抗松材线虫病落叶松优良家系选择

Selection of Superior Families of Larch Resistant to Pine Wood Nematode Disease

摘要

该研究以2年生18个落叶松（Larix gmelinii）实生苗家系为试验对象，采用剥皮套管法接种强致病性松材线虫株系FSBX。通过计算落叶松抗显症得分、抗虫得分和抗病得分，综合筛选抗松材线虫落叶松家系。通过测定接种后第0、5、10、15天针叶叶绿素、可溶性糖、可溶性蛋白含量及超氧化物歧化酶（SOD）、抗氧化物酶（POD）活性等指标，探究落叶松在抵抗松材线虫过程中生理指标变化趋势。结果表明：抗病得分最高的落叶松是家系1311，其次是家系1305和1310。不同抗性的落叶松针叶叶绿素含量变化趋势均为先降低后升高再降低。POD活性则表现为先降低后升高再小幅降低的趋势，接种第15天时，高抗家系的POD活性显著高于其他家系；SOD活性呈现先升高后降低的趋势，接种第10天时达到峰值，高抗家系显著高于其他家系。可溶性蛋白含量表现出先降低后升高的趋势，在接种第15天时，高抗家系的可溶性蛋白含量高于其他2组，差异不显著。可溶性糖含量呈现先降低后升高再降低的趋势，接种第10天时各家系可溶性糖含量达到峰值，且感病家系可溶性糖含量高于中抗家系，而中抗家系可溶性糖含量高于高抗家系，三者差异不显著。综上，高抗家系落叶松在针叶叶绿素含量、POD和SOD活性方面表现出显著优势，而可溶性糖及可溶性蛋白含量普遍低于其他家系，但在病害后期，高抗家系的生理指标高于中抗及感病家系，说明高抗家系在逆境胁迫后期仍能维持较高的抗逆性。

Abstract

In this study， 18 2-year-old Larix gmelinii families were used as materials， and the seedlings were inoculated with the highly pathogenic pine wood nematode strain FSBX by peeling casing method. By calculating the anti-symptom score， insect resistance score and disease resistance score， the larch families with resistance to pine nematode disease were comprehensively screened. Physiological indicators including contents of chlorophyll， soluble sugar， soluble protein， and activities of superoxide dismutase（SOD） and peroxidase （POD） were measured at 0^th， 5^th， 10^th and 15^th day post-inoculation， respectively. The change trend of physiological indexes of larch in the process of resistance to pine wood nematode was explored. The results indicated that larch family 1311 achieved the highest disease resistance score， followed by families 1305 and 1310. Chlorophyll content of the larch families with all resistance levels initially decreased， then increased， and then decreased again. POD activity showed a pattern of first decreasing， then increasing and then slightly declined. On the 15^th day， highly resistant families demonstrated significantly higher POD activity than that of the other families. SOD activity displayed an initial increase， followed by a decrease and peaking on the 10^th day， and highly resistant families showed significantly higher levels than that of the other families. The soluble protein content showed a trend of decreasing first and then increasing. On the 15^th day， the soluble protein content of the high-resistance family was higher than that of the other two groups， and the difference was not significant. Soluble sugar content showed a decrease-increase-decrease pattern， peaking on the 10^th day for all families， and susceptible families showed higher levels than moderate-resistance families， and that moderate-resistance families showed higher levels than high-resistance families， but there was no significant difference among the three groups. In conclusion， the high-resistance families showed significant advantages in chlorophyll content， POD and SOD activity， while the contents of soluble sugar and soluble protein were generally lower than those of the other families. However， in the later stage of inoculation， the physiological indexes of high-resistance families were higher than those of medium-resistance and susceptible families， indicating that high-resistance families could maintain high resistance in the later stage of inoculation.

