二倍体青钱柳愈伤组织诱导及次生代谢物积累

Callus Induction and Secondary Metabolites Accumulation of Diploid Cyclocarya paliurus

摘要

为探索激素组合对二倍体青钱柳（Cyclocarya paliurus）愈伤组织诱导和增殖的影响，以及继代增殖过程中主要次生代谢产物的积累规律，该研究以二倍体青钱柳叶片为外植体材料，采用正交试验设计，研究不同激素组合对愈伤组织诱导和继代增殖过程中次生代谢物积累的影响，以总三萜、总多酚、总黄酮、粗多糖产量为指标，采用熵权法筛选优良继代配方。处理2（0.5 mg⋅L^-1 6-BA+1 mg⋅L^-1 2，4-D+0.2 mg⋅L^-1 NAA）下二倍体青钱柳愈伤组织诱导率最高，为100%，其次是处理9（2.5 mg⋅L^-1 6-BA+1.5 mg⋅L^-1 2，4-D+0.2 mg⋅L^-1 NAA）和处理5（1.5 mg⋅L^-1 6-BA+1 mg⋅L^-1 2，4-D+0.4 mg⋅L^-1 NAA），愈伤组织诱导率分别为96.67%、93.64%。影响诱导率的因素主次顺序为2，4-D>NAA>6-BA，2，4-D最佳质量浓度为1.0 mg⋅L^-1，NAA最佳质量浓度为0.2 mg⋅L^-1，6-BA无显著影响；诱导出的愈伤组织颜色有嫩绿色、黄绿色，愈伤组织形态均呈现疏松质地。采用不同激素组合配方进行继代增殖，各处理的愈伤组织生长及代谢产物积累存在差异，同一处理下不同继代增殖过程中愈伤组织生长性状变化也较大；按综合得分排序第1的配方为处理4（0.2 mg⋅L^-1 KT+0.5 mg⋅L^-1 6-BA+0.75 mg⋅L^-1 NAA+0.4 mg⋅L^-1 2，4-D），得分为0.44，其次是处理2（0.75 mg⋅L^-1 6-BA+0.75 mg⋅L^-1 NAA+0.2 mg⋅L^-1 2，4-D）和处理6（0.2 mg⋅L^-1 KT+1.0 mg⋅L^-1 6-BA+0.5 mg⋅L^-1 NAA+0.2 mg⋅L^-1 2，4-D），综合得分分别为0.31、0.26。处理4下愈伤组织继代培养至第8代时，主要次生代谢物产量普遍达到较高水平，总三萜产量为28.91 mg⋅瓶^-1，总多酚产量为6.89 mg⋅瓶^-1，总黄酮产量为1.77 mg⋅瓶^-1，粗多糖产量为57.45 mg⋅瓶^-1。综上，最佳的二倍体青钱柳愈伤组织诱导配方为MS+0.5 mg⋅L^-1 6-BA+1.0 mg⋅L^-1 2，4-D+0.2 mg⋅L^-1 NAA，继代增殖配方为MS+0.2 mg⋅L^-1 KT+0.5 mg⋅L^-1 6-BA+0.75 mg⋅L^-1 NAA+0.4 mg⋅L^-1 2，4-D。该研究可为利用青钱柳愈伤组织培养及进一步的细胞悬浮培养生产次生代谢物提供参考。

