玉米GLP家族基因鉴定及其响应丛枝菌根共生表达

Identification of the Maize GLP Family Genes and Their Expression in Response to Arbuscular Mycorrhizal Symbiosis

摘要

类萌发素蛋白（germin-like proteins,GLPs）是一类高度保守的胁迫响应蛋白，可特异性响应菌根共生。该研究基于玉米（Zea mays）B73全基因组信息，利用生物信息学方法对ZmGLP基因家族成员进行鉴定及特征分析，利用转录组数据分析ZmGLP基因在丛枝菌根真菌（AMF）共生下的表达模式。该研究鉴定了45个ZmGLP基因，它们分布于9条染色体上，存在25个串联复制基因；系统发育树将ZmGLP基因分为5个亚家族；不同ZmGLP基因组织表达模式存在较大差异。启动子顺式作用元件分析显示，ZmGLP基因启动子包含响应光、胁迫和生长发育相关的元件，ZmGLP4-8启动子含有菌根响应元件MYCS,20个ZmGLP基因启动子包含潜在的菌根响应元件GCCGGC；基于接种AMF后不同时间的玉米根部转录组数据，发现12个ZmGLP基因的表达在接种AMF后出现了显著变化；其中ZmGLP3-3、ZmGLP4-8、ZmGLP4-16、ZmGLP4-20、ZmGLP5-1、ZmGLP6-1在共生后期显著上调表达，且与已报道的共生相关GLP基因在不同的进化分支，暗示这些基因可能参与菌根共生后期相关的功能。ZmGLP3-3功能研究显示，相较于野生型玉米植株，突变体zmglp3-3菌根定殖率显著降低。综上，该研究为共生相关ZmGLP基因挖掘提供了理论基础。

关键词

丛枝菌根真菌 / 类萌发素蛋白 / 基因家族 / 菌根共生 / 表达分析

Key words

arbuscular mycorrhizal fungi / germin-like proteins / gene family / mycorrhizal symbiosis / expression analysis

丛枝菌根真菌（arbuscular mycorrhizal fungi，AMF）是一种活体营养型的土壤真菌，隶属球囊菌门，可以和陆地2/3以上的植物建立共生关系^［1］。AMF与植物形成互惠共生体，这种共生体称为丛枝菌根（AM）。AMF通过为宿主植物提供大量营养元素（如氮和磷）来改善宿主植物的矿物质营养^［2］，从而提高植物的适应性、产量和逆境恢复力^［3-4］；作为交换，宿主植物给予菌根真菌营养代谢所需的碳源，例如脂肪酸和糖^［5-6］。

类萌发素蛋白（germin-like proteins，GLPs）属于植物糖蛋白家族——“Cupin超家族”^［7］，它们广泛分布于单子叶植物、双子叶植物和裸子植物中。GLPs编码含有1个β-折叠桶状Cupin结构域，其 C-末端结合有金属离子^［8-9］。它们参与植物发育过程，通常具有多种酶学特性，例如草酸氧化酶和超氧化物歧化酶活性^［10］。研究^［11］发现，GLP基因家族成员参与植物与微生物的相互作用，例如，沉默GhABP19使棉花（Gossypium hirsutum）对真菌病原体的敏感性增强^［12］；ZmGLP1基因过量表达提高拟南芥（Arabidopsis thaliana）对假单胞菌（Pseudomonas）的抗性^［13］；小麦（Triticum aestivum）中TaGLP基因的表达与白粉病抗性有关^［14］；大豆（Glycine max）中的GmGLP10基因对核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）侵染有响应^［15］。GLP家族成员在植物共生响应中也起着重要作用，特别是在植物与根瘤菌和AM真菌建立共生关系的过程中^［16-17］。例如，在紫云英（Astragalus sinicus）中发现一个与根瘤菌外膜蛋白（OMPs）相互作用的类萌发蛋白GLP1，其介导共生结瘤的形成^［18］。全基因组测序鉴定大豆菌根真菌定殖相关的数量性状位点，在第10条染色体750 kb区域内发现2个编码GLP的基因，这些基因在根瘤中高度表达^［19］；对豌豆（Pisum sativum）的转录组分析发现，PsGLP2在根瘤和AM共生体形成过程中表达上调^［20］。此外，有研究^［17］利用抑制性消减杂交cDNA文库技术，分离得到1个AM特异性诱导的编码GLP的基因。因此，植物GLP家族中存在响应菌根共生的成员。

