不同植物来源内生菌提取物抗氧化、抗紫外及抑菌功能评价

Evaluation of Antioxidant, Anti-ultraviolet Radiation, and Antibacterial Functions of Endophytic Extracts from Different Plant Sources

摘要

该研究以不同植物来源的20株内生真菌为材料，检测不同菌株发酵提取物抗氧化、抑菌、抗紫外线辐射的活性及次生代谢产物含量，以期评价其在日化产品中的应用潜力。利用酶标仪比色法测定不同菌株发酵液和菌丝提取物中ABTS(2,2'-联氮双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二铵盐)、DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)自由基清除率；利用FRAP法（铁离子还原/抗氧化能力法）测定其对铁离子的还原能力；利用牛津杯法检测不同菌株的抑菌特性。结果显示：菌株XY1、YZ6、ZJ29、XG4-2和ZBS49的发酵液提取物表现出强抗氧化力，其中，ZJ29发酵液提取物DPPH自由基清除率最高，为93.62%;XY1发酵液提取物ABTS自由基清除率最高，达到90.47%。ZJ29发酵液提取物ABTS自由基清除率高于50%，且FRAP值最高，为2 974.55μmol·L-1。ZJ29和ZL18-1菌丝提取物酪氨酸酶抑制能力分别为60.62%和98.10%;ZJ29发酵液提取物酪氨酸酶抑制能力最强，为69.78%;ZJ29发酵液提取物对金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的抑制效率最高。YZ6、ZJ29发酵液提取物对UVA及UVB紫外线辐射吸收能力较强，2个菌株对UVB的吸光度均达2.8以上，YZ6、ZJ29发酵液提取物对UVA吸光度分别达到2.0和1.5以上；YZ6菌丝提取物也表现出对UVB、UVA强的抵抗能力，吸光度为1.5～2.5。YH3、XY1菌丝多酚和黄酮含量较高，多酚质量分数分别为18.47、15.36 mg·g-1，黄酮质量分数分别为4.35、7.15 mg·g-1。ZL23、ZJ29三萜含量较高，分别为16.79、11.20 mg·g-1。ZJ29提取物的抑菌、抗紫外线辐射、抗氧化功能均表现良好，综合能力最强，其次为YZ6和XY1。上述功能菌株提取物在日化产品开发中具有重要的应用潜力。

关键词

内生真菌 / 次生代谢产物 / 抗氧化 / 抗紫外线辐射 / 抑菌

Key words

endophytic fungi / secondary metabolites / antioxidation / anti-ultraviolet radiation / bacteriostasis

植物内生真菌可产生大量结构新颖、活性独特的次生代谢产物，有助于提高植物与环境的相容性，提高植物对逆境适应性^［1-2］，同时作为新型天然产物研发的关键来源^［3-4］，在医药、日化、农业生产方面受到广泛重视。

植物内生真菌的天然产物包括生物碱、甾体、萜类、大环内酯、有机酸、黄酮、醌类、香豆素类等^［5］。据估计至少还有130万种内生真菌资源有待挖掘，这为相关产物的研究和开发提供了巨大的资源库^［6］。大约30%的内生真菌能够产生具有抑菌活性的物质^［7］，还具有抗氧化、延缓衰老、抗癌、预防心脑血管疾病等功效^［8-9］。目前，利用药用植物内生真菌次生代谢产物生产药品或特殊功效日化产品的研究备受关注。Lu等^［10］从黄花蒿（Artemisia annua）和蒙古蒿（Artemisia mongolica）中分离得到大量内生真菌，其中，从黄花蒿茎部分离的炭疽菌属（Bacillus anthracis）的培养物中发现了6-异戊烯基吲哚-3-羧酸、3β，5α-二羟基-6β-乙酰氧基-麦角甾-7，22-二烯、3β，5α-二羟基-6β-苯乙酰氧基-麦角甾-7，22-二烯3种新型抗菌代谢物，具有抑制枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、藤黄八叠球菌（Sarcina lutea）和假单胞菌（Pseudomonas sp.）的功能。由银杏（Ginkgo biloba）叶内生菌中分离的球毛壳菌（Chaetomium globosum）对掷孢酵母（Saccharomyces cerevisiae）、蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）具有抑制作用^［11］。苏天骄^［12］研究来源于川贝母（Fritillaria cirrhosa）的18株内生真菌，筛选出对植物病原菌有良好拮抗作用的5株瓦布贝母（Fritillaria unibracteata）内生真菌，发现WBY2和WBY3菌株显示出良好的抑菌效果。另外，内生真菌产生的萜类^［13］、聚酮类^［14］、生物碱类^［3］等活性化合物具有抑制细菌和美白抗氧化作用^［15］，可有效预防皮肤衰老^［16］、抗炎镇痛^［17］、美白祛斑^［18-19］、深层清洁皮肤，并通过抑制酪氨酸酶抗黑色素沉积，增强日化品的美白抗氧化性，并且能够修复皮肤屏障^［20］，降低皮肤对外源细菌的易敏性^［21-22］。

