水稻OsBBTIs基因家族鉴定及在非生物胁迫下的表达分析

Identification of OsBBTIs Gene Family in Rice and Its Expression Analysis under Abiotic Stress

摘要

Bowman-Birk型胰蛋白酶抑制剂（Bowman-Birk type trypsin inhibitor，BBTI）是植物中广泛分布的一类胰蛋白酶抑制剂，在植物抵御胁迫过程中发挥重要作用。该研究利用生物信息学方法在基因组水平上鉴定出11个水稻（Oryza sativa）BBTIs基因家族成员，其中，10个OsBBTIs基因成簇聚集于1号染色体前端，而另外1个OsBBTI13基因定位于3号染色体。OsBBTIs蛋白具有N端信号肽和1~3个典型保守的Bowman-Birk型结构域。OsBBTIs基因的启动子区具有响应茉莉酸和脱落酸及非生物胁迫应激反应相关响应元件。转录组数据显示，所有OsBBTIs基因表达能够被茉莉酸诱导，多数OsBBTIs基因表达可以响应非生物胁迫。利用qRT-PCR检测NaHCO₃和NaCl胁迫下水稻OsBBTIs基因表达水平，结果显示，盐碱胁迫显著诱导OsBBTIs基因表达。该研究可为进一步研究OsBBTIs蛋白在非生物胁迫中的功能奠定基础。

Abstract

Bowman-Birk trypsin inhibitor（BBTI） is a widely distributed trypsin inhibitor in plants， which plays an important role in the process of plant resistance to the stresses. In this study， 11 rice BBTIs gene family members were identified at the genome level by bioinformatics methods， among which 10 OsBBTI genes were clustered at the front of chromosome 1， and OsBBTI13 gene was located on chromosome 3. OsBBTIs protein had N-terminal signal peptide and contained 1-3 typical conserved Bowman-Birk type domains. The promoter region of OsBBTIs gene had response elements related to plant hormones jasmonic acid， abscisic acid and the abiotic stresses. Transcriptome data showed that all OsBBTIs gene can be induced by jasmonic acid， and most OsBBTI genes can be expressed in response to the abiotic stresses. qRT-PCR was used to analyze the expression level of OsBBTIs gene under NaHCO₃ and NaCl stresses， the results showed that the expression level of OsBBTIs gene increased under the saline-alkali stresses. This study laid a foundation for further study on the biological function of OsBBTIs proteins in abiotic stress.

Graphical abstract

关键词

水稻 / OsBBTIs基因 / Bowman-Birk型结构域 / 非生物胁迫 / 表达分析

Key words

Oryza sativa / OsBBTIs / BowB domain / abiotic stress / expression analysis

蛋白酶抑制剂（protease inhibitors，PIs）能够与靶标蛋白酶结合并调节其活性，从而调控植物蛋白代谢，影响细胞内多种生物进程。蛋白酶抑制剂在植物受到机械损伤、病原菌侵染时，作为一类重要的植物防御蛋白发挥作用^［1］。植物蛋白酶抑制剂主要分为丝氨酸蛋白酶抑制剂、半胱氨酸蛋白酶抑制剂、天冬氨酸蛋白酶抑制剂和金属蛋白酶抑制剂^［2］。胰蛋白酶抑制剂（trypsin inhibitor，TI）属于丝氨酸蛋白酶抑制剂，根据结构和序列特征，胰蛋白酶抑制剂可分为Kunitz型、Bowman-Birk型、Potato Ⅰ型、Potato Ⅱ型和Kazal型5种类型^［3］。

Bowman-Birk型胰蛋白酶抑制剂（Bowman-Birk type trypsin inhibitor，BBTI）最先从大豆（Glycine max）中分离得到，随后在多种豆科（Fabaceae）、禾本科（Poaceae）、菊科（Asteraceae）植物中被发现并被广泛研究。双子叶植物只有1或2个BBTI蛋白，一般仅有1个Bowman-Birk型结构域（BowB domain），结构域上的2个活性位点分别特异抑制胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶活性^［4］。单子叶植物含有3种大小不同的BBTI蛋白^［5］。BowB结构域C端的回环构象在双子叶植物BBTI蛋白中对应于胰凝乳蛋白酶抑制反应回环，而单子叶植物BBTI蛋白由于缺少二硫键的约束，构象松散而不具有蛋白酶抑制活性，因此，单子叶植物BBTI蛋白的每个BowB结构域中只有1个反应位点^［6］。作为蛋白酶抑制剂，BBTI蛋白能够抑制昆虫肠道内蛋白酶活性，导致其发育不良而死亡，提高作物抗虫能力^［7］，在植物蛋白质存储和防御反应中发挥重要作用。