玉米（Zea mays）是世界上种植最广泛的作物之一，是食物、饲料和工业等多个领域重要的原料来源^［21］。玉米可以与AMF共生，通过AM增强玉米根系对土壤养分的吸收^［22］。研究^［23］发现，玉米中GLP基因在对抗生物胁迫，如黄曲霉（Aspergillus flavus）、禾谷炭疽菌（Colletotrichum graminicola）等时表现出强烈的表达，ZmGLP1基因在病原菌抗性调控中发挥重要作用^［13］，但关于玉米GLP基因家族成员是否参与AM共生或者是否响应AM共生鲜见报道。因此，本研究基于玉米全基因组数据，鉴定玉米中的GLP基因，系统分析玉米GLP基因的理化性质、保守基序、基因结构、染色体定位、共线性、启动子和菌根响应表达谱等，以探究玉米GLP基因对AMF侵染的响应，为挖掘玉米中响应菌根共生的GLPs家族成员提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 数据来源和玉米GLP基因鉴定

为了鉴定玉米中的GLP基因家族成员，从Ensemblplants（https://plants.ensembl.org/index.html）下载玉米（Zea mays B73 5.0）的蛋白序列、基因组序列和基因注释GFF3文件，从Pfam（http://pfam.xfam.org/）下载Cupin保守结构域（PF001900）的隐马尔可夫模型配置文件（hidden Markov model，HMM），通过HMMER（https://www.ebi.ac.uk/Tools/hmmer/）中hmmsearch程序筛选玉米中GLP家族成员（E小于0.01）。然后利用先前研究^［24］得到的AtGLP、OsGLP蛋白信息，在拟南芥信息资源TAIR2数据库（https://www.arabidopsis.org/）和NCBI数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中分别下载拟南芥和水稻（Oryza sativa）GLP家族成员蛋白序列，以这些蛋白序列为探针序列，使用TBtools-Ⅱ（Toolbox for Biologists）2.119软件中的Blast Compare Two Seq（Sets）程序对玉米蛋白序列进行Blast筛选（E小于0.000 01），获取相似序列^［25］。将这2种方法鉴定得到的玉米蛋白序列同时提交到SMART（https://smart.embl.de/）和InterPro（https://www.ebi.ac.uk/interpro/）网站对其蛋白保守结构进行预测，2个网站预测的同一个蛋白序列结果均含有Cupin_1结构域（Pfam ID：PF00190）的为玉米GLP基因家族成员。在删除冗余序列及包含不完整和没有Cupin_1结构域的序列后，获得候选ZmGLP基因家族成员^［26］。最后利用NCBI保守域中的CD Search工具（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）对所有检索到的序列进行结构域可视化，选出具有Cupin_1结构域的蛋白域序列，最终鉴定得到ZmGLP基因家族成员。使用在线服务器ExPASy中的ProtParam程序（http://web.expasy.org/protparam/）预测ZmGLP蛋白的理化性质^［27］。使用在线工具Plant-mPloc（http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/）进行亚细胞定位预测^［28］。

1.2 系统发育树构建

为了进一步研究玉米GLP基因家族成员的功能和进化特征，利用鉴定所得的ZmGLPs和已报道的AtGLPs、OsGLPs和SiGLPs的蛋白序列构建系统发育树^{［24，29］}。谷子GLP蛋白序列下载自Ensembl plants数据库，使用MEGA 11软件（https://www.megasoftware.net/）对蛋白质序列进行多序列比对，选用ClustalW算法，参数为默认值；通过邻接法（neighbor-joining，NJ）构建系统发育树，PHYLOGENY TEST中选择bootstrap法，检验次数为1 000，其他保持默认值，并利用iTOL（https://itol.embl.de/）网站美化系统发育树^［30］。