对植物内生真菌次生代谢产生的活性物质进行研究与开发可显著提升植物及其共生菌株的价值和资源利用率，并有效解决次生代谢产物来源有限及生产周期长等实际应用问题。本研究以东北林业大学森林植物抗逆与细胞工程利用实验室前期筛选的20株富含多酚、黄酮和三萜等次生代谢产物的内生真菌为材料，研究抗氧化性、抑菌功能及抗紫外线辐射活性，以期挖掘内生真菌生物功能，为在日化产品开发中的应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 内生真菌

课题组前期分离自汉麻（Cannabis sativa）内生真菌菌株XZ13-2、YZ8-3、XJ4、YH4、YZ12、YH1-4、YZ5、YZ8-1、XY1、XG2-4、YH1-6、YZ6、YH3、YH1-11、XZ12、XG4-2，分离自山皂荚（Gleditsia japonica）内生真菌菌株ZJ29、ZL23、ZL18-1、ZBS49，共计20株。

1.1.2 指示菌

金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌来自课题组自存菌种。

1.1.3 试剂

马铃薯葡萄糖固体培养基（PDA）及液体培养基（PDB）；石油醚（30~60 ℃）、乙酸乙酯、维生素C、无水葡萄糖、琼脂粉、醋酸钠、三氯化铁、盐酸、硫酸亚铁和氯化钠等化学试剂均为国产分析纯；L-多巴、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2，2'-联氮双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二铵盐（ABTS）和2，4，6-三吡啶基三嗪（TPTZ）均来自MACKLIN公司；酪氨酸酶（tyrosinase，Tyr，25kU）来自北京博奥拓达科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 不同植物内生真菌发酵液提取物及菌丝提取物的制备

不同植物内生真菌活化培养1周后，接种于含有150 mL PDB液体培养基的三角瓶，每瓶接种6个菌饼，于28 ℃，135 r·min^-1摇床条件下培养9 d后收获发酵液。将全部发酵液用真空抽滤装置收集菌丝，置于烘箱内60 ℃烘干，研磨成粉。称取0.20 g菌粉用10 mL无水乙醇溶解，先进行超声波超声40 min，再继续过夜浸泡，备用。同时取去除菌丝的菌液80 mL进行减压蒸馏浓缩10倍，再用乙酸乙酯萃取2次，得到乙酸乙酯萃取液，取2 mL蒸干，再用1 mL无水乙醇复溶，备用。

1.2.2 抗氧化能力测定

1.2.2.1 DPPH自由基清除能力测定

不同植物内生真菌发酵液提取物和菌丝提取物分别设置3组对照试验样液，将试验样液及DPPH溶液放入96孔板27 ℃保温10 min后，用酶标仪测定吸光度，取3次重复平均值。参考苏天骄^［12］的方法测定DPPH自由基清除能力，以维生素C溶液（0.025 g·L^-1）作阳性对照。

1.2.2.2 ABTS自由基清除能力测定

参照Mwangi^［23］的方法配置ABTS检测工作液，并测定抗氧化活性。用微量移液器吸取15 µL供试液、180 µL ABTS工作液于96孔板，37 ℃条件下孵育30 min。蒸馏水调零后，在734 nm处用酶标仪测定吸光度。空白处理为供试液溶剂（无水乙醇）代替供试液加入ABTS工作液，每个处理3次重复。以0.025 g·L^-1维生素C溶液作阳性对照。ABTS自由基清除率＝（1-A ₁/A ₀）×100%，A ₁表示加入供试液后的吸光度，A ₀表示空白处理的吸光度。