Graphical abstract

关键词

松材线虫 / 落叶松 / 家系选择 / 生理生化 / 生长性状

Key words

Bursaphelenchus xylophilus / Larix gmelinii / family selection / physiology and biochemistry / growth characteristics

松材线虫（Bursaphelenchus xylophilus）引起的森林病虫害^［1］，即松材线虫病，于1982年在我国南京首次被发现，随即引起林业部门的高度重视。但是，由于对该病害认识不足，导致松材线虫快速扩散到多个省份，累积致死松树达数十亿株，造成的直接和间接经济损失上千亿元，成为我国近几十年最为严重的森林病虫害之一^［2-3］。松材线虫病对松树巨大且迅速的破坏暂无有效防治手段，因此也被称为松树的癌症^［4］。

落叶松（Larix gmelinii）是寒温带森林的优势树种，也是我国东北主要针叶造林树种之一^［5］，具有生长速度快、产量高、成材期早、适应性强、耐寒、耐旱等特点^［6-8］。落叶松人工林是我国森林资源中重要的组成成分，在促进经济发展和环境改善中起着重要作用。

目前，松材线虫主要危害的植物寄主大多属于松属（Pinus），如黑松（P. thunbergii）、赤松（P. densiflora）和马尾松（P. massoniana）等^［9-11］，直到2018年，才首次出现长白落叶松（Larix olgensis）自然感染松材线虫病的报道^［12］。针对落叶松属的松材线虫致病性及抗性树种的研究相对较少。有研究^［13-14］发现，松材线虫已有向北不断扩张的趋势，并在东北局部区域引发毁灭性灾害^［15］。落叶松是我国东北地区主要的造林树种之一。通过筛选抗病性强的落叶松家系，可以有效减缓松材线虫病的扩散速度，从而保护森林生态系统健康。有研究^［16］指出，在林业生产中，松树在遭受大量松材线虫侵染后出现“越年枯死”症状，这些松树表现出一定程度的耐病性。耐病性是指植物对病害的高度忍耐能力，例如，一些寄主植物虽受到病原体侵染，却并不表现出明显的病变，或者即使有明显的病变，仍能保持较高的产量^［17］。由于落叶松的轮伐周期较短，成熟年龄约为20 a，因此，维持其20 a的抗性是有可能的^［18］。

当植物体遭到生物和非生物胁迫时，体内会产生过量的活性氧（ROS），过量的ROS积累，能够破坏DNA、蛋白质等生物大分子，使细胞坏死。清除植物体内ROS的主要保护机制是利用抗氧化酶系统（超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和过氧化物酶（POD））^［19］。叶绿素是进行光合作用的重要物质，其含量能够直接影响光合作用效率，从而影响植物的生长和代谢。松材线虫侵染会影响松树维管系统的输水作用，使松树萎蔫死亡^［20］。松树中的可溶性糖和可溶性蛋白在渗透调节、抗逆性、信号传递和生长促进等方面发挥着重要作用，是植物生理活动和生态适应的重要组成部分。松树（Pinus）可以通过改变可溶性糖和可溶性蛋白含量调节渗透压来增强输水作用，以维持树体正常生长。叶绿素和可溶性蛋白等物质的变化既能表明植物的生长状态，也能反映植物的抗病能力^［21］。本研究综合分析落叶松对松材线虫病的抗病表现及其生理指标变化，以期筛选出抗松材线虫病的落叶松家系。

1 材料与方法

1.1　不同株系松材线虫对落叶松致病力鉴定

供试的落叶松样本取自黑龙江省外来林木病虫害监测与防控重点实验室（东北林业大学）。经多年试验验证，落叶松抗性排名中等，可作为验证不同株系松材线虫对落叶松致病力的标准树。所用的松材线虫株系包括DLBX（分离自大连的病黑松）、LYBX（分离自辽阳的病红松（P. koraiensis））、FSBX（分离自抚顺的病红松）、Nxy61（分离自宁波的病马尾松）及ABX（分离自美国的黄松（P. yunnanensis）疫木），均由黑龙江省外来林木病虫害监测与防控重点实验室（东北林业大学）提供。每个松材线虫株系接种9个落叶松单株。培养松材线虫所需的菌种为灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea），同样由该实验室提供。每个培养皿中加入8 mL PDA培养基，待其冷却后，使用移液枪取定量的灰葡萄孢菌丝置于平板中央，随后封盖并将培养基放置在25 ℃的恒温环境中培养。

选取生长状况一致的落叶松，采用剥皮套管法进行接种。在距落叶松基部约10 cm的茎部一侧，使用无菌刀片斜切出一个约1 cm的伤口，确保伤口深入木质部。将100 μL的松材线虫悬浮液（20 000条·mL^-1）接种至创口处，即接种数量为2 000条。用封口膜封住，完成接种。