Abstract

This study aimed to explore the effects of hormone combination on callus induction and proliferation of diploid Cyclocarya paliurus and the accumulation of main secondary metabolites during subculture. The effects of different hormone combinations on accumulation of secondary metabolites during callus induction and subproliferation were investigated using diploid C. paliurus leaves as explants by orthogonal experiment design. An optimal treatment for the maximum yields of total triterpenoids， total polyphenols， total flavonoid and crude polysaccharides were selected by entropy weight method. The highest callus induction rate was 100% in treatment 2（0.5 mg⋅L^-1 6-BA+1 mg⋅L^-1 2，4-D+0.2 mg⋅L^-1 NAA）， followed by treatment 9 （2.5 mg⋅L^-1 6-BA+1.5 mg⋅L^-1 2，4-D+0.2 mg⋅L^-1 NAA） and treatment 5（1.5 mg⋅L^-1 6-BA+1 mg⋅L^-1 2，4-D+0.4 mg⋅L^-1 NAA）， with an induction rate of 96.67% and 93.64%， respectively. The order of factors affecting callus induction rate was 2，4-D， NAA， 6-BA. An optimal concentration of 2，4-D and NAA was 1.0 mg⋅L^-1 and 0.2 mg⋅L^-1， with no significant effect of 6-BA. The colors of induced callus were light green and yellowish green； the morphology of the callus was characterized by loose texture. There were differences in the callus growth and accumulation of secondary metabolites among treatments when different combinations of hormones were used for subculture； the growth characteristics of calli in the same treatment changed greatly during continuous subculture. The first ranked formula was treatment 4 （0.2 mg⋅L^-1 KT+0.5 mg⋅L^-1 6-BA+0.75 mg⋅L^-1 NAA+0.4 mg⋅L^-1 2，4-D） with a score of 0.44，followed by treatment 2（0.75 mg⋅L^-1 6-BA+0.75 mg⋅L^-1 NAA+0.2 mg⋅L^-1 2，4-D） and treatment 6（0.2 mg⋅L^-1 KT+1.0 mg⋅L^-1 6-BA+0.5 mg⋅L^-1 NAA+0.2 mg⋅L^-1 2，4-D） with a score of 0.31 and 0.26， respectively. The yield of secondary metabolites in treatment 4 generally reached a high level from the 8th generation， with total triterpenoid yield of 28.91 mg⋅bottle^-1， total polyphenol yield of 6.89 mg⋅bottle^-1， total flavonoid yield of 1.77 mg⋅bottle^-1，and crude polysaccharide yield of 57.45 mg⋅bottle^-1. In summary， the optimal formula for callus induction of diploid C. paliurus was MS+0.5 mg⋅L^-1 6-BA+1.0 mg⋅L^-1 2，4-D+0.2 mg⋅L^-1 NAA. The subculture proliferation formula was MS+0.2 mg⋅L^-1 KT+0.5 mg⋅L^-1 6-BA+0.75 mg⋅L^-1 NAA+0.4 mg⋅L^-1 2，4-D. This study provided a reference for production of secondary metabolites by callus culture and further cell suspension culture.

Graphical abstract

关键词

青钱柳 / 愈伤组织诱导 / 植物激素 / 继代增殖 / 次生代谢物

Key words

Cyclocarya paliurus / callus induction / plant hormone / subculture proliferation / secondary metabolites

青钱柳（Cyclocarya paliurus）又名摇钱树、甜茶树等，是胡桃科（Juglandaceae）青钱柳属（Cyclocarya）植物，为中国特有的单种属植物，主要分布于中国亚热带地区^［1］。青钱柳的叶、根、树皮均可入药，具有清热解毒、止痛等功效^［2］。民间多用其叶泡茶或作为中药配方，工厂也将其制为功能性产品^［3］。目前，已从青钱柳叶中分离得到百余种化合物成分，其中包括青钱柳特有的三萜皂苷化合物，如青钱柳苷A、青钱柳苷B、青钱柳酸B^［4］等。药理学研究^［5-7］证实，青钱柳叶具有明显的降血糖、降血脂、降血压、抗氧化和抑菌等功效，这主要归因于其叶片中富含的三萜类、多酚类、黄酮类、多糖类及甾体、内酯等多种生物活性物质的协同作用。青钱柳作为药食两用树种，具有确切的功效性和良好的安全性，在新药研制和保健产品开发方面有着广阔的应用前景^［8］。但青钱柳种子饱满率低且有深度休眠的特性^［9］，同时，扦插和嫁接成活率也较低^［10］，繁殖较困难，严重制约了青钱柳的深度开发利用。课题组前期研究^［11］表明，青钱柳在自然界中存在二倍体（2n=2x=32）和同源四倍体（2n=4x=64）2种细胞型，其中，二倍体青钱柳叶片中的总黄酮、总多酚含量显著高于四倍体。然而，天然林分中二倍体资源非常少^［12］，难以满足市场需求。