1.2.2.3 铁离子还原能力测定

参考Thaipong等^［24］方法，即铁离子还原/抗氧化能力法（FRAP法），配置FRAP工作液进行检测。发酵液提取物和菌丝提取物分别设置3组试验样液，将试验样液及FRAP溶液放入96孔板后利用酶标仪在593 nm处测吸光度，绘制FeSO₄标准曲线，代入得到的吸光度求得相应FeSO₄浓度（μmol·L^-1）为FRAP值。

1.2.2.4 酪氨酸酶活性抑制率测定

参考苏天骄^［12］的方法略作修改，进行酪氨酸酶活性抑制率测定。称取1.25 mg酪氨酸酶，用蒸馏水溶解在5 mL容量瓶中，配制成0.25 g·L^-1酪氨酸酶溶液，迅速放入冰盒；阳性对照为不同质量浓度（0.025、0.050、0.100 g·L^-1）的维生素C。向96孔板中依次加入L-多巴、PBS磷酸盐缓冲液、样品维生素C，最后加入酪氨酸酶并立即置于酶标仪中，37 ℃恒温反应10 min，在475 nm处测定吸光度，每个样品3次重复。

1.2.3 抗紫外线辐射活性测定

不同植物内生真菌发酵液提取物和菌丝提取物分别设置3组试验样液，根据北京日用化学研究所研制的方法^［25］，利用可见紫外分光光度计对样品进行280~400 nm波谱扫描，获得样品在UVA（320~400 nm）和UVB（280~320 nm）波段抗紫外线辐射数据，从而判断样品的防晒效果。吸光度在［0，1.0）为最小防护效果，在［1.0，1.5）为中等防护效果，在［1.5，2.0）为高防护效果，在2.0及以上为最大防护效果。

1.2.4 抑菌活性测定

参考李祥荣^［26］、柳成东等^［27］的方法略作修改。发酵液提取物和菌丝提取物分别设置3组平行试验，即在每个培养皿中均匀放置4个牛津杯，形成4个加样孔，同一培养皿中发酵液提取物或菌丝提取物设立3组平行试验，无水乙醇作为空白对照。每个孔加注100 μL供试液，不同培养皿分别接种含有0.5%的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌种子液的LB培养基，以加入50 mg·L^-1氨苄青霉素作为阳性对照，测定菌丝提取物和菌丝发酵液对3种常见病原菌的抑菌活性，采用十字交叉法测量抑菌圈直径并记录，根据抑菌活性筛选具有抑菌功能内生真菌菌株。

1.2.5 不同溶剂及提取方式下不同菌株发酵液和菌丝提取物抗氧化活性分析

不同提取溶剂：2种提取试剂为乙酸乙酯和石油醚，除提取溶剂不同外，其他提取条件保持一致。提取后均用无水乙醇复溶，测定抗氧化活性和酪氨酸酶活性抑制率。

不同提取方式：对无水乙醇萃取获得的菌丝提取物进行超声波超声40 min，再将样液分别静置过夜和放置在摇床（150 r·min^-1，24 h）上振荡过夜。分别测定2种处理下菌丝提取物抗氧化活性和酪氨酸酶活性抑制率。

1.2.6 内生真菌菌丝中多酚、黄酮和三萜提取和含量测定

1.2.6.1 多酚样品制备及检测

菌丝中多酚样品制备及检测参考周曼等^［28］方法。准确吸取0.1 mL提取液，加入0.5 mL 10%福林酚试剂，然后加入1.4 mL 7.5%饱和碳酸钠溶液，再次混匀后，在避光室温（25 ℃）条件下反应30 min，在760 nm处测定吸光度。试验同时设定空白对照，以60%乙醇代替标准溶液，重复3次。

1.2.6.2 黄酮样品制备及检测

菌丝中黄酮样品制备及检测参考陶海腾等^［29］方法。准确吸取1 mL提取液于10 mL离心管中，加入200 μL 5%亚硝酸钠溶液，摇匀静置6 min，加入200 μL 10%硝酸铝溶液，摇匀静置6 min，加入2 mL 4%氢氧化钠溶液，再加入1.6 mL 50%乙醇，摇匀静置15 min，同时以50%乙醇为空白对照，重复3次，在550 nm处测定吸光度。

