序获得与沙鞭转录组CDS序列一致的结果（GenBank号：ON792207）。

2.2　 PvAQP基因生物信息学分析

研究结果显示，沙鞭AQP基因总长为867 bp，开放阅读框（ORF）编码的氨基酸共288个，其中Gly（G）、Ala（A）和Ile（I）3种蛋白质数量位列前3，分别为35（12.2%）、34（11.8%）和24（8.3%），Cys（C）数量最少，为4（1.4%）（图2）；蛋白质的分子式是C₁₄₂₁H₂₁₈₃N₃₆₃O₃₈₁S₁₀，相对分子质量为30 768.77，等电点是8.82，蛋白不稳定系数为32.03，脂肪酸数为94.90。此外，蛋白亲疏水性分析表明，沙鞭AQP基因编码蛋白的疏水性最大值为2.667，而最小值仅有-2.922，且正值相对较多，说明沙鞭PvAQP是一种疏水性蛋白。

跨膜域预测结果显示，PvAQP具有明显的跨膜结构，是一个跨膜蛋白，并且存在一个完整的MIP结构域。信号肽预测表明，原始剪切位点C值的最高点位于第44位氨基酸（0.107），被结合的剪切点Y值最高点处于第44位氨基酸（0.110），信号肽S值最高点位于第38位氨基酸（0.119），且1～43位氨基酸序列的平均信号肽分值为0.098，不足以形成经典的信号肽区域，说明PvAQP是一种无信号肽，隶属非分泌蛋白。PvAQP编码的蛋白二级结构预测发现，其主要由α-螺旋、不规则卷曲、延伸链和β-转角构成，4种类型占比分别为29.51、47.22、19.79和3.47%（图3A），而其三级结构则主要由α-螺旋和不规则卷曲构成（图3B）。PvAQP编码蛋白不存在大于0.5的值，无可能的糖基化位点，含有10个丝氨酸（S）、6个苏氨酸（T）和3个酪氨酸（Y），推测这些位点极可能是蛋白激酶的重要结合位点。此外，亚细胞定位预测发现PvAQP编码的蛋白定位于细胞核中。

另外，本研究还将沙鞭AQP的氨基酸序列与其14个近缘属植物的AQP氨基酸序列进行了比对和矫正，并运用软件MEGA 5.0构建了它们的系统发育树，结果发现沙鞭AQP的氨基酸序列与沙生针茅（Stipa caucasica）的AQP氨基酸序列构成一个姐妹群，两者具有相对最近的亲缘关系（图4）。同时，比对分析沙鞭及其14个近缘属植物AQP基因氨基酸序列的相似性，发现这些植物间AQP基因氨基酸序列的相似性高达95.34%，尤其是保守结构域氨基酸序列具有较高的相似性，而非保守结构域氨基酸序列具有相对较大的差异性。

2.3　模拟干旱胁迫下PvAQP基因的表达模式分析

实时荧光定量PCR检测发现，沙鞭根、茎和叶中PvAQP基因的表达量差异较大，其中根中PvAQP基因的表达量最低，茎中表达量最高，说明PvAQP基因具有明显的组织特异性（图5A）。当以PvGAPDH基因作为内参基因，采用20% PEG-6000溶液胁迫处理时，发现根中PvAQP表达量呈不稳定的动态变化，与对照组相比6 h时表达量呈现降低趋势，6~24 h表达量逐渐升高至峰值，24~72 h时表达量再次逐渐降低；与对照组相比，6 h时 茎中PvAQP的表达量升高至峰值，6~12 h时表 达量急速下降，12~24 h时表达量再次逐渐升高，24~72 h时表达量降至最低；干旱胁迫0~6 h时叶中PvAQP的表达量上升，6~48 h时表达量逐渐降低至最小值，48~72 h时表达量迅速升高至峰值（图5B）。

2.4　 PvAQP基因过表达载体构建及烟草转基因株系鉴定结果

将PvAQP基因和PCAMBIA2300载体大片段连接后，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，经卡那霉素抗性筛选挑取单克隆菌落进行PCR鉴定，经电泳检测发现7个单克隆菌落的PCR产物大小均在867 bp左右（图6），选取阳性单克隆菌落送华大基因公司测序，序列比对发现与目的基因序列一致，说明PCAMBIA2300-PvAQP重组载体构建成功。