组织培养作为重要的现代生物技术之一，具有生产周期短、突破季节限制、可控性强、易于工厂化生产等优点^［13］。愈伤组织作为组培中的基本研究材料^［14］，在次生代谢物合成、遗传转化^［15］、植株再生^［16］及多倍化^［17］中发挥重要作用。阮氏钏等^［18］研究发现，MS培养基有利于青钱柳细胞干质量增加与次生代谢物积累。因此，本研究选用MS为基本培养基。采用不同激素配比制造适宜的培养环境，不仅能够促进愈伤组织增殖，还有利于控制次生代谢物合成^［19-20］。如Rashmi和Trivedi^［21］研究发现，单独使用激动素（KT）无法诱导夹竹桃（Nerium odorum）愈伤组织形成，而在添加生长素（2，4-D、NAA）的MS培养基中配合使用KT提高了愈伤组织的生长量。不同激素组合处理鼠尾草（Salvia tebesana Bunge）^［22］愈伤组织后，多酚类和类黄酮化合物的积累量均有所增加，其激素组合有效性顺序为2，4-D+6-BA、NAA+6-BA、2，4-D+NAA，说明细胞分裂素和生长素协同使用更有利于愈伤组织次生代谢物积累。目前，学者们已开展了关于青钱柳愈伤组织的诱导及增殖条件^［23-24］、褐化缓解^［25-26］、悬浮体系建立^［27-28］等研究，但以二倍体青钱柳为材料进行愈伤组织培养尚未见报道。本研究以二倍体青钱柳叶片为外植体，采用正交试验设计，研究不同激素组合对愈伤组织诱导和继代培养过程中次生代谢物积累的影响，筛选出适合二倍体青钱柳愈伤组织诱导和增殖的最佳配方，为利用青钱柳愈伤组织培养及进一步的细胞悬浮培养生产有效成分提供参考。

1 材料与方法

1.1　试验材料

湖北五峰种源二倍体（2n=2x=32）2年生青钱柳盆栽苗，为课题组前期筛选的主要次生代谢物含量较高的优良单株。

1.2　试验方法

1.2.1　外植体消毒

2024年5月初，采集二倍体青钱柳嫩叶，用体积分数为1%的洗洁精水浸泡1 min，再流水处理30 min。在超净工作台上对叶片进行表面灭菌：用体积分数75%乙醇浸泡消毒30 s，无菌水冲洗3次，体积分数2%次氯酸钠溶液消毒140 s，无菌水冲洗5次，再用解剖刀分割为0.5 cm×0.5 cm的叶块备用。

1.2.2　愈伤组织诱导培养基激素组合筛选

采用6-BA、2，4-D、NAA 3因素、3水平L₉（3³）正交试验设计（表1）筛选愈伤组织诱导培养基的激素种类及浓度，共9种处理。以MS为基本培养基，添加30 g·L^-1蔗糖+6.5 g·L^-1琼脂，pH调至5.8。取切割好的叶块，每处理接种10瓶，每瓶接种1个叶块，重复3次。接种后暗培养10 d后再光照培养20 d，定期观察记录，30 d后统计愈伤组织诱导率。愈伤组织诱导率=（产生愈伤组织的外植体数/未污染外植体总数）×100%。培养温度（23±2） ℃，光照时间16 h/d，光照强度为2 000 lx，相对湿度50%~70%。