籼稻（Oryza sativa subsp. indica）基因组共有13个BBTIs基因家族成员，其中，BBTI9基因不被转录表达，BBTI10基因被错误翻译^［5］。已有研究^［8］表明，水稻BBTI5基因在斜纹夜蛾（Spodoptera littoralis）和茉莉酸（jasmonic acid，JA）处理的幼苗中被显著诱导表达。过表达BBTI7基因能够增强水稻的稻瘟菌（Magnaporthe oryzae）抗性^［9］。BBTI4蛋白是水稻抗白叶枯病途径的重要组分，含有3个BowB结构域，能被JA处理或机械损伤诱导上调表达，在水稻中超表达BBTI4基因可以显著增强水稻对白叶枯病抗性^［10］。此外，BBTI4蛋白可以被稻瘟菌效应蛋白AvrPiz-t直接靶标并调控其胰蛋白酶抑制剂活性，参与水稻抗病途径^［3］。

虽然水稻BBTI蛋白在抗病虫害方面已有广泛报道，但关于水稻BBTI蛋白家族的研究还有待进一步完善，对于BBTI蛋白家族在其他方面的功能还需更深一步的探索。本研究利用生物信息学方法对水稻BBTIs基因家族进行鉴定，分析OsBBTIs基因在不同激素和非生物胁迫下的表达量变化情况，为深入研究BBTI蛋白家族的生物学功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1　试验材料

水稻龙粳11（Oryza sativa subsp. japonica cv. longjing11，Lj11）种子由东北盐碱植被恢复与重建教育部重点实验室（东北林业大学）保存。选择颗粒饱满、大小均一的水稻种子，使用75%乙醇消毒2 min，蒸馏水冲洗2遍，后用1% NaClO消毒20 min，蒸馏水冲洗干净。将消毒后的水稻种子在30 ℃培养箱催芽2 d，随后转移至26 ℃光照16 h、24 ℃黑暗8 h的培养箱内，使用1/8霍格兰培养液培育至三叶期进行试验^［11］。

1.2　水稻 OsBBTIs 基因家族成员鉴定

在RAP-DB网站（https：//rapdb.dna.affrc.go.jp/download/irgsp1.html）下载水稻全基因组序列、蛋白质组数据及基因组注释文件。利用隐马尔可夫模型（PF00228）搜索水稻蛋白质组中含有BowB保守结构域的蛋白序列，去除重复后使用Interpro进行验证，在结果中筛选符合特征的序列。使用TBtools软件获取基因家族成员的序列信息^［12］。

1.3　水稻OsBBTIs蛋白特征分析

利用在线工具ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam/）分析水稻BBTIs蛋白家族成员的理化性质，获得氨基酸数分子质量、等电点（pI）等数据。使用网站WoLF PSORT（https：//www.genscript.com/wolf-psort.html？src=leftbar）预测OsBBTIs蛋白的亚细胞定位。

1.4　水稻 OsBBTIs 基因染色体定位、基因结构及保守基序分析

从水稻基因组注释文件中获取OsBBTIs基因的染色体位置及外显子、内含子结构信息，利用在线网站SMART（https：//smart.embl.de/smart/set_mode.cgi？NORMAL=1）分析蛋白质保守基序。使用GSDS2.0（https：//gsds.gao-lab.org/Gsds_help.php）和Adobe Illustrator对OsBBTIs基因染色体位置、基因结构和蛋白质保守结构域进行可视化分析。

1.5　水稻OsBBTIs蛋白家族系统发育树构建

从NCBI获取与OsBBTIs蛋白同源性较高的序列，使用MEGA7软件ClustalW功能对获取的蛋白进行多序列比对，采用邻接法（neighbour-joining method，NJ）构建系统进化树，并使用在线网站iTOL（https：//itol.embl.de/）进行分析。

1.6　水稻 OsBBTIs 基因启动子顺式作用元件分析

利用TBtools软件提取OsBBTIs基因上游2 000 bp基因组序列作为启动子，通过PlantCARE（https：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）分析启动子元件，使用R软件进行统计分析并可视化。

