Fe元素对半夏试管珠芽形成及试管苗生长的影响

Effect of Fe Element on Bulbil Formation and Tube Seedling Growth of Pinellia ternata

摘要

为选出培养半夏试管珠芽的适宜Fe²⁺浓度，该研究通过梯度改变1/2MS基本培养基中Fe²⁺浓度，依据试管珠芽的形成时间、诱导率，试管苗地上、地下形态指标，试管珠芽中淀粉粒数量与分布，叶片叶绿素含量及试管珠芽有效成分含量等指标，得出试验结果为9.2×10^-5 mol·L^-1浓度下各项指标最佳。此外，还发现Fe缺素下无法形成完整试管珠芽，说明Fe是半夏试管珠芽形成过程中必不可少的微量元素，但同时浓度不宜过高，因高浓度Fe²⁺下，形成的试管珠芽极小且后续无法正常萌发成苗。

Abstract

To obtain an optimal Fe²⁺ concentration for culturing test tube bulbils of Pinellia ternata， the concentrations of Fe²⁺ in 1/2MS basic medium were changed in gradient； the formation time， induction rate and the above-ground and underground morphological indices of test-tube plantlets were investigated. The number and distribution of starch granules and the content of chlorophyll in leaves and the content of effective components in test tube bulbils were assayed. The results showed that the optimal Fe²⁺ concentration in 1/2MS basic medium for culturing test tube bulbils was 9.2×10^-5 mol⋅L^-1. In addition， the complete bulbils could not be formed under Fe deficiency. This indicated that Fe was an essential trace element in growth of P. ternata. However， the bulbils formed under high concentration of Fe²⁺ were very small and failed to germinate normally.

Graphical abstract

关键词

半夏 / 试管珠芽 / 试管苗 / 淀粉粒 / Fe元素

Key words

Pinellia ternata（Thunb.）Breit. / test tube bulbils / tube seedlings / starch grain / Fe element

半夏（Pinellia ternata）为天南星科（Araceae）多年生药用草本植物，以干燥块茎入药，性温、味辛，有毒，炮制后方可入药，在我国药用历史悠久，被历版《中华人民共和国药典》收载^［1］。现代研究表明，半夏含有生物碱、有机酸等多种化学成分，具有降逆止呕、燥湿化痰等多种药理作用^［2］，是具有重要经济价值的中药材大宗贸易产品。

随着半夏药用价值被广泛认识及出口量增加，人们对其野生资源过度挖掘，导致半夏野生环境被严重破坏，野生半夏产量锐减。目前，市场上半夏药材多为人工栽培。因珠芽发芽率高，播后当年或翌年即可收获药材，故作为栽培半夏的重要繁殖材料之一，但珠芽遇不利条件极易倒苗^［3］，所以以珠芽作繁殖材料，存在繁育系数低、种植成本高、种质严重混杂等问题，严重制约了半夏栽培面积扩大和经济效益提高^［4］。因此，研究珠芽诱导和生长对半夏生产具有重要意义，组织培养则是一种可快速及大规模繁殖获得半夏优良种茎、提高繁殖系数、提升种植效益的有效途径。

铁（Fe）是作物生长过程中需求量较大的一种微量元素，在植物进行光合作用过程中必不可少，发挥多种作用^［5］。许多研究^［6-8］表明，各组织培养快繁技术中探究的影响因素均有Fe，半夏组织培养常用培养基为MS^［9］或1/2MS培养基，Fe盐是 2种培养基中不可或缺的成分^［10-13］。施入Fe微肥在各作物与中药材栽培生产中更是一种有效增产与提高植物品质的手段^［14-19］。

本课题组建立了半夏试管珠芽的直接发生技术体系，与自然条件下珠芽的形成部位及形态结构极其相似，且不经过愈伤组织阶段，有望作为人工种茎使用。目前还鲜见组织培养研究中关于微量元素Fe对半夏直接形成试管珠芽产生影响的相关报道，探究Fe诱导试管珠芽、影响试管苗生长及最有益于半夏有效成分积累的适宜浓度，可以为半夏离体快繁及大田喷施微肥调控半夏珠芽的发生和生长提供理论依据。