1.2.3　愈伤组织继代增殖培养基激素组合筛选

采用KT、6-BA、NAA、2，4-D共4因素、3水平L₉（3⁴）正交试验设计（表2）筛选愈伤组织继代增殖培养基的激素种类及浓度，共9种处理。以MS为基本培养基，添加30 g·L^-1蔗糖+6.5 g·L^-1琼脂，pH调至5.8。取1.2.2中诱导状态一致的绿色愈伤组织为材料，每种处理接种15瓶，每瓶接种3块愈伤组织作为重复，每块愈伤组织鲜质量为0.3 g。光照培养，每20 d继代1次，观察记录愈伤组织的颜色质地，并于每次继代转接前，测定鲜质量，并收获部分愈伤组织置于烘箱60 ℃烘至恒质量，计算干质量。光照培养条件同1.2.2。

1.2.4　次生代谢物含量测定与产量计算

将各处理不同继代次数的愈伤组织干样制成粉末，参照林源等^［29］的方法提取次生代谢物，参照Xie等^［30］的方法测定总多酚含量，参照Zhou等^［31］的方法测定总黄酮含量，参照Fan和He^［32］的方法测定总三萜含量，参照Fu等^［33］的方法提取与测定粗多糖。由于早期愈伤组织生物量较小，难以满足继代扩繁需求，因此，未对第1、3次继代材料进行主要次生代谢物含量测定。

次生代谢物含量以1 g青钱柳愈伤组织干样中含有次生代谢物的质量表示（mg·g^-1）；次生代谢物产量以次生代谢物含量与相应愈伤组织干质量的乘积表示（mg·瓶^-1）。

1.2.5　优良继代增殖培养基配方的筛选评价

使用熵权法^［34］筛选优良继代增殖培养基配方，标准化处理不同继代增殖培养基配方中愈伤组织的指标值，利用指标权重计算各继代增殖培养基配方综合得分，公式为

W_j=\frac{D_j}{{\displaystyle \sum _{j=\mathrm{1}}^m}{D}_j}（1）

D={\displaystyle \sum _{i=\mathrm{1}}^n}{W}_j{H}_{ij}（2）

式中：W_j为指标权重；m为指标数；D_j 为指标差异系数；D为综合得分；n为样本数；H_ij 为第j指标第i样本标准化后的值。

1.3　数据处理

运用Excel 2021和SPSS 27.0软件对愈伤组织诱导数据进行统计与正交方差分析和极差分析，采用SPSS 27.0软件对愈伤组织增殖数据进行单因素ANOVA检验及LSD差异显著性分析（P<0.05），采用Oringin Pro 2024软件作图。

2 结果与分析

2.1　激素处理对二倍体青钱柳叶片愈伤组织诱导的影响

如图1所示，接种5 d时各处理均出现愈伤组织，10 d时各处理愈伤组织均为嫩绿色，而处理1（0.5 mg·L^-1 6-BA+0.5 mg·L^-1 2，4-D）的愈伤组织较小且有褐化迹象，20 d时除处理5与处理9以外的其他处理组的部分愈伤组织出现由绿变黄绿的迹象，其中，处理5（1.5 mg·L^-1 6-BA+1.0 mg·L^-1 2，4-D+0.4 mg·L^-1 NAA）和处理9（2.5 mg·L^-1 6-BA+1.5 mg·L^-1 2，4-D+0.2 mg·L^-1 NAA）的愈伤组织颜色均为嫩绿色。9个处理的愈伤组织均呈现疏松的形态质地。

由表3可知，正交设计9个处理组合的愈伤组织诱导率达极显著差异水平（F=9.34，P<0.01），其中，处理2的愈伤组织诱导率最高，达到100%；处理1的愈伤组织诱导率最低，仅为59.05%；处理9和处理5的愈伤组织诱导率相对较高，分别为96.67%和93.64%。影响二倍体青钱柳叶片愈伤组织诱导率的3因素主次顺序为2，4-D、NAA、6-BA。由表4可知，2个因素2，4-D、NAA对二倍体青钱柳叶片的愈伤组织诱导存在显著影响（P<0.05），6-BA对二倍体青钱柳叶片愈伤组织诱导无显著影响。诱导最优处理组合为A3B2C2，即2.5 mg·L^-1 6-BA+1.0 mg·L^-1 2，4-D+0.2 mg·L^-1 NAA，因6-BA对愈伤组织诱导无显著影响，高浓度细胞分裂素易使愈伤组织玻璃化，且处理2诱导率可达100%，故认为处理2是适宜的诱导激素组合，为0.5 mg·L^-1 6-BA+1.0 mg·L^-1 2，4-D+0.2 mg·L^-1 NAA。