1.3 玉米GLP基因家族基因结构和蛋白质保守基序组成分析

使用TBtools软件（https://github.com/CJ-Chen/TBtools）分析ZmGLP基因家族成员的基因结构。使用MEME（http://meme-suite.org/）分析ZmGLP家族蛋白基序，motif搜索数目设置为10个；并使用TBtools软件进行可视化。通过在线工具WebLogo（http://weblogo.berkeley.edu/logo.cgi）制作Logo图。

1.4 玉米GLP基因家族成员染色体定位及共线性分析

使用TBtools软件从玉米基因注释GFF3文件中提取出ZmGLP基因的染色体位置信息，利用在线网站MG2C（http://mg2c.iask.in/mg2c_v2.1/）对ZmGLP基因的染色体位置进行可视化，并根据染色体位置对ZmGLP基因命名^［24］。利用MCScanX23软件（https://github.com/wyp1125/MCScanX）分析ZmGLP基因共线性^［31］。在shinyCircos-V2.0（https://asiawang.shinyapps.io/shinyCircos/）上对ZmGLP基因共线性进行可视化分析。使用TBtools软件进行物种间共线性可视化^［32］。

1.5 玉米GLP基因启动子顺式元件预测分析

从Ensembl Plants数据库下载ZmGLP基因的CDS上游2 000 bp，使用PlantCARE软件预测ZmGLP基因启动子顺式作用元件，并使用TBtools软件绘制顺式作用元件预测图。随后，为了检测与菌根共生相关的元件，使用RAST Plant（https://rsat.eead.csic.es/plants/）预测菌根共生相关作用元件^［33］。最终，对每个启动子中每个元件的数量、位置和功能统计绘图。

1.6 玉米GLP基因在不同组织下的表达分析

MaizeGDB数据库（https://www.maizegdb.org/）中包括玉米参考序列、多样性、表达、表型、表观遗传和调控及代谢途径数据等。从该数据库中获取ZmGLP基因在玉米（B73）各组织中的表达数据，对数据进行log10（1+TPM）均一化处理，使用Adobe Illustrator 2022软件绘制ZmGLP基因在玉米不同组织下的表达热图。

1.7 ZmGLP基因在AMF与玉米共生条件下的表达分析

利用接种AMF后5、10、15、20、25、30、40 d的玉米B73根部转录组数据（NCBI数据库：PRJNA9184），对ZmGLP基因响应AMF共生过程的表达进行分析。对数据进行log2（1+FPKM）均一化处理，当ZmGLP基因在接种AMF和未接种AMF表达水平的差异倍数（fold change）F _c≥2且P<0.05时，则视为差异表达基因。使用GraphPad Prism 9.5软件绘制ZmGLP基因在玉米与AMF共生不同时期的表达图。

1.8 ZmGLP3-3基因功能研究

利用ZmGLP3-3的转座子Mutator插入突变体zmglp3-3（遗传背景为W22）研究其是否参与菌根共生的功能。zmglp3-3突变体Mutator的插入位点为ZmGLP3-3编码区上游83 bp处。野生型玉米（W22）和突变体zmglp3-3分别设置接种和不接种AMF（Rhizophagus irregularis）处理。AMF菌剂为本实验室通过沙土扩繁获得，AMF的接种量为每盆接种孢子约1 000个。接种AMF的40 d后收获植株材料，分别检测菌根定殖率、地上和地下部分的干质量。利用Student’s t test进行显著性差异分析。菌根染色和菌根定殖率的计算方法参考前人^［22］的报道。