1 材料与方法

1.1　试验材料

试验材料为甘肃中医药大学植物组织培养实验室培养获得的半夏试管苗。

1.2　试验方法

以1/2MS+3％蔗糖+0.7％琼脂作为基本培养基，通过母液配制培养基的方式来改变其中FeSO₄·4H₂O浓度（0、2.3×10^-5、4.6×10^-5、9.2×10^-5、18.4×10^-5、36.8×10^-5 mol∙L^-1）。培养基中琼脂质量分数为0.7%，但因18.4×10^-5、36.8×10^-5 mol·L^-1 2个浓度下，0.7%琼脂无法正常凝固用作固体培养基，故琼脂质量分数需调整为1.2%。将试管苗叶柄切为1 cm左右的小段，接种到不同处理培养基中。试管珠芽形成阶段暗培养，萌发后转至25 ℃、光照强度18.75 μmol∙m^-2·s^-1、光照时间12 h/d的条件下培养。每个处理设置5个重复，每个重复6个外植体。

1.2.1　不同浓度Fe²⁺培养下半夏试管珠芽的形成与生长比较

分别统计不同浓度Fe²⁺处理下，形成试管珠芽所用时间与试管珠芽诱导率。待生长为完整植株后，统计地上与地下部分各形态指标。

1.2.2　不同浓度Fe²⁺培养下半夏试管珠芽淀粉粒的变化

将不同浓度Fe²⁺处理下培养得到的试管珠芽用FAA固定液固定24 h，采用石蜡切片技术和PAS染色法制片，于显微镜（OLYMPUS MODEL BX43F-R，日本）下观察淀粉粒含量与分布变化。

1.2.3　不同浓度Fe²⁺培养下半夏叶片叶绿素含量测定

选取不同处理下培养得到的叶片作为材料，利用紫外分光光度法测定总叶绿素、叶绿素a、叶绿素b含量。

1.2.4　不同浓度Fe²⁺培养下半夏试管珠芽有效成分含量测定

采用HPLC高效液相色谱仪（iChrom 5100，中国）测定不同处理培养所得试管珠芽中尿嘧啶、尿苷、肌苷、鸟苷、胸苷、腺苷等6种有效成分含量。

1.3　数据处理

使用SPSS Statistics 27.0与Excel 2019进行数据分析，利用邓肯新复极差法进行多重比较，比较差异显著性（P<0.05）。

2 结果与分析

2.1　不同浓度Fe²⁺处理对半夏试管珠芽形成及成苗的影响

培养观察发现，半夏由叶柄培养至形成完 整植株共分为5个时期，分别为膨大期（叶柄一端膨大）、球形期（膨大处发育为类球形）、芽 点期（球形合拢，在球状体一端产生芽点）、芽 尖期（芽点突起，发育为芽尖）、成苗期（芽尖 处萌发成苗）。不同浓度Fe²⁺处理到达膨大期所用时间无显著差异（图1），但Fe缺素培养下半 夏试管叶柄膨大时形态异常（图2A）且未能继续生长发育。球形期后，高浓度Fe²⁺（18.4×10^-5、36.8×10^-5 mol·L^-1）培养下，叶柄到达芽点期与芽尖期的时间较其他浓度下慢，在这2个浓度下形成的试管珠芽极小且后续无法正常萌发成苗（图2E、2F），Fe²⁺浓度为2.3×10^-5 mol·L^-1（图2B）、4.6×10^-5 mol∙L^-1（图2C）、9.2×10^-5 mol∙L^-1（图2D）下珠芽形成所需时间相同，而且试管苗能够正常萌发生长。