2.2　继代增殖培养过程愈伤组织颜色和质地的变化

培养2代后，9个处理的愈伤组织呈现不同的颜色和形态质地（图2）。处理1、3、7、8的愈伤组织颜色均由嫩绿色转变为黄绿色，形态质地细碎不聚团且出现水渍化、褐化现象。处理2（0.75 mg·L^-1 6-BA+0.75 mg·L^-1 NAA+0.2 mg·L^-1 2，4-D）和处理9（0.4 mg·L^-1 KT+1.0 mg·L^-1 6-BA+0.75 mg·L^-1 NAA）的愈伤组织颜色为黄绿色且顶端泛白，处理2的形态质地部分致密、部分疏松，而处理9的愈伤组织形态质地由疏松变为致密。处理4（0.2 mg·L^-1 KT+0.5 mg·L^-1 6-BA+0.75 mg·L^-1 NAA+0.4 mg·L^-1 2，4-D）和处理5（0.2 mg·L^-1 KT+0.75 mg·L^-1 6-BA+1.0 mg·L^-1 NAA）的愈伤组织颜色为嫩绿色，形态质地疏松。处理6（0.2 mg·L^-1 KT+1.0 mg·L^-1 6-BA+0.5 mg·L^-1 NAA+0.2 mg·L^-1 2，4-D）的愈伤组织颜色嫩绿且顶端泛白，形态质地疏松。

因处理1、3、7、8的状态过差，无法进行继代增殖，因此，后续试验仅对处理2、4、5、6、9的愈伤组织生物量及主要次生代谢物含量进行测定。

2.3　继代增殖培养过程愈伤组织生物量的变化

处理2、4的愈伤组织鲜质量随着继代次数的增加，整体呈现上升趋势；处理2愈伤组织鲜质量在第2~6代逐渐增加，在第9代和第12代出现峰值，第12代的鲜质量最大，为15.42 g·瓶^-1，增殖倍数为17.13；处理4愈伤组织鲜质量在第2~5代逐渐增加，在第8代和第12代出现峰值，第12代的鲜质量达到最大，为17.54 g·瓶^-1，增殖倍数达19.49（图3）。处理5愈伤组织鲜质量在第4代出现1个小高峰（7.81 g·瓶^-1），在第9代达到最大，为9.71 g·瓶^-1。处理6、9的愈伤组织鲜质量均在第4代出现峰值，分别为11.50 g·瓶^-1与8.89 g·瓶^-1，后续继代增殖过程中愈伤组织鲜质量整体呈现下降趋势。

处理2下愈伤组织干质量整体呈现上升趋势，第6代达到1个小高峰，第7代迅速下降，随后恢复上升趋势，在第12代达到最大，为0.62 g·瓶^-1。处理4下愈伤组织干质量随着继代次数的增加整体呈上升趋势，在第8代达到最大，为0.99 g·瓶^-1，随后下降，后续继代过程中趋于平稳。处理5、6、9的干质量变化趋势与鲜质量相似：处理5干质量在第9代达到最大，为0.58 g·瓶^-1；处理6、9下愈伤组织干质量均在第4代达到最大，后续继代增殖过程中整体呈现下降趋势。

2.4　继代增殖培养过程愈伤组织次生代谢物积累的变化

2.4.1　总三萜含量与产量

处理2、4、5和9的愈伤组织总三萜含量整体呈先快速下降再缓慢上升然后逐渐平稳的趋势，具体表现为第2代最高，至第5代含量最低，随后缓慢上升至第8～9代出现1个峰值（图4）。处理6总三萜质量分数在第4代出现第1个峰值，为41.14 mg·g^-1，随后迅速下降，第6代开始逐渐上升，在第9代出现第2个峰值，为40.57 mg·g^-1。