1.7　水稻 OsBBTIs 基因响应激素与胁迫表达分析

从TENOR网站（https：//tenor.dna.affrc.go.jp/）下载水稻转录组RPKM数据^［13］，数据来源于10 d龄水稻（Oryza sativa subsp. japonica cv. Nipponbare）幼苗，分别在培养液中添加浓度为100 μmol·L^-1的脱落酸和茉莉酸进行激素处理，将幼苗离水晾干以进行干旱胁迫处理，将植株完全浸没于培养液中模拟淹涝胁迫，4 ℃培养以进行低温处理，向培养液中加入浓度为0.6 mol·L^-1甘露醇进行渗透胁迫处理。使用基因号筛选出OsBBTIs基因的表达量数据，利用Hiplot（https：//hiplot.cn/basic/heatmap）生成激素和胁迫处理表达量热图。

1.8　 qRT-PCR荧光定量分析

使用60 mmol·L^-1 NaHCO₃和100 mmol·L^-1 NaCl对三叶期水稻幼苗进行胁迫处理，分别在0、3、6、12、24 h时取根组织，液氮速冻并置于超低温冰箱-80 ℃保存。使用植物RNA提取试剂盒提取样品总RNA并反转录成cDNA。根据目的基因序列设计定量PCR引物（表1），使用SYBR Green qPCR Master Mix荧光定量试剂盒进行qPCR检测目的基因和内参基因的Ct值，3次重复，使用2^-ΔΔCt法分析基因相对表达量^［14］。

2 结果与分析

2.1　水稻 OsBBTIs 基因家族成员筛选及其编码蛋白理化性质

在Interpro网站查找并下载BowB保守结构域信息，使用序列号PF00228，通过隐马尔科夫模型搜索水稻蛋白质组中包含BowB结构域的蛋白序列，并利用Interpro验证查找到序列的结构域，最终在水稻基因组中鉴定出11个OsBBTIs基因家族成员。OsBBTIs编码蛋白长度为100（OsBBTI12）~259（OsBBTI3）氨基酸，推测分子质量为10.7~27.9 kDa，OsBBTI11~OsBBTI13较小，OsBBTI1~OsBBTI8较大；OsBBTI蛋白理论等电点为4.46~8.94，其中，OsBBTI1~OsBBTI6偏酸性，其余成员则偏碱性；PSORT预测大部分OsBBTI蛋白定位于胞外基质，仅OsBBTI13蛋白定位于叶绿体（表2）。

2.2　水稻 OsBBTIs 基因家族成员的染色体定位、基因结构及保守基序

对11个OsBBTIs基因进行染色体定位分析，发现其中10个基因家族成员成簇聚集在1号染色体前端1.338~1.762 Mb，另外1个基因家族成员OsBBTI13定位于3号染色体（图1A）；多数OsBBTIs基因方向为反链（reverse strand），仅OsBBTI8基因为正链（forward strand）（图1B）。根据水稻全基因组注释文件分析OsBBTIs基因家族的基因结构，结果表明：OsBBTI1~OsBBTI8含有1个外显子，OsBBTI11~OsBBTI13含有2个外显子。利用SMART在线工具分析11个OsBBTIs蛋白保守结构域，发现所有的OsBBTIs蛋白都含有N端信号肽和1~3个BowB结构域，其中，OsBBTI11、OsBBTI12、OsBBTI13只含有1个，OsBBTI1、OsBBTI2、OsBBTI6、OsBBTI7、OsBBTI8含有2个，而OsBBTI3、OsBBTI4、OsBBTI5具有3个串联的BowB结构域（图1C）。