成功构建的PCAMBIA2300-PvAQP转到农杆菌LBA4404中，经卡那霉素和利福平筛选后，选取13个单克隆菌落进行PCR鉴定，经1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测发现10个单克隆菌落的PCR产物大小均在867 bp左右（图7），说明这10个单克隆菌落均为阳性。烟草叶片农杆菌浸染后于MS培养基培养，经脱分化、再分化、生根和移栽至花盆培养，1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测（图8），获得11株转基因型烟草。

2.5　转基因烟草耐旱性分析

模拟干旱胁迫结果表明，10%的PEG-6000溶液胁迫12 h，野生型烟草的绝大部分叶片出现萎蔫，而转PvAQP基因型烟草的叶片几乎未出现萎蔫现象；20% PEG-6000模拟干旱胁迫至6 h时，野生型烟草叶片出现萎蔫，而转PvAQP基因烟草生长状态正常。从表型看，随胁迫时间增加，转基因型烟草的抗旱能力高于野生型烟草（图9）。进一步测定干旱胁迫下的转基因烟草抗氧化酶活性及PRO和MDA含量。结果表明，10%的PEG-6000溶液胁迫时，对照组的转PvAQP基因型与野生型烟草中SOD、POD和CAT活性以及PRO和MDA含量差异均不显著（P>0.05）。然而，随着干旱胁迫时间的持续递增，转PvAQP基因型和野生型烟草中SOD、POD、CAT活性及PRO、MDA含量均逐渐升高。其中，SOD和POD活性及PRO含量在24 h时达到峰值后开始降低，CAT活性在12 h时达到峰值后开始下降。在这一过程中，转PvAQP基因型烟草的抗氧化酶活性和PRO含量均高于野生型烟草，而MDA含量则远低于野生型烟草（P<0.01）（图10A~10E）。20%的PEG-6000溶液胁迫处理时，对照组转PvAQP基因型与野生型烟草中SOD、POD、CAT活性和MDA含量差异不明显（P>0.05）。但随着干旱胁迫时间的持续延长，转PvAQP基因型和野生型烟草中SOD、POD、CAT活性和PRO含量呈现先升高后降低的变化趋势。同时，转PvAQP基因型烟草和野生型烟草的MDA含量随干旱胁迫时间增加而上升。这一过程中，转PvAQP基因型烟草的抗氧化酶活性和PRO含量均高于野生型烟草，而MDA含量远低于野生型烟草（P<0.01）（图10F~10J）。

3 讨论

3.1　 PvAQP基因特性及蛋白结构分析

本研究结果显示：AQP基因（PvAQP）序列全长867 bp，编码蛋白氨基酸序列含有MIP家族中典型的NPA保守结构域；PvAQP有明显的跨膜结构，属于一个疏水性跨膜蛋白。这与先前诸多学者从山药（Dioscorea opposita）^［4］、毛竹（Phyllostachys edulis）^［28］及沙蒿^［10］等植物中克隆到的AQP基因特性基本一致，同样笔者推测PvAQP基因可能直接参与沙鞭水通道蛋白的形成。本研究还表明，PvAQP无信号肽结构和可能的糖基化位点存在19个磷酸化位点，这与岳川等^［29］的研究结果一致。此外，沙鞭PvAQP基因编码的蛋白二级结构主要由α-螺旋、不规则卷曲、延伸链和β-转角4种类型构成；三级结构主要由α-螺旋和不规则卷曲组成，其中，二级结构中不规则卷曲和α-螺旋分别占比47.22%和29.51%，表明不规则卷曲和α-螺旋可能是沙鞭水通道蛋白二级结构的主要组成元件，这与张丹等^［10］对沙蒿AQP蛋白质结构的研究结果相同。同时，本研究认为沙鞭AQP蛋白具有双亲特性也是由亲水性和疏水性氨基酸共同组成的α-螺旋产生的，蛋白亲水性侧有水分跨膜运输功能的空桶状结构，疏水性侧可以利用疏水键与磷脂双分子层固定于膜上。这样的双重作用使沙鞭AQP蛋白形成稳定的跨膜结构域，从而使其很好地发挥水分跨膜运输的功能和作用。