通过计算接种第9天显症指数、繁殖力得分、致病力综合得分筛选抗松材线虫病落叶松家系。

显症指数计算公式为

S_i=\frac{a}{a_t}\times \mathrm{100}\%（1）

式中：S_i 为第i株树木的显症指数；a为该株显症针叶数量；a_t 为全部针叶数量。

繁殖力得分计算公式为

F_i=\frac{n}{n_{\mathrm{m}\mathrm{a}\mathrm{x}}}\times \mathrm{100}\%（2）

式中：F_i 为第i株树木的繁殖力得分；n为该株分离得到的线虫数量；n_max为分离得到的最多线虫数量。

致病力得分计算公式为

P_i=S_i\times F_i（3）

式中：P_i 为第i株致病力。

1.2　落叶松感病症状观察

供试的落叶松样本取自东北林业大学育苗基地，选用2年生的落叶松幼苗，共计18个家系，包括16个全同胞家系和2个半同胞家系（表1~2）。每个家系接种6个单株。供试松材线虫株系为筛选得到的强致病力株系FSBX（由黑龙江省外来林木病虫害监测与防控重点实验室（东北林业大学）提供）。

选取生长一致的落叶松，采用剥皮套管法将200 μL的松材线虫悬浮液（50 000条·mL^-1）接种至创口处，即接种数量为10 000条。在接种后0、5、10、15、20 d分别对不同家系取距接种点相同位置的当年生针叶，液氮速冻后放入冰箱中-80 ℃保存，每次取样设置3次重复，每个重复取2株苗。在单株死亡后，从接种点上方和下方各取5~10 cm的茎段，剪碎后采用贝尔曼漏斗法分离松材线虫，并统计数量。

通过计算抗显症得分、抗虫得分及抗病得分筛选优良家系。

抗显症得分表示症状的轻重及树木存活期长短，此分值高则表明症状轻（感病指数低），存活时间长。抗显症得分计算公式为

Y_i=\frac{t}{t_{\mathrm{m}\mathrm{a}\mathrm{x}}}\times \mathrm{100}\%（4）

式中：Y_i为第i株树木的抗显症得分；t为该株树木存活时间；t_{\mathrm{m}\mathrm{a}\mathrm{x}}为该批试验最大存活时间。

抗虫得分反映了接种松材线虫种群数量的变化，高分表示松材线虫大量死亡且无法在树体内繁殖，而低分则表明松材线虫能够在树体内大量繁殖。抗虫得分计算公式为

N_i=\left(\mathrm{1}-\frac{n}{n_{\mathrm{m}\mathrm{a}\mathrm{x}}}\right)\times \mathrm{100}\%（5）

式中：N_i为第i株树木的抗虫得分；n为该株树木死亡时树体内松材线虫数量；n_{\mathrm{m}\mathrm{a}\mathrm{x}}为该批试验最大松材线虫数量。

根据抗显症得分和抗虫得分，先直接剔除速死品种（少量线虫引起迅速死亡）、危险品种（不显症，但携带大量线虫容易扩散传播）和感病品种（促进线虫繁殖且死得快），而后综合计算抗病得分，此分值高表示松树为抗病品种（状轻且抑制或杀死松材线虫）。抗病得分计算公式为

S_{\mathrm{D},i}=\frac{Y_i}{\mathrm{1}-N_i}（6）

式中：S_{\mathrm{D},i}为第i株树木的抗病得分。

1.3　生理指标测定

使用苏州格瑞思生物科技有限公司提供的试剂盒测定可溶性糖、可溶性蛋白含量及SOD和POD活性，具体测定方法参照试剂盒说明书。采用丙酮-乙醇研磨法提取叶绿素。

1.4　数据处理

采用SPSS 17.0统计软件处理数据。采用单因素方差分析分析数据，使用F检验和相应的P判断组间均值的差异显著性。使用Origin Pro 2021软件绘图。

2 结果与分析

2.1　松材线虫株系致病力鉴定结果

不同株系松材线虫接种处理第9天时，落叶松显症指数由高到低依次为接种FSBX、LYBX、Nxy61、DLBX、ABX的落叶松家系，其中，接种FSBX的落叶松显症指数最高（图1，表3）。