2 结果与分析

2.1 玉米GLP基因家族成员鉴定及特性分析

通过HMM search、BLAST search方法比对和结构域双重验证，在删除重复冗余后，最终鉴定出45个ZmGLP基因（表1）。对其编码蛋白的理化性质进一步分析发现，ZmGLP基因编码的蛋白质长度为114~263 aa；相对分子量为12.52~28.02 kDa；预测的蛋白质等电点（pI）为5.11（ZmGLP6-2）~9.21（ZmGLP4-11），其中pI<7的ZmGLP蛋白有38个，表明这些ZmGLP蛋白富含酸性氨基酸；不稳定性指数为13.41（ZmGLP1-4）~49.81（ZmGLP3-2）；脂肪族氨基酸指数为82.98（ZmGLP1-5）~104.33（ZmGLP6-3）；使用在线工具Plant-mPloc预测亚细胞定位，预测到45个ZmGLPs蛋白在细胞壁中表达。

2.2 玉米GLP基因家族成员的系统发育分析

为了研究玉米与其他植物GLP基因家族间的进化关系，利用邻接法构建了一个由142个GLP基因成员组成的系统发育树，包括玉米（45个）、拟南芥（32个）、水稻（43个）和谷子（20个）及2个前人研究鉴定出和AM共生相关的基因（MtGLP1、AsGLP1）^［17-18］（图1A）。结果发现，45个ZmGLP基因被分为5个亚家族，即Ⅰ~Ⅴ亚家族。其中，ZmGLP基因在第Ⅰ亚家族中成员最多，第Ⅲ亚家族最少（仅ZmGLP5-1）。其次，拟南芥的GLPs单独在第Ⅰ亚家族的1个分枝上聚集。与菌根共生相关的GLPs分布在第Ⅱ、Ⅳ亚家族，推测位于这2个亚家族分支的14个ZmGLP基因可能响应菌根共生。

2.3 玉米GLP的保守基序和基因结构分析

使用MEME程序分析ZmGLPs蛋白的保守基序，共鉴定10个保守基序（图1B、附图1（见本刊网站））。不同ZmGLPs蛋白包含的保守基序数量及种类存在差异，其中，ZmGLP1-2蛋白序列包含的保守基序数量最少（1个），多数ZmGLPs蛋白序列包含7个保守基序。所有ZmGLPs蛋白序列均含有完整的Cupin结构域。基因结构分析显示，31个ZmGLP基因仅含有1个内含子，12个ZmGLP基因无内含子，2个基因（ZmGLP4-14和ZmGLP3-2）含有2个内含子（图1B）。结合发育树发现，无内含子的ZmGLPs基因全部分布在第Ⅳ和第Ⅴ亚家族。

2.4 玉米GLP基因染色体定位及共线性分析

染色体定位分析发现，45个ZmGLPs基因不均匀地分布在9条染色体上（附图2（见本刊网站）），在9号染色体上没有ZmGLP基因。4号染色体上分布的ZmGLP基因最多（20个），紧随其后的是1和10号染色体，分别有5个和6个ZmGLP基因。2、3和6号染色体都分别含有3个ZmGLP基因。相比之下，7号染色体的基因数量最少，只有1个。根据基因在染色体上的定位，发现25个串联复制的ZmGLP基因，分别分布在1、4、10号染色体上，其中4号染色体上的复制基因簇最大，有18个串联重复基因，占ZmGLP基因家族成员的40%。为进一步探究ZmGLP基因是否发生了片段复制事件，对ZmGLP基因进行共线性分析，发现有6对片段复制基因（图2A），推测串联复制可能在ZmGLP基因家族的扩张中发挥了重要作用。通过对玉米GLP基因与双子叶植物拟南芥和单子叶植物水稻中GLP基因的共线性分析，发现玉米与水稻之间存在13对共线性GLP基因（图2B），但与拟南芥之间仅存在 2对（图2C），表明玉米GLP基因与拟南芥GLP基因进化关系较远，与水稻GLP基因进化关系较近。