1.2.6.3 三萜样品制备及检测

菌丝中三萜样品制备及检测参考李春晓等^［30］方法。移取100 μL提取液于10 mL离心管中，70 ℃水浴蒸干，加入200 μL 5%香草醛-冰醋酸溶液，再加入800 μL高氯酸后摇匀，放入70 ℃恒温水浴15 min，冷却至室温，加乙酸乙酯定容至5 mL，以等量提取溶剂（不含提取物质）作为空白样液进行上述操作，作为空白对照组，重复3次，在551 nm处测定吸光度。

1.2.7 数据处理

利用Microsoft Excel 2019软件对数据进行收集和预处理，采用IBM.SPSS Statistics 26.0统计软件进行正态分布和方差齐性检验，在内生真菌提取物抗氧化活性评价和酪氨酸酶活性抑制率比较中采用单因素方差分析和邓肯（Duncan）多重比较分析进行显著性差异检验（P<0.05为差异显著），在内生真菌提取物抗氧化活性比较中采用独立样本t检验（*.P<0.05；**.P<0.01；***.P<0.001），利用Microsoft Excel 2019及Origin 2024绘图。

2 结果与分析

2.1 不同植物内生真菌提取物的抗氧化活性评价

2.1.1 内生真菌发酵液提取物抗氧化活性分析

由图1可知，不同植物内生真菌提取物抗氧化活性差异显著。菌株XY1、YZ6、ZJ29的发酵液提取物对DPPH自由基清除率均超过50%，其中，菌株ZJ29对自由基清除率最高，为93.62%（图1A）。菌株YZ5、XY1、YZ12、YZ8-1、YH1-6、XG2-4、YZ6、ZJ29、ZL18-1、ZBS49对ABTS自由基清除率均超过50%，其中，菌株XY1对ABTS自由基清除率达90.47%（图1B）。FRAP法对不同菌株发酵液提取物抗氧化能力的评价结果显示，菌株XY1、YZ6、ZJ29的FRAP值显著高于其他菌株，其中，菌株ZJ29的FRAP值最高，为2 974.55 μmol·L^-1（图1C）。综上分析显示，不同菌株发酵液提取物大多表现出良好的自由基清除能力和显著的铁离子还原能力，菌株XY1、YZ6和ZJ29的发酵液提取物在3种指标上均表现出强抗氧化性。

2.1.2 内生真菌菌丝提取物抗氧化活性评价

不同植物内生真菌菌丝提取物的DPPH自由基清除率、ABTS自由基清除率、铁离子还原能力存在显著差异（图2）。其中，菌株ZJ29菌丝提取物的DPPH自由基清除率和FRAP值均为最高；菌株ZL18-1菌丝提取物的ABTS自由基清除能力最强，清除率为44.89%，菌株XY1次之。菌株YZ12、YZ6、ZJ29、ZBS49均表现较强的铁离子还原能力（图2C），其中，菌株ZJ29最强，FRAP值为977.88 μmol·L^-1。综合3种不同抗氧化指标的评价结果可见，菌株ZJ29菌丝提取物表现出更强的抗氧化性。

2.1.3 不同植物内生真菌发酵液及菌丝提取物对酪氨酸酶活性抑制活性

不同植物内生真菌的发酵液提取物均表现为抑制酪氨酸酶活性且存在差异（图3）。菌株ZJ29发酵液提取物对酪氨酸酶活性抑制率最高，为69.78%；菌株ZL23发酵液提取物抑制酪氨酸酶活性能力较弱，为42.01%；其余有14种内生真菌发酵液提取物对酪氨酸酶活性抑制率超过50%（图3A）。

不同植物内生真菌菌丝提取物对酪氨酸酶活性抑制程度具有显著差异。菌株ZL18-1、YH1-6、YH3、ZL23和ZJ29菌丝提取物抑制酪氨酸酶活性能力较强，抑制率为59.71%~98.10%，其中，菌株ZL18-1菌丝提取物对酪氨酸酶活性抑制率最高，为98.10%；而菌株YH1-11、XJ4和YZ5产生的抑制率最低，不足10%（图3B）。