3.2　 PvAQP基因表达模式分析

基因特异性表达分析显示，PvAQP基因表达具有组织特异性，根、茎、叶中的表达量存在较大差异，其中根中相对表达量最低，叶中次之，茎中最高，这与先前张丹等^［10］关于沙蒿OsAQP基因的研究结果相同，笔者推测PvAQP基因可以增强沙鞭对干旱胁迫的抗性。另有研究^［4，10］表明，干旱胁迫下植物AQP基因的表达量常呈现“上升—下降—持续上升—大幅下降”的变化规律，认为该基因在植物响应干旱胁迫的过程中发挥着重要作用。通过分析模拟干旱胁迫下沙鞭AQP基因表达模式发现，沙鞭AQP基因的表达量随着干旱胁迫时间的持续延长呈现不同的变化趋势，其中根中PvAQP基因表达量0~6 h时呈现降低趋势，6~24 h逐渐升高至峰值，24~72 h时再次逐渐降低；6 h时茎中PvAQP基因的表达量升高至峰值，6~12 h时表达量急速下降，12~24 h时表达量再次逐渐升高，24~72 h时表达量降至最低；0~6 h时叶中PvAQP基因的表达量上升，6~48 h时表达量逐渐降低至最小值，48~72 h时表达量迅速升高至峰值，表明沙鞭PvAQP基因具有多样性的组织表达模式，同样也表明沙鞭PvAQP基因可以响应干旱胁迫过程，可能具有抵抗干旱胁迫的功能。

3.3　转基因烟草耐旱性分析

有研究^［30］表明，植物在干旱胁迫下会产生一系列的生理生化反应来提高植物的耐旱性，如叶片气孔关闭、抗氧化能力增强、光合速率降低等诸多生理变化，以此来调节自身对干旱胁迫的适应能力。本研究中，在10%和20% PEG-6000溶液模拟干旱胁迫下，转PvAQP基因型烟草中SOD、POD和CAT活性及PRO含量显著高于野生型烟草，而MDA含量则显著低于野生型烟草，这充分说明沙鞭PvAQP基因具有较强的耐旱能力，与周志国等^［31］关于萝卜（Raphanus sativus）水通道蛋白基因RsAQP1b功能的研究结论一致。此外，本研究还显示转PvAQP基因型烟草中SOD、POD和CAT活性及PRO含量随模拟干旱胁迫时间的持续增加呈先升高后降低的变化规律，这可能是由于随着干旱胁迫时间的增加，植物细胞膜损伤加剧，细胞内活性氧积累增多，膜脂过氧化反应剧烈^［32］导致。因此本研究认为模拟干旱胁迫下转PvAQP基因型烟草中抗氧化酶活性和PRO含量增加能降低活性氧含量及细胞膜损伤程度，从而在某种程度上可以提高转基因型烟草的耐旱性^［23］。但是，当干旱胁迫超出一定时间范围时，转PvAQP基因型烟草的抗氧化酶活性下降，这可能与其对干旱胁迫的适应性及自身保护机能衰退有关^［23］。同时，转PvAQP基因型烟草体内MDA含量随着模拟干旱胁迫时间的增加呈上升趋势，这与胡宏远等^［33］对赤霞珠葡萄（Cabernet sauvignon）的研究结果一致，同样认为长时间的模拟干旱胁迫使转PvAQP基因型烟草自身机制衰老和细胞膜质过氧化程度加剧，从而导致叶片细胞膜透性增加，诱导了细胞内MDA含量的持续上升。

4 结论

本研究基于沙鞭的三代转录组数据克隆得到一个水通道蛋白基因PvAQP，并构建了过表达载体；亚细胞定位发现，PvAQP基因的编码蛋白定位于细胞核中；PvAQP基因表达具有组织特异性，根、茎、叶中的表达量差异较大；转PvAQP基因型和野生型烟草中SOD、POD和CAT活性及PRO含量随模拟干旱胁迫时间增加呈现先升高后降低趋势，与野生型烟草相比，转PvAQP基因型烟草中表达量更高，而MDA含量则呈上升趋势，并且转PvAQP基因型烟草中MDA含量显著低于野生型。本研究为解析沙鞭PvAQP基因响应耐旱的分子机制提供了科学依据，也为将来深入揭示沙鞭适应干旱环境的分子机制提供了理论依据。

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基金资助

青海省自然科学基金面上项目(2022-ZJ-918)

国家自然科学基金项目(32160297)