处理2下愈伤组织总三萜产量整体呈缓慢上升趋势，在第12代达到最高大，为16.78 mg·瓶^-1。处理4下愈伤组织总三萜产量在第4代出现小峰值，至第8代达到最大，为28.91 mg·瓶^-1，第9代快速下降然后趋于平稳。处理6下愈伤组织总三萜产量在第4代达到最大，为24.79 mg·瓶^-1，随后迅速下降，第5代开始缓慢上升，至第9代再达到1个小高峰。其他处理下愈伤组织总三萜产量在继代增殖培养过程中变化较小。

2.4.2　总多酚含量与产量

处理2和处理4的愈伤组织总多酚含量在第6代达到最高，然后逐渐降低。处理5的峰值出现在第7代。处理9在第7代达到1个峰值，至第11代达到最高（图5）。处理6在第4代达到最高，为8.81 mg·g^-1，随后不断降低，至第13代含量又有所上升。

处理2和处理9的愈伤组织总多酚产量变化趋势与其含量变化基本上一致。处理4下愈伤组织总多酚产量随着继代次数增加不断提高，至第8代达到最大，为6.89 mg·瓶^-1。处理6总多酚产量在第4代达到最大，为8.70 mg·瓶^-1。

2.4.3　总黄酮含量与产量

5个处理的愈伤组织黄酮含量在第2代均较高，第4~5代迅速降至1个低值，随后逐渐上升，其中，处理4、处理5和处理6在第7代达到最高（图6）。处理2高峰出现在第10代，为2.35 mg·g^-1。处理9峰值则出现在第11代。

处理2下愈伤组织总黄酮产量在第6代达到1个峰值，至第10代达到最大，为1.30 mg·瓶^-1，后呈下降趋势。处理4下愈伤组织总黄酮产量整体呈先上升后下降的趋势，在第8代达到最大，为1.77 mg·瓶^-1，第9代迅速下降，随后趋于平稳。处理5下愈伤组织总黄酮产量呈先上升后下降的趋势，在第9代达到最大，为1.10 mg·瓶^-1，随后逐渐下降。处理9下愈伤组织总黄酮产量整体呈上升趋势，在第11代达到最大，为0.80 mg·瓶^-1。

2.4.4　粗多糖含量与产量

5个处理下愈伤组织粗多糖含量均在第2、8代较低，在第5代达到高峰（图7）。各处理中，处理2下粗多糖含量最高，为105.00 mg·g^-1。处理2下愈伤组织粗多糖产量在第13代达到最大，为58.29 mg·瓶^-1；处理4在第5代达到最大，为58.48 mg·瓶^-1，第8代再次出现1个高峰，达57.45 mg·瓶^-1；处理5、处理6和处理9均在第4代达到最大，分别为38.35、36.78、40.33 mg·瓶^-1。

2.5　青钱柳优良继代增殖培养配方的评价与筛选

采用多指标选择法进行优良继代增殖培养配方筛选，以每一代愈伤组织的总三萜、总多酚、总黄酮、粗多糖产量为指标，采用熵权法计算青钱柳愈伤组织各指标权重（表5）。根据综合得分对青钱柳5个增殖配方进行排序（表6），结果显示，处理4在多次继代增殖过程中主要次生代谢物产量总体表现较好，是优良的继代增殖培养配方。