此外，Fe²⁺浓度也会影响试管珠芽诱导率。随着Fe²⁺浓度的升高，单珠芽诱导率呈先上升后下降的趋势（图3）。在Fe缺素培养中，86.7%的叶柄未分化出完整试管珠芽，说明Fe²⁺是半夏试管珠芽形成的必需元素。单珠芽在Fe²⁺浓度为4.6×10^-5、 9.2×10^-5 mol∙L^-1下诱导率最高，为80%；双珠芽诱导率趋势与单珠芽相同，在Fe²⁺浓度为4.6×10^-5、9.2×10^-5、18.4×10^-5 mol∙L^-1下最高，为13.3%；多 珠芽诱导率在Fe²⁺浓度为2.3×10^-5、4.6×10^-5、 9.2×10^-5 mol∙L^-1下最高，诱导率为3.3%，在Fe²⁺浓度为0、18.4×10^-5、36.8×10^-5 mol∙L^-1下无多珠芽 产生；愈伤组织在Fe²⁺浓度为4.6×10^-5、9.2×10^-5 mol∙L^-1下诱导率最低，仅为3.3%。从培养时间 及单珠芽与双珠芽诱导率分析认为，4.6×10^-5、 9.2×10^-5 mol∙L^-1是半夏叶柄诱导产生试管珠芽的最佳Fe²⁺浓度。

培养70 d后，观察统计发现，不同Fe²⁺浓度 处理下试管珠芽及试管苗生长的形态指标有显著性差异（表1~2）。Fe²⁺浓度为2.3×10^-5、4.6×10^-5、9.2×10^-5 mol∙L^-1时，除叶长、叶宽无明显差异外，珠芽鲜质量、茎叶数量、茎叶质量、株高、茎直径、根条数量、根质量、根长、根直径在Fe²⁺浓度为4.6×10^-5、9.2×10^-5 mol∙L^-1下显著高于2.3×10^-5 mol∙L^-1。由此说明，培养基中Fe²⁺浓度为4.6×10^-5、9.2×10^-5 mol∙L^-1有利于半夏试管苗生长，会使植株生长更加健壮，而缺素与高浓度Fe²⁺培养均会严重抑制试管珠芽形成与试管苗生长。

2.2　不同浓度Fe²⁺处理对半夏淀粉粒分布及含量的影响

观察不同浓度Fe²⁺处理下半夏试管珠芽第1个叶原基、顶端分生组织及顶端分生组织下方淀粉粒含量与分布发现（图4），缺素（图4A）培养下珠芽形态不完整，无法分析各部位。其他浓度下，只有9.2×10^-5 mol∙L^-1处理（图4D）第1个叶原基中有极少量淀粉粒分布，2.3×10^-5 mol∙L^-1（图4B）、4.6×10^-5 mol∙L^-1（图4C）、18.4×10^-5 mol∙L^-1（图4E）、36.8×10^-5 mol∙L^-1（图4F）处理均无淀粉粒。

顶端分生组织中，淀粉粒只在4.6×10^-5、9.2×10^-5 mol∙L^-1处理下有分布，2个浓度下顶端分生组织中几乎每个细胞中都含有偏向细胞一侧分布的淀粉粒，所偏方向有所差别，4.6×10^-5 mol∙L^-1处理下偏向于细胞上侧，9.2×10^-5 mol∙L^-1处理下偏向于细胞下侧。

顶端分生组织下方淀粉粒数量随Fe²⁺浓度升高呈先增多后减少的趋势，在4.6×10^-5、9.2×10^-5 mol∙L^-1时数量最多。2.3×10^-5 mol∙L^-1培养下，淀粉粒环绕细胞一圈，部分细胞中无淀粉粒分布，淀粉粒数量显著少于其他浓度处理。4.6×10^-5、9.2×10^-5 mol∙L^-1下，淀粉粒数量均由上至下逐渐增多，直至几乎充满整个细胞，4.6×10^-5 mol∙L^-1下淀粉粒在细胞中偏向细胞上侧，9.2×10^-5 mol∙L^-1下淀粉粒偏向细胞下侧分布。18.4×10^-5、36.8×10^-5 mol∙L^-1下，淀粉粒虽由上至下几乎充满整个细胞，但因植株无法萌发成苗而不予考虑。