2.2 不同植物内生真菌发酵液和菌丝提取物抑菌活性评价

不同植物内生真菌发酵液乙酸乙酯提取物和菌丝乙醇提取物具有抑制大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌功能，其中，来源于山皂荚的菌株ZJ29发酵液提取物对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌3种病原菌均具有抑制作用，且抑菌圈直径在21 mm以上，抑菌能力强于其他内生真菌（图4A~4E）。菌株ZJ29菌丝提取物同样对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌表现出较强的抑制效果，YZ8-3菌丝提取物对大肠杆菌显示强抑制效果（图4G~4I）。综上结果表明：ZJ29发酵液和菌丝提取物中有更丰富的代谢产物，抑菌作用最强；其次，XZ13-2发酵液提取物和YZ8-3菌丝提取物对病原菌表现出较强的抑制效果。

2.3 不同植物内生真菌发酵液和菌丝提取物抗紫外线辐射活性评价

通过抗氧化、抑制酪氨酸酶活性及抑菌活性指标评价，筛选6株菌株（XZ13-2、YZ8-3、XY1、YZ6、ZJ29、ZL23）进行抗紫外线辐射活性测试。根据防晒效果评价指标判断，菌株YZ6、ZJ29发酵液在UVB和UVA区间的吸光度显著高于其他菌株，2个菌株对UVB的吸光度均达2.8以上；YZ6、ZJ29对UVA吸光度分别达到2.0和1.5以上（图5A），说明2个菌株发酵液提取物具有强的抵抗紫外线辐射活力。

同样，YZ6菌丝提取物也表现出对UVB、UVA强的抵抗能力，吸光度为1.5~2.5；另外，XY1菌丝提取物对UVB吸光度也超过2.0，表现出较强的抗UVB能力，但未表现出对UVA的抵御能力；ZJ29、ZL23菌丝提取物表现出中等的UVB、UVA抵御能力（图5B）。综上结果显示：YZ6、ZJ29发酵液对UVB和UVA紫外线吸收能力最强，且表现为对伤害性更大的短波长UVB抵御能力高于UVA；另外，YZ6菌丝提取物对UVB、UVA及XY1对UVB也表现出突出的抗紫外线辐射活性。

2.4 不同溶剂及提取方式下内生真菌发酵液和菌丝提取物的抗氧化能力比较

2.4.1 DPPH自由基清除率比较

由图6可知，不同植物内生真菌发酵液乙酸乙酯提取物相对于石油醚提取物表现更佳，乙酸乙酯提取物中，菌株XG4-2、YZ6、ZJ29对DPPH自由基清除率分别为75.84%、58.05%、47.05%，石油醚提取物对DPPH自由基清除率整体偏低（图6A）。不同菌株菌丝经过无水乙醇浸泡振荡提取后，提取物对DPPH自由基的清除能力显著增强，其中，菌株ZJ29对DPPH自由基清除率最高，为41.02%，约为静置处理的2倍（图6B）。

2.4.2 ABTS自由基清除率比较

不同植物内生真菌发酵液乙酸乙酯提取物相对于石油醚提取物的ABTS自由基清除率表现更强（图7），其中，菌株ZJ29、XG4-2、YZ6和ZL23的乙酸乙酯提取物的ABTS自由基清除率分别达到了77.40%、76.23%、76.05%和65.94%，石油醚提取物的ABTS自由基清除率整体偏低（图7A）。不同菌株菌丝经过振荡24 h处理后无水乙醇提取物对ABTS自由基清除能力得到显著增强，其中，菌株ZJ29、ZL23的ABTS自由基清除率分别为66.56%、58.32%，显著高于静置处理（图7B）。

2.4.3 铁离子还原能力（FRAP）比较

不同菌株发酵液的乙酸乙酯提取物铁离子还原能力差异显著（图8），其中，菌株YZ6的FRAP值最高，为195 μmol·L^-1，其次为菌株ZJ29、XG4-2、XZ13-2，3个菌株发酵液提取物铁离子还原能力差异不显著，FRAP值为102.60~117.67 μmol·L^-1。ZL23和XY1菌株的发酵液石油醚提取物FRAP值显著高于乙酸乙酯提取物。除菌株ZJ29、ZL23提取物外，其他内生真菌菌丝的无水乙醇提取物经过振荡提取后抗氧化能力均有提高，其中，菌株XY1和XZ13-2的FRAP值是静置处理的2.5倍以上。