2.3　水稻OsBBTIs蛋白家族系统发育

在NCBI网站进行BLAST比对，选取来自光稃稻（Oryza glaberrima）、短花稻（Oryza brachyantha）、芦苇（Phragmites australis）、硬直黑麦草（Lolium rigidum）、野生二粒小麦（Triticum dicoccoides）、大麦（Hordeum vulgare subsp. vulgare）、小麦（Triticum aestivum）、乌拉尔图小麦（Triticum urartu）、少花莲座禾（Dichanthelium oligosanthes）、霍尔稷草（Panicum hallii）、稷（Panicum miliaceum）、玉米（Zea mays）、柳枝稷（Panicum virgatum）、谷子（Setaria italica）、黑麦草（Lolium perenne）、狗尾草（Setaria viridis）和节节麦（Aegilops tauschii subsp. strangulata）中与水稻BBTI蛋白序列相近的蛋白序列，共49个，使用MEGA软件构建系统进化树。结果发现，OsBBTI3、OsBBTI4、OsBBTI5与光稃稻BBTI聚类在同一分支，OsBBTI1、OsBBTI2、OsBBTI6、OsBBTI7与短花稻、光稃稻BBTI在同一分支（图2）。系统发育分析结果表明，水稻中具有相同BowB结构域数量的蛋白聚类到相近的分支，BBTI蛋白在禾本科内具有很高的保守度。

2.4　水稻 OsBBTIs 基因启动子元件

使用PlantCARE在线软件分析OsBBTIs基因启动子顺式作用元件，结果发现，11个OsBBTIs基因启动子都有激素反应、光反应、植物生长发育和应激反应相关元件。所有成员的启动子中都含有响应茉莉酸甲酯（MeJA）的TGACG-motif和CGTCA-motif、响应脱落酸（ABA）的ABRE元件，以及参与植物防御和应激反应的MYC、氧化应激反应元件as-1和参与无氧诱导必需的顺式作用调节元件ARE（图3）。MeJA和ABA都是重要的植物胁迫相关激素，因此，OsBBTIs基因可能参与植物激素响应与逆境调控，在植物生物与非生物胁迫中发挥作用。

2.5　水稻 OsBBTIs 基因表达对激素诱导的响应

为了分析OsBBTIs基因对胁迫相关激素ABA和JA的响应表达模式，从TENOR数据库中获取11个OsBBTIs基因的转录组数据。结果表明：ABA处理24 h内，大部分OsBBTIs基因家族成员响应都较小，芽中OsBBTI1、OsBBTI2、OsBBTI11、OsBBTI12基因和根中OsBBTI8基因表达量整体呈下降趋势，根和芽中OsBBTI7基因表达量随ABA处理时间增加而升高，而芽中OsBBTI13基因表达量先升高后降低。11个基因表达量都对JA处理有明显的响应，其中，OsBBTI1、OsBBTI2基因主要在芽中表达，且都在1 h内升高随后在1 d内逐渐降低；芽和根中OsBBTI13基因表达量在24 h内总体表现为升高；而其余8个成员主要在根中响应表达，JA处理24 h内均呈现先升高后降低趋势（图4）。因此，所有OsBBTIs基因家族成员均对JA诱导有显著响应，部分OsBBTIs基因对ABA诱导有显著响应。

2.6　水稻 OsBBTIs 基因表达对干旱、淹涝、低温、渗透胁迫的响应

为探究干旱、淹涝、低温、渗透胁迫下OsBBTIs基因表达特征，从TENOR数据库中获取11个OsBBTIs基因的转录组数据。OsBBTI1、OsBBTI2基因主要在芽中表达，这与激素处理结果相似，其他成员在叶和芽中都有表达。干旱与渗透胁迫诱导整个OsBBTIs基因家族成员表达趋势较为相似，大部分OsBBTIs基因能够被干旱和渗透胁迫显著诱导。淹涝处理抑制芽中OsBBTI1、OsBBTI2基因表达，诱导芽和根中OsBBTI13基因表达，在处理3 d内OsBBTI3、OsBBTI4、OsBBTI5、OsBBTI6、OsBBTI8基因表达量先升高后降低，其余OsBBTIs基因表达量基本不变。低温处理下，OsBBTI2基因表达量逐渐降低，OsBBTI8、OsBBTI11、OsBBTI12、OsBBTI13基因表达量先升高后降低，其余基因表达量则无显著变化（图5）。