对接种9 d的落叶松进行松材线虫的分离和数量统计，计算不同松材线虫株系的繁殖力，结果如图2所示。结果显示，不同株系松材线虫的繁殖力由高到低依次为FSBX、LYBX、Nxy61、DLBX、ABX，其中，FSBX株系的繁殖力最高。

结合落叶松显症指数和松材线虫繁殖力得分对不同株系松材线虫的致病力进行综合评价，计算致病力得分，结果如图3所示。结果发现，FSBX为最强致病力株系，因此，选择其作为后续接种株系。

2.2　落叶松接种松材线虫感病情况

接种松材线虫株系FSBX后，落叶松显症指数表明：接种5 d后，有41%的落叶松显症指数达到25%，针叶出现褪绿或变黄，其余落叶松的显症指数仍在25%以下；接种10 d后，62%的落叶松显症指数达到75%，大部分针叶开始脱落，表现为枯死状态；然而，在接种15 d后，有12株落叶松的显症指数仍低于25%；接种20 d后，有6株落叶松的显症指数低于25%（图4）。图5为不同抗性落叶松接种松材线虫前后对比。

统计18个落叶松家系存活时间及松材线虫数量，计算抗显症得分和抗虫得分。结合抗显症得分和抗虫得分计算抗病得分（表4）。其中，抗显症得分最高的为家系1305，其次是家系1310和1321；抗虫得分最高的为家系1307，其次是家系1308和1311；抗病得分最高的是家系1307，其次是家系1311和1305。由于家系1307抗显症得分过低，即存活时间过短，属于速死树种，直接剔除，无分值。因此，结合抗显症得分、抗虫得分和抗病得分综合筛选出最抗松材线虫病落叶松家系1311，其次是家系1305和1310。

2.3　接种松材线虫对落叶松生理指标的影响

结合抗显症得分、抗虫得分和抗病得分，综合选取9个家系，其中，高抗家系（1311、1305、1310）、中抗家系（1309、1319、1313）和感病家系（1301、1321、1326）各3个。测量其生理指标，探究落叶松在抵抗松材线虫过程中生理指标的变化趋势。

2.3.1　接种松材线虫对落叶松针叶叶绿素含量的影响

不同抗性的落叶松在接种松材线虫后，叶绿素含量在第5天时显著下降（表5）；而后持续上升，第10天时高抗家系叶绿素含量回升至接近初始水平且显著高于其他家系（F=22.264，d_f=2，P=0.002）；第15天时，各组叶绿素含量有所下降，高抗家系显著高于其他家系（F=38.288，d_f=2，P=0.001）。

2.3.2　接种松材线虫对落叶松针叶POD、SOD活性的影响

接种松材线虫后，落叶松针叶POD、SOD活性随着时间发生不同程度的变化（图6）。针叶POD活性变化趋势为先降低后升高再下降。接种第5天时达到最低值，高抗家系高于其他家系，差异不显著（F=4.445，d_f=2，P=0.065）；接种第10天时达到峰值，各组之间无显著性差异（F=2.715，d_f=2，P=0.145）；接种第15天时高抗家系POD活性显著高于其他2组（F=11.979，d_f=2，P=0.008）。各组SOD活性逐渐升高，接种第10天达到峰值，高抗家系SOD活性显著高于其他2组（F=38.923，d_f=2，P=0.001），而后持续下降，接种第15天时高抗家系SOD活性显著高于感病家系（F=7.461，d_f=2，P=0.024），与中抗家系无显著性差异。

2.3.3　接种松材线虫对落叶松针叶可溶性蛋白、可溶性糖含量的影响

高抗家系可溶性蛋白含量表现为下降后持续升高，接种第15天时达到峰值（表6）。中抗家系可溶性蛋白含量表现为先升高后下降的变化趋势，在接种第10天达到峰值。感病家系可溶性蛋白含量随着时间变化呈现出下降升高再下降的趋势，接种第10天达到峰值。接种第5天时中抗家系可溶性蛋白含量显著高于高抗家系（F=5.265，d_f=2，P=0.048），接种第10天时中抗家系与感病家系可溶性蛋白含量达到峰值（F=1.083，d_f=2，P=0.397），二者均高于高抗家系，三者无显著差异。随后高抗家系可溶性蛋白含量持续升高，接种第15天时高抗家系可溶性蛋白含量高于其他2组，差异不显著（F=0.838，d_f=2，P=0.478）。可溶性糖各组均表现出上升后下降的趋势。接种第10天各组可溶性糖含量达到最大。感病家系可溶性糖含量高于其他家系，各组差异不显著，接种第15天高抗家系可溶性糖含量高于其他家系，差异不显著。