2.4.4 酪氨酸酶活性抑制率比较

菌株ZL23、ZJ29发酵液提取物对酪氨酸酶活性抑制能力均较高，抑制率分别为21.37%、19.52%，但同一菌株不同处理间差异不显著（图9A）。菌株XY1的酪氨酸酶活性抑制率处理间差异显著，石油醚提取处理显著高于乙酸乙酯提取。菌株ZL23、XY1、ZJ29菌丝无水乙醇提取物静置处理对酪氨酸酶活性抑制能力均较高，抑制率为62.63%~75.71%；但菌株XG4-2菌丝无水乙醇提取物振荡处理对酪氨酸酶活性的抑制能力最佳，达63.86%，比相同提取方式的其他菌株高出26.30%~31.69%。

2.5 不同植物内生真菌菌丝次生代谢产物含量分析

不同植物内生真菌菌株次生代谢产物含量分析显示（图10），菌株YH3和XY1菌丝中多酚和黄酮质量分数较高，多酚质量分数分别为18.47 mg·g^-1和15.36 mg·g^-1，黄酮质量分数分别为4.35 mg·g^-1和7.15 mg·g^-1。菌株ZL23和ZJ29菌丝中三萜质量分数较高，分别为16.79 mg·g^-1和11.20 mg·g^-1。上述结果说明，菌株YH3、XY1、ZL23和ZJ29菌丝在次生代谢产物合成方面具有重要的应用潜力。

3 讨论

日化产品作为生活用品，其保护功效、安全性是重要的考量标准。植物内生真菌作为宿主共生个体，能够分泌大量与宿主相似的、甚至优于宿主本身分泌的、具有药用活性的次生代谢产物，在日化产品应用方面具有重要的应用潜力。另外，微生物易于培养，繁殖快，可进行大规模发酵，是进行天然产物快速生产的有效途径。药用植物内生真菌次生代谢物优越的抗氧化及抑菌活性主要源于多酚、黄酮和萜类等化合物，其中，黄酮参与细胞紫外线损伤修复，而多酚类物质是多种抗炎抗菌药物的合成代谢前体^［31-33］。

本研究选用的20株内生真菌，均为实验室前期筛选的具有丰富的次生代谢产物功能的菌株，其中，XZ13-2、XG4-2、YZ8-3、XJ4等16个菌株来自富含酚类的草本植物汉麻；菌株ZJ29、ZL23、ZL18-1、ZBS49来自具有丰富三萜皂苷的木本植物山皂荚。本研究中，不同内生真菌菌株次生代谢产物含量分析显示，菌株YH3和XY1内生真菌菌丝中多酚和黄酮含量较高，多酚质量分数分别为18.47 mg·g^-1和15.36 mg·g^-1，黄酮质量分数分别为4.35 mg·g^-1和7.15 mg·g^-1。三萜质量分数较高的菌株为ZL23和ZJ29，分别为16.79 mg·g^-1和11.20 mg·g^-1。上述结果说明：菌株YH3、XY1、ZL23和ZJ29在次生代谢产物合成方面具有重要的应用潜力。