3 讨论与结论

植物细胞培养是体外生物合成药用有效成分的重要途径，关键在于高效愈伤组织诱导体系的建立，而利用药用成分含量高的材料诱导产生的愈伤组织，其次生代谢物的积累水平通常也较高^［35］。二倍体青钱柳天然资源较少，采用叶片为外植体具有采集方便、对母株损坏较小的特点，而且叶中主要次生代谢物含量较高^［12］，是愈伤组织诱导培养的理想材料。Guo等^［36］通过花楸（Sorbus caloneura）叶片成功诱导出愈伤组织，并建立悬浮培养体系。在初代培养中，植物生长调节剂是除外植体类型和基因型以外最重要的影响因素，其中，生长素和细胞分裂素的有效组合更有利于愈伤组织的诱导^［37-38］，本研究也证实生长素与细胞分裂素的协同作用对青钱柳愈伤组织诱导至关重要。吴洁萍等^［39］的研究结果表明，较高浓度的2，4-D和较低浓度的NAA有利于葡萄（Vitis）愈伤组织的诱导，诱导率接近100%，且诱导的愈伤组织状态较为一致。Senthilmanickam等^［40］研究表明，单独添加2，4-D或NAA，诱导的愈伤组织为黄色或棕色，提高NAA浓度则出现黄绿色愈伤组织，二者结合使用时诱导的愈伤组织为绿色或黄绿色，且诱导率达到100%。张文泉等^［23］对青钱柳愈伤组织的诱导研究结果表明，2，4-D呈显著影响，而6-BA无显著影响。本研究结果也表明：6-BA对二倍体青钱柳愈伤组织诱导无显著影响；2，4-D的影响最大，最佳质量浓度为1.0 mg·L^-1；NAA的影响也较大，质量浓度为0.2 mg·L^-1处理诱导出的愈伤组织颜色嫩绿、状态更好。综合分析认为，处理2是适宜的诱导培养基，即MS+0.5 mg·L^-1 6-BA+1.0 mg·L^-1 2，4-D+0.2 mg·L^-1 NAA。

多种激素组合能促使愈伤组织细胞快速分化，且表现出不同的颜色及形态。冯姗姗^［41］研究发现，在继代培养中添加多种激素后，不同处理的愈伤组织呈现白绿色、黄绿色、绿色等多种颜色，形态质地也表现出松散、紧凑、致密等类型。在本研究继代增殖过程中发现，不同激素组合处理的愈伤组织也呈现出不同颜色与形态质地，其中，处理6与处理9随着继代次数增加出现杂色，这可能与植物生长调节剂和内源激素协同作用导致的愈伤组织色素含量变化^［42］或诱导特殊次生代谢物积累^［43］有关，具体成分及形成机理还需进一步分析。

提高愈伤组织的次生代谢物产量主要通过以下2个途径：一是提高植物愈伤组织生物量，二是提高植物愈伤组织中次生代谢物含量。次生代谢物积累与愈伤组织细胞生长通常呈负相关关系，大部分次生代谢物合成发生在生长后期，通过激素组合的调控，可以达到生物量与次生代谢物积累的平衡。研究发现，苋菜（Amaranthus spp.）愈伤组织生长与其黄酮合成存在拮抗现象，高浓度细胞分裂素抑制黄酮积累，添加2，4-D、NAA等生长素后，愈伤组织黄酮类化合物含量得到显著提高，从而增加总黄酮积累量^［44］。然而，也有报道^［45］称，细胞分裂素可逆转2，4-D对次生代谢的负面影响，其中，KT等嘌呤型细胞分裂素效果更佳，有利于提升代谢物生物碱积累又不对生长产生负面影响。这种现象可能是由于不同物种对各种激素的响应不同。综合考虑生长素与细胞分裂素的影响，本研究以KT、6-BA、NAA和2，4-D为因素进行正交试验，结果表明，采用不同激素组合配方进行继代增殖，各处理下愈伤组织生长及代谢产物积累存在很大差异，而且同一处理下继代增殖过程中愈伤组织生长性状变化也较大。通过多指标选择法筛选出处理4为最优继代增殖培养配方，即MS+0.2 mg·L^-1 KT+0.5 mg·L^-1 6-BA+0.75 mg·L^-1 NAA+0.4 mg·L^-1 2，4-D，当继代至第8代时，此处理培养的愈伤组织次生代谢物产量均达到较高水平，总三萜产量为28.91 mg·瓶^-1，总多酚产量为6.89 mg·瓶^-1，总黄酮产量为1.77 mg·瓶^-1，粗多糖产量为57.45 mg·瓶^-1。

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基金资助

国家自然科学基金项目(31971642)