Fe²⁺浓度为4.6×10^-5、9.2×10^-5 mol∙L^-1下，珠芽发育最佳，淀粉粒分布最多。上述结果说明，半夏试管苗生长过程的能量供应与试管珠芽中淀粉粒有密切关联，淀粉可以为珠芽生长发育和试管苗生长提供物质和能量。

2.3　不同浓度Fe²⁺处理对半夏叶绿素含量的影响

由图5可知，随着Fe²⁺浓度的升高，总叶绿素、叶绿素a和叶绿素b含量呈增加趋势。总叶绿素质量浓度在9.2×10^-5 mol∙L^-1下最高，为11.26 mg∙L^-1；叶绿素a在4.6×10^-5、9.2×10^-5 mol∙L^-1下质量浓度分别为7.81、7.91 mg·L^-1，显著高于2.3×10^-5 mol∙L^-1下的质量浓度；叶绿素b质量浓度无显著差异。由此可知，9.2×10^-5 mol∙L^-1的Fe²⁺浓度有利于叶绿素合成，但整体差异并不明显。

2.4　不同浓度Fe²⁺处理对半夏有效成分含量的影响

半夏作为一种重要药用植物，有效成分是其生长过程中的重要测评指标。尿嘧啶、尿苷、肌苷、鸟苷、胸苷、腺苷是半夏6种有效成分，本研究通过测定这6种有效成分含量（图6），判断Fe²⁺浓度是否会影响半夏有效成分的积累。因Fe缺素无试管珠芽，另外18.4×10^-5、36.8×10^-5 mol∙L^-1浓度下试管珠芽粉末质量未达到要求，无法进行测定，故对其余3个浓度试管珠芽进行对比分析。

由表3可以看出，随着Fe²⁺浓度的升高，6种有效成分含量整体呈显著上升趋势，尿嘧啶、肌苷、鸟苷、胸苷、腺苷均在9.2×10^-5 mol∙L^-1下质量分数最高，分别为0.749 4、1.503 5、0.829 5、0.100 3、0.087 2 mg·g^-1，尿苷在3个浓度下均无显著差异，尿嘧啶与腺苷在2.3×10^-5、4.6×10^-5 mol∙L^-1下无显著差异。说明适宜浓度的Fe²⁺有助于有效成分合成，根据测定结果，认为Fe²⁺浓度为9.2×10^-5 mol∙L^-1时最有利于半夏试管珠芽有效成分积累。

3 讨论

微量元素Fe是植物生长的必需元素，在植物生长发育过程中具有重要功能。淀粉粒是淀粉在细胞中的储存形态，是植物细胞中最普遍的贮藏物质。在一些研究^［20-22］中发现，作物产量与淀粉含量达到极显著正相关，半夏珠芽形成过程也是一个伴随着淀粉积累的过程^［23］。本研究探究不同Fe²⁺浓度对诱导半夏试管珠芽及试管苗生长的影响，研究结果可为明确半夏组织培养中Fe²⁺的供需关系提供一定技术支撑。