2.5 玉米GLP基因启动子顺式作用元件分析

为了进一步探究ZmGLP基因表达可能的调控机制，将ZmGLP基因转录起始点上游区域 2 000 bp的序列作为推测启动子区域，对其上的顺式作用元件进行分析。结果显示，ZmGLP基因启动子区域包含多种反应元件，根据功能分为光响应、胁迫响应和生长发育（图3A、附图3A）。其中，有37个成员含有光响应元件（G-box），39个成员含有抗氧化剂响应元件（ARE），17个成员含有厌氧诱导响应元件（GC-motif）；此外，还包括玉米蛋白代谢（O2-site）和基因相关元件（I-box）。对共生相关的元件进行检测，发现多数ZmGLP基因家族成员都含有至少1个和菌根共生相关的顺式元件（图3B、附图3B）。其中，ZmGLP4-8启动子预测到菌根共生元件（MYCS），另有20个ZmGLP基因的启动子包含潜在的菌根共生相关元件GCCGGC，暗示这些基因很可能响应菌根共生。

2.6 玉米GLP基因家族的组织特异性表达分析

对ZmGLP基因家族的成员在不同玉米组织或器官中的相对表达水平进行分析发现，ZmGLP基因在不同部位的表达情况不同（图4、附图4）。在种子、花等生殖器官中，ZmGLP10-6、ZmGLP2-2等基因表达量较高；在根中，ZmGLP8-1、ZmGLP1-4、ZmGLP3-1、ZmGLP6-3、ZmGLP2-2和ZmGLP4-19等基因表达量都较高；在叶及茎等营养组织中，ZmGLP6-1、ZmGLP8-1和ZmGLP4-20等表达量均较高；对于分生组织来说，ZmGLP5-2、ZmGLP7-1和ZmGLP3-1在穗原基表达量较高。值得注意的是，在所有检测的组织中几乎都未检测到ZmGLP2-3、ZmGLP3-3、ZmGLP4-8、ZmGLP4-9、ZmGLP4-18、ZmGLP4-16和ZmGLP5-1等的表达。以上结果表明，ZmGLP基因家族成员在不同组织或器官中的表达有差异。

2.7 ZmGLP基因对丛枝菌根共生的响应

基于本课题组测序获得的不同时期玉米-AMF共生的根部转录组数据，分析ZmGLP基因的表达。根据ZmGLP基因在AMF接种后5、10、15、20、25、30、40 d的表达模式，可将ZmGLP基因分为4类，即显著下调、显著上调、无显著差异和无表达。其中，在接种AMF后的5、10、15、20、25、30、40 d出现差异表达（显著上调或者显著下调）的ZmGLP基因共有12个（图5）。与未接种AMF相比，ZmGLP2-1和ZmGLP2-2分别在接种AMF后的20 d和30 d下调表达。ZmGLP4-19、ZmGLP5-2和ZmGLP7-1在接种AMF后的早期（5 d）上调表达，ZmGLP2-3、ZmGLP3-3、ZmGLP4-8、ZmGLP4-16、ZmGLP4-20、ZmGLP5-1、ZmGLP6-1共7个基因在共生后期（30 d或40 d）上调表达。

为了进一步研究上述菌根共生后期上调表达的GLP基因是否参与菌根共生，利用玉米Mutator转座子突变体zmglp3-3研究ZmGLP3-3的功能（图6）。结果显示，野生型玉米植株接种AMF较未接种AMF的长势较好，根系较大；而突变体zmglp3-3植株接种和未接种AMF的植株表型没有明显差异（图6A）。测定植株的地上和地下部分干质量，发现接种AMF的野生型植株地上和地下部分干质量均显著高于未接种（图6B），而接种AMF的突变体zmglp3-3地上和地下部分干质量较未接种的突变体没有显著变化（图6C）。由菌根台盼蓝染色可见，野生型玉米菌根中有大量AMF的丛枝结构，而突变体zmglp3-3菌根几乎没有丛枝结构形成（图6D）。菌根定殖率统计显示，相较于野生型玉米植株，突变体zmglp3-3菌根定殖率显著降低（图6E）。因此，ZmGLP3-3基因的突变降低了AMF与玉米根部的共生，减少了丛枝的形成。