2.7　水稻 OsBBTIs 基因表达对盐碱胁迫的响应

使用NaHCO₃和NaCl处理三叶期水稻幼苗，利用qRT-PCR方法检测基因表达量，结果显示：NaHCO₃和NaCl处理显著上调OsBBTI1、OsBBTI3、OsBBTI12基因表达水平。OsBBTI1基因表达量在NaHCO₃胁迫24 h后显著上调（图6A），在NaCl胁迫下呈现逐渐上升趋势（图6B）；OsBBTI3基因表达水平在处理24 h内呈先上升后下降的变化趋势，其中，NaHCO₃处理下OsBBTI3基因表达量在12 h时达到最高，约为对照的28倍（图6C），而NaCl处理下OsBBTI3基因表达量在6 h时迅速升高，约为对照的25倍，随后缓慢下降（图6D）；盐碱胁迫下OsBBTI12基因表达量在6 h内迅速升高，并在24 h内持续保持较高水平，NaHCO₃处理6 h后OsBBTI12基因表达量约为对照的165倍（图6E），而NaCl处理6 h后OsBBTI12基因表达量约为对照的56倍（图6F）。

3 讨论与结论

为全面了解水稻OsBBTIs蛋白家族成员，本研究基于粳稻全基因组数据共挖掘11个OsBBTIs基因，这些基因与已有研究中籼稻的11个BBTIs基因一一对应，因此沿用其命名^［5］。每个BBTI都有1个N末端信号肽序列及1~3个BowB结构域。预测OsBBTIs蛋白的亚细胞定位，发现大部分成员位于胞外基质，这表明OsBBTIs蛋白可能参与胞外外界信号的感受或传递等生物学过程。分析启动子顺式作用元件发现，OsBBTIs基因能够响应多种环境刺激，其中包含多种环境胁迫相关响应元件，如MYC、as-1、ARE等。每个OsBBTIs基因的启动子都含有ABA和MeJA响应元件，ABA在植物应对严酷外界环境的自我调控中发挥重要作用，而MeJA作为JA的甲基化衍生物，能够介导植物对昆虫和病原菌的抗性反应，调控植物对干旱、高温、臭氧和紫外线辐射等逆境的应答反应^［15-16］，因此，OsBBTIs蛋白家族可能在植物激素信号转导和胁迫反应中起作用。

分别使用ABA和JA处理水稻幼苗获取基因表达量数据，结果发现，OsBBTIs基因表达对JA的响应明显更广泛、更强烈，这与BBTI合成酶基因可作为JA信号途径标志基因的结果^［17］一致。干旱、淹涝、低温和渗透胁迫都可以导致OsBBTIs基因成员表达水平的改变，其中，干旱和渗透胁迫对所有成员的表达都产生了影响，说明OsBBTIs基因表达受非生物胁迫诱导，可能在植物非生物胁迫适应中起到一定作用。已有研究^［18］表明，日本黄连（Coptis japonica）细胞的镉耐受性来源于镉处理下CjBBTI基因被诱导表达，将CjBBTI基因转化至酵母中，能赋予其对过量镉的耐受性。小麦BBTI蛋白编码基因wali3、wali5和wali6都能够被机械损伤、铝离子或有毒金属胁迫诱导^［19-20］。此外，小麦BBTI蛋白编码基因WRSI5表达水平在盐、干旱和氧化胁迫下升高，过表达WRSI5能够提高拟南芥（Arabidopsis thaliana）幼苗的耐盐性生长^［21］。本研究中，OsBBTI1、OsBBTI3、OsBBTI12基因表达可以被NaHCO₃、NaCl胁迫显著诱导，表明BBTIs基因参与盐碱胁迫应答，可能在水稻盐碱胁迫中发挥作用。BBTI蛋白能够在植物受到机械损伤和生物咬食的位置积累，本研究发现，部分OsBBTIs基因在JA处理及非生物胁迫下的表达量在一定时间内呈现先上升后下降趋势，表明BBTI蛋白可能在胁迫信号的早期响应中发挥作用。推测BBTI蛋白家族可能参与异物入侵植物细胞损伤时超敏反应，参与相关激素信号，如茉莉酸的产生与转导，促使植物及时启动防御反应系统，从而保护植物并应对外界环境变化。其中，BBTI蛋白可能作为细胞机械损伤的信号传感器，或作为信号因子与胞外表面受体相互作用来参与植物抗逆。BBTI蛋白作为水稻对抗病原菌及虫害过程的重要成员，在植物新品种选育中具有重要价值，对OsBBTIs蛋白家族进行广泛而深入的研究，探寻其在各种胁迫下的表达及功能，对探索生物与非生物胁迫的联系及协同性，以及培育水稻抗性新品种具有重要的理论与实际意义。

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基金资助

黑龙江省大学生创新创业训练计划项目(DC-2024267)

国家自然科学基金面上项目(31870300)