3.1　Fe缺素与高浓度Fe²⁺对半夏试管珠芽生长的影响

研究结果表明：9.2×10^-5 mol∙L^-1的Fe²⁺浓度有利于半夏试管珠芽诱导、生长及成分积累。与之相反，Fe缺素导致半夏无法诱导形成试管珠芽，严重抑制叶柄发育。高浓度Fe²⁺同样会严重抑制试管珠芽的生长，在高浓度下，虽然可以诱导叶柄产生完整试管珠芽，但所产生的试管珠芽极小且后续无法成苗。造成以上现象的原因可能是因为Fe在植物体中的流动性很小^［24］，1 cm叶柄中自身所含Fe²⁺较少，导致叶柄一端无法获取到能够形成试管珠芽的足量Fe²⁺；也可能是培养基中缺乏Fe²⁺导致了其他元素之间的不平衡，进而导致叶柄无法形成试管珠芽。过高浓度Fe²⁺影响生长可能是因为其会导致过量Fe²⁺胁迫，从而抑制根系的生长^［25］，或是过量Fe²⁺影响了培养基内渗透压，导致叶柄内渗透调节物质积累，从而影响植物生长^［26］。在18.4×10^-5、36.8×10^-5 mol∙L^-1下，淀粉粒由上至下几乎充满整个细胞。2个浓度下，淀粉粒的积累可能是因珠芽不能够正常萌发成苗而无法将细胞中所含淀粉粒转化为能量供给到所产生的茎叶当中。

3.2　Fe元素用量对植株生长的影响

Fe是植物生产中的重要微肥，会对植物生长产生影响，若使Fe微肥发挥最大效益，还需严格控制用量。李凯等^［27］研究结果表明，叶面喷施Fe微肥可以参与马铃薯（Solanum tuberosum）叶绿素合成，促进马铃薯光合作用。武新娟等^［28］研究结果表明，喷施铁锌肥促进马铃薯植株生长，显著增加株高，同时叶绿素含量明显上升，喷肥处理后的块茎产量显著增加。李丰先等^［29］研究结果表明，喷施铁、锌和铁锌配施，降低了马铃薯还原糖含量，提高了维生素C、淀粉、粗蛋白和干物质含量，改善了马铃薯营养品质，对马铃薯单株结薯数量、单株产量和商品薯率均有积极影响，使马铃薯的营养价值和经济价值最大化。而罗磊等^［30］研究则表明，土施硫酸亚铁对增加马铃薯块茎产量效果不大，叶面喷施硫酸亚铁甚至会导致减产。造成试验结果不同的原因可能是不同试验地区土壤自身Fe含量不同，部分试验地区自身Fe含量就足以支撑马铃薯生长发育所需，若添加外源Fe反而会抑制马铃薯生长，降低产量。魏莉霞^［31］研究微量元素对半夏组织培养诱导率及分化率的影响时发现，当Fe²⁺质量浓度为9.5 mg∙L^-1时，半夏叶柄所诱导的愈伤组织形态及生长状态最佳，大于此阈值时，反而会降低叶柄诱导率及分化率。吕小娜等^［32］研究不同微量元素对豌豆（Pisum sativum）芽苗菜生长的影响发现，当Fe元素处理质量浓度为30 mg∙L^-1时，生长指标最优，25 mg∙L^-1时叶绿素含量最高，超过30 mg∙L^-1则会降低。谢进等^［33］在玉竹（Polygonatum odoratum）叶面喷施试验中，用低浓度的Fe肥处理，可增强玉竹叶片的光合性能，并通过增加玉竹新生块茎质量和直径来提高产量，玉竹块茎总多糖含量比对照提高了34.2%~75.3%，但喷施超过0.022 kg∙m^-2的Fe肥时反而产生了抑制现象。以上试验验证了生产中施入Fe不是越多越好，施入过多反而严重影响产量。

本研究通过组织培养手段证明，在半夏珠芽生长调控中，Fe元素必不可少，Fe缺素会直接导致珠芽无法形成，但过量施用Fe素也会抑制珠芽生长，这与其他作物组织培养及大田研究所得结论相似。调控半夏珠芽的生长发育需要根据其生育期内养分需求来施加Fe素。

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基金资助

甘肃省高等学校产业支撑计划项目(1515C-09)

甘肃中医药大学成果转化培育项目(2023CGZH-18)

甘肃省民生科技专项（科技特派员专题）(15CX9NA070)

中央引导地方科技发展专项资金项目(30440323)

现代农业产业技术体系建设专项(CARS-21)

第五批省级科技计划（联合科研基金）项目(24JRRA877)

第三批省级科技计划（重点研发计划）项目(24YFNA007)