3 讨论

GLP蛋白家族是植物中一类具有重要生物学功能的蛋白家族^{［24， 34-35］}，前人已在许多植物中对其家族成员进行了全基因组鉴定。例如，在拟南芥、水稻和大豆中分别鉴定了32、43、69个GLP基因家族成员。本研究在玉米中鉴定出45个ZmGLP基因家族成员，其数量接近水稻，可能与它们进化关系较近有关。相较于早期的玉米GLP基因家族鉴定结果^［23］，本研究鉴定得到的玉米GLP基因家族多了18个成员，这可能是因为玉米数据库更新和近年来基因家族成员鉴定技术愈加成熟。本研究发现串联复制是玉米GLP基因扩张的主要动力和特点，这一观点与前人^［36］的研究结果一致。

根据系统发育树，ZmGLP基因家族成员被分为5个亚家族，其中第Ⅳ和第Ⅴ亚家族的ZmGLP基因仅含有1个外显子，即无内含子。已有研究^［37］发现，在受到环境刺激时，无内含子基因的表达量会迅速增加。组织表达模式显示，ZmGLP基因家族中的部分成员在不同的组织中呈现不同的表达模式，有些基因在所有检测组织中均未检测到表达，启动子顺式作用元件分析显示它们含有与生长、光照和胁迫响应相关的元件。已有研究^{［13，23，38］}发现，GLP基因在应对各种环境胁迫中发挥关键作用。GLPs被认为是一类重要的胁迫响应蛋白，它们在植物对逆境胁迫的响应中起到关键作用^［38］。因此，本研究推测ZmGLP基因具有快速响应不同胁迫的能力。

分析ZmGLP基因在AMF共生不同时期的表达量，发现12个玉米GLP基因响应了AMF的侵染过程，推测它们可能响应菌根共生过程。结合组织表达模式分析结果显示，ZmGLP2-3、ZmGLP3-3、ZmGLP4-8、ZmGLP4-16和ZmGLP5-1在所有检测组织中均未检测到表达；此外，ZmGLP2-3、ZmGLP3-3、ZmGLP4-16和ZmGLP5-1的启动子中包含潜在的菌根响应元件GCCGGC，ZmGLP4-8启动子中包含MYC元件^［39］，推测这5个基因可能是菌根诱导型基因。3个基因（ZmGLP4-19、ZmGLP5-2和ZmGLP7-1）在菌根共生的前期上调表达，暗示这些基因可能响应AMF的入侵，在共生的前期起作用。另外，有7个基因（ZmGLP2-3、ZmGLP3-3、ZmGLP4-8、ZmGLP4-16、ZmGLP4-20、ZmGLP5-1、ZmGLP6-1）在共生后期上调表达，暗示这些基因响应菌根共生且在共生后期发挥作用。研究ZmGLP3-3基因功能显示，ZmGLP3-3基因功能的丧失导致玉米与AMF共生下降，丛枝形成受阻，证实了ZmGLP3-3基因参与菌根共生。

本研究对ZmGLP基因家族成员进行了鉴定并对其中可能参与菌根共生的基因进行了预测，为进一步研究GLP基因的生物学功能提供了理论依据。ZmGLP3-3基因影响玉米与AMF的共生，且在菌根共生后期发挥作用，但相关调控机制还不明确，需要更深入探究。另外，本研究推测ZmGLP基因家族中的ZmGLP4-8、ZmGLP4-16、ZmGLP4-20、ZmGLP5-1和ZmGLP6-1在菌根共生过程中可能也扮演着重要角色，有必要进一步开展后续的功能研究。此外，有报道^{［13，23］}显示，玉米GLP基因在对抗黄曲霉、禾谷炭疽菌、玉米小斑病病菌（Bipolaris maydis）等时表现出强烈表达，其中ZmGLP1对茉莉酸处理有早期反应，并且在玉米小斑病病原菌感染下显著上调表达，暗示玉米GLP基因可能还在病原菌抗性调控中发挥重要作用。因此，研究ZmGLP基因家族对提高玉米稳产或提高玉米抗逆能力具有重要意义，同时，可为其他物种GLP基因家族的鉴定与功能分析提供基础。

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基金资助

云南省科技计划项目(202401BF070001-002)

云南省科技计划项目(202301AT070106)

云南省教育厅科学研究基金项目(KC-24248854)