自由基具有强氧化性，易引起衰老及多种疾病，因此抗氧化和自由基清除能力是功能产品评价的重要指标^［34］。酪氨酸酶分布于人体各组织器官，其反应产物酪氨酸可催生黑色素，使皮肤变黑甚至诱发肿瘤，因此，抑制酪氨酸酶活性也是护肤品重要评价指标之一^［35］。MNJ-9乳酸菌的酪氨酸酶活性抑制率可达68.9%^［36］，新疆大阪城盐湖分离出的盐水球菌（Salinicoccus ventosaetal）B2-3-5代谢产物提取物酪氨酸酶活性抑制率达67%^［37］。市面上日化产品多数添加胶原蛋白、多糖等物质，导致日化产品易被细菌污染，其中，最易感染菌群包括金黄色葡萄球菌和大肠杆菌。具有抑菌功能的产品可以提高产品的安全性。有研究^［38］报道，不动杆菌（Acinetobacter pittii）AM3-2发酵上清液对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）的平均抑菌圈直径分别为（15.04±0.14）、（19.56±0.35）、（11.83±1.46） mm。黄精（Polygonatum sibiricum）提取物具有DPPH自由基清除活性，清除率为44.71%^［39］。胡宇航等^［40］研究结果显示，1.0 g·L^-1的三叶青（Tetrastigma hemsleyanum）正丁醇萃取物对ABTS阳离子自由基清除率为（77.60±1.50）%。罗汉果（Siraitia grosvenorii）醇沉胞外多糖质量浓度在10 g·L^-1时，对DPPH自由基清除率是（35.15±0.21）%^［41］；而来自紫金牛（Ceratophyllum demersum）根部的３株内生真菌对DPPH自由基清除率均大于90%^［42］。鱼腥草（Houttuynia cordata）内生真菌J3发酵液对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径为11 mm^［43］；超声辅助提取的红树莓（Rubus idaeus）内生真菌ZQFG2发酵液对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度为3.125 g·L^-1［44］。本研究中，菌株ZJ29的DPPH自由基清除率高达93.62%，菌株ZJ29对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌及金黄色葡萄球菌均具有显著抑制能力，抑菌圈直径大于21 mm。菌株ZJ29发酵液提取物具有显著的抗紫外线辐射能力，对UVA的吸光度为1.3~3.3（图5），其酪氨酸酶活性抑制率为69.78%；菌株YZ6抗紫外线辐射效果同样显著，YZ6发酵液提取物在波长280~400 nm的吸光度为2.0~3.6，其菌丝提取物在UVA段的吸光度为1.5~2.0。上述结果说明：本研究中筛选获得菌株ZJ29、YZ6、XY1等提取物可以为抗氧化、抑菌、抗紫外线辐射相关产品开发提供原材料。菌株YH3在多酚合成、菌株XY1在黄酮合成及菌株ZL23和ZJ29在三萜合成方面均具有重要功能（图10）。多酚是具有多个酚羟基的化学物质，黄酮属于多酚的一种，黄酮的基本骨架为1个C6-C3-C6的结构，含有2个苯环及1个氧原子，黄酮分子中的羟基能够与自由基反应，减少氧化应激。三萜基本结构是由6个异戊二烯单位通过聚合反应连接而成的C30骨架，三萜类化合物中的羟基、双键和共轭系统使其具有抗氧化活性，这可能是上述菌株具有强的抗氧化性、抑菌和抗紫外线辐射活性的主要原因。

4 结论

以不同植物来源的20株内生真菌为材料，评价其提取物在日化产品中的应用潜力。结果显示，菌株XY1、YZ6、ZJ29、XG4-2和ZBS49的发酵液提取物表现出强抗氧化能力，其中，菌株ZJ29发酵液DPPH自由基清除率最高，为93.62%；菌株XY1、YZ6和ZJ29的FRAP值为1 226.04~2 974.55 μmol·L^-1。菌株ZJ29和ZL18-1菌丝提取物的酪氨酸酶活性抑制能力分别为60.62%和98.10%；菌株ZJ29发酵液提取物酪氨酸酶活性抑制能力最强，为69.78%；菌株ZJ29发酵液提取物对金黄葡萄球菌的抑制效率最高；菌株YZ6、ZJ29发酵液提取物对UVB和UVA紫外线辐射吸收能力最强，且表现出对伤害性更大的短波长UVB抵御能力高于UVA；另外，菌株YZ6菌丝提取物对UVB、UVA及XY1对UVB也表现出突出的抗紫外线辐射功能。综上结果显示：菌株ZJ29抑菌、抗紫外线辐射、抗氧化活性均表现良好，其次是菌株YZ6和XY1。上述功能菌株提取物在日化产品开发中具有重要的应用潜力。

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基金资助

黑龙江省自然科学基金项目(ZD2023C004)

东北林业大学本科创新项目(202310225164)

黑龙江省省属科研院所基本科研业务费项目(ZNBZ2023GJS06)

东北林业大学本科教育教学改革项目(DGYGJ2022-02)