3 讨论与结论

本研究通过计算抗显症得分、抗虫得分和抗病得分，综合筛选出抗性最高的落叶松为家系1311，其次为家系1305和1310，这种方式不仅考虑了存活时间，还考虑了松材线虫繁殖速率，该方法可以为其他树种的抗逆性育种提供参考。树高与植物抗病性通常存在一定关系，往往树高较低其抗病虫害能力较高，这是因为矮小树木可能将更多的能量用于防御机制的建立，如合成次生代谢物（树脂、萜类化合物等），这些物质可以有效抵御害虫侵袭。2023年，对帽儿山子代林18个家系落叶松生长性状进行调查，其中，家系1305、1310、1311树高分别为8.45、8.42、8.12 m，这3个家系的15年生树高分别比总体平均值高出9.72%、9.43%和5.49%（数据来源于林木遗传育种全国重点实验室（东北林业大学）），说明这些家系在生长速率上保持优势。

松树受到松材线虫侵染后其光合色素、渗透调节物质含量及抗氧化酶活性等生理指标发生变化^［22-23］。光合色素是植物进行光合作用的关键物质，有研究^［24］表明，光合色素含量的减少能直接导致植物叶片衰老及光合速率不可逆降低。落叶松受松材线虫侵染后其针叶叶绿素含量显著下降，该现象与樟子松（P. sylvestris var. mongolica）幼苗接种松材线虫后30 d的变化趋势一致^［21］，可能是由于松材线虫抑制了叶绿素的合成，从而导致针叶褪绿变黄。随后，叶绿素含量有所回升，这可能是由于POD活性迅速上升，增强了呼吸强度，从而促进了叶绿素代谢的恢复。可溶性蛋白与可溶性糖是植物体内主要的渗透调节物质，能够帮助植物抵抗逆境胁迫。本研究中，落叶松感染松材线虫后，针叶可溶性蛋白含量迅速升高，这种现象可能是由于松材线虫的入侵破坏了植物的渗透压，降低了植物的输水能力。植物通过增加可溶性蛋白和可溶性糖含量来调节渗透压，从而增强保水能力。接种第10天感病家系可溶性糖含量高于其他家系，该现象与松材线虫侵染导致4~5年生马尾松可溶性糖含量变化一致^［10］，原因可能是高浓度的可溶性糖对植物产生毒害作用。当植物受到病虫危害时，SOD活性呈现先上升后下降的趋势，可能是由于受松材线虫影响，导致体内产生大量ROS，SOD活性的升高有助于清理ROS，以减轻ROS对细胞的损害，高抗家系SOD活性显著高于其他2组，说明高抗家系能够更好地清除有害物质，以减轻其对自身的伤害。POD除了参与抗氧化反应还参与形成木质素，木质素可以在一定程度上阻碍松材线虫迁移，增强植物抗病能力。POD活性出现下降升高再下降的趋势，与松材线虫侵染3年生日本落叶松（L. kaempferi）引起的POD变化趋势一致^［20］，与松材线虫侵染黑松和湿地松（P. elliottii）后POD活性明显升高相反。在感病后期，该作用不足以抵抗松材线虫对树木产生的危害，树体枯萎死亡。也有研究^［25］表明，POD活性的迅速升高，会对植株自身产生伤害。POD活性的变化在植物对松材线虫的抗性中起着复杂的作用，其影响既有积极的一面，也可能带来负面后果，未来的研究可以进一步探讨其作用机制。

综上所述，家系1305、1310和1311不仅具备优良的抗病性与生长表现，同时，也在生理指标的变化上展现出一定的抗病优势。在今后的造林实践中，家系1305、1310和1311应被优先选择，特别是在病害风险较高的地区。这些家系的引入将有助于提升森林的抗逆性和整体健康水平，从而增强生态系统的稳定性和可持续性。此外，这种综合评估方法，不仅对落叶松的抗逆性育种具有指导意义，也为其他树种的抗逆性育种提供了重要参考，推动育种工作向更加科学和系统的方向发展。

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基金资助

农业生物育种重大项目(2022ZD040160203)