小黑杨双单倍体生长性状及解剖结构分析

Analysis of Growth Traits and Anatomical Structures of Doubled Haploid Lines of Populus simonii × P. nigra

摘要

与传统育种相比，双单倍体（doubled haploid，DH）诱导技术能够有效缩短纯合系的育种周期，在短时间快速获得林木纯合系。由于林木单倍体诱导困难，难以建立规模化的遗传群体，因此，目前关于林木DH群体遗传变异的研究鲜有报道。该研究以小黑杨亲本和4个DH系为材料，对其生长性状、叶片表型和解剖学特征开展测定与统计分析，结果显示：不同DH系存在明显的生长缺陷，DH系的株高、地茎、茎节数量、叶长、叶宽、叶面积等指标均显著低于亲本。顶芽解剖结构分析结果显示，亲本与DH顶端分生组织生长点存在差异；茎部石蜡切片及组织染色观察分析显示，DH系的形成层数量较少，单个导管细胞平均面积小，而导管和纤维细胞数量均极显著高于亲本。该研究结果表明，DH植株在次生生长方面存在缺陷，可为后续研究特定基因功能解析和育种策略优化提供材料基础。

Abstract

Compared with traditional breeding method， the doubled haploid （DH） induction technology can effectively shorten the breeding cycle and quickly obtain homozygous lines of trees. Due to the difficulty in inducing DH in trees， it is hard to establish large-scale DH genetic populations， therefore， there are currently few reports on the genetic variation of DH populations in trees. In this study， the growth traits， leaf phenotypes and anatomical characteristics of donor tree of Populus simonii × P. nigra and four DH lines were analyzed. The results showed that the DH lines had obvious growth defects. The height， ground diameter， number of stem nodes， leaf length， leaf width and leaf area of DH lines were significantly lower than those of donor trees. Anatomical analysis of the apical buds revealed distinct morphological differences in the apical meristem growth points between donor trees and DH lines. The observation and analysis of the paraffin sections of the stems and the tissue staining showed that the vascular cambium of DH lines was relatively smaller， the average area of each vessel cell was smaller， and the number of vessel and fiber cells was significantly higher than that of donor trees. This study revealed the defects of DH lines in secondary growth， and will provide a material basis for subsequent research on the function analysis of specific genes and the optimization of breeding strategies.

Graphical abstract

关键词

小黑杨 / 双单倍体 / 生长性状 / 解剖结构

Key words

Populus simonii × P. nigra / doubled haploid / growth traits / anatomical structures

单倍体（haploid）是指具有配子染色体数目的个体，其细胞中仅含一套染色体，具有基因组纯合和高突变率等特性。这些特性使得单倍体在植物育种、种质资源创新、遗传分析和基因功能鉴定等方面极具应用价值^［1］，可应用于定位优良基因并缩短育种周期。双单倍体（doubled haploid，DH）是指单倍体经自发或者人工诱导染色体加倍后形成的基因型纯合个体。单倍体在自然界中可以通过自然或人为干预产生，1964年，Guha和Maheshwari^［2］利用花药离体培养的方法成功获得曼陀罗（Datura stramonium）花药植株后，花药培养诱导单倍体技术逐渐成为获得单倍体的有效途径之一。此外，还可以通过着丝粒介导法^［3］、单倍体诱导系^［4］、未成熟雌性或雄性配子体外培养^［5］、花药辐射等获得单倍体。随着现代生物技术的应用，单倍体诱导方式也取得创新性进展。Wang等^［6］研发了单倍体诱导基因组编辑（IMGE）方法，在玉米（Zea mays）中，利用携带CRISPR/Cas9的玉米诱导系为精英自交系授粉，可在两代内直接产生农艺性状改良的纯合DH系，规避了传统育种中冗长的回交程序。

在农作物领域，单倍体育种技术已成为推进禾谷类作物玉米、水稻^［7］（Oryza sativa）和小麦（Triticum asetivu）^［8］等优良品种培育进程的有效手段，且部分改良品种已广泛推广。相较于系谱法、回交法等常规的育种方法，对玉米采用体外孤雌技术等单倍体育种技术可在短时间内获得纯合系^［9］。研究^［10］表明，维生素和玉米素处理可促进秋水仙碱诱导的玉米单倍体染色体加倍。Wang等^［11］发现，利用RUBY基因标记在玉米和番茄（Solanum lycopersicum）中诱导产生深色甜菜色素，实现了高效且不依赖遗传背景的单倍体鉴定，展现出广阔的应用前景。杨忠慧等^［12］建立了小麦DH高效生产技术规程，初步实现了批量生产和育种应用。Zhong等^［13］创制了番茄单倍体诱导系及其配套的诱导鉴别技术，为创建单、双子叶植物通用的跨物种单倍体快速育种技术体系及杂种优势利用效能提升开辟了新路径。DH技术在植物遗传育种和基因改良中的应用日益广泛，通过DH群体可使候选基因的靶向性更加准确^［14］。DH技术通过高效创制优良自交系、优化杂交亲本、缩短育种周期，可显著提高玉米产量和质量^［15］。

与农作物相比，木本植物普遍存在生长周期长、基因组庞大、遗传杂合性高等天然限制，导致传统自交法难以创制纯合系，极大阻碍了林木基因组解析进程，且多数木本植物为自交不亲和或雌雄异株，因而人工诱导获得单倍体是获得林木纯合系最有效的方法。利用单倍体育种技术能够快速创制林木良种，显著加速育种进程并提高育种效率。Stoehr和Zsuffa^［16］通过辽杨（Populus maximowiczii）花药离体培养成功诱导14个单倍体植株和10个DH植株。此外，Li等^［17］通过多种培养基处理北京杨（Populus × beijingensis）花粉，诱变获得单倍体植株。Li等^［18］利用不同的高温处理雌花，通过孤雌生殖诱导杜仲（Eucommia ulmoides）单倍体。目前，小黑杨（P. simonii × P. nigra）^［19］、椰子（Cocos nucifera）^［20］和欧洲栓皮栎（Quercus suber）^［21］等林木品种均已获得单倍体植株。由于单倍体材料基因型高度纯合，其在分子生物学研究方面具有重要价值。刘彩霞^［22］以杨树（Populus）单倍体愈伤组织为材料，通过诱导及筛选，获得了基因纯合的悬浮细胞系，为林木分子研究提供重要了遗传材料。然而，林木单倍体植株诱导率较低，性状优良的品系再生难度大，多数情况下仅能获得少量株系。关于林木DH个体和群体生物学及育种研究仍较少，限制了杨树等林木种质资源创新和基因功能的深入研究，严重阻碍了林木单倍体育种技术的进一步发展。目前，基于杨树单倍体群体开展的生长表型及解剖结构等方面的研究报道较少。

杨树是我国重要的造林树种之一，生长周期短、速度快。作为木本植物生物学研究的模式物种，杨树基因组学和遗传育种研究已取得显著进展。小黑杨是由小叶杨（Populus simonii）和欧洲黑杨（Populus nigra）杂交选育的良种^［23］。该树种树干通直、树皮光滑、自然整枝良好，兼具强抗寒性、耐旱性、耐盐碱性，以及生长迅速、适应性强等优点，是重要的木材生产原料。研究团队以小黑杨为材料，首次建立了规模化的林木单倍体遗传群体^［24］。本研究以小黑杨亲本（donor tree，DT）和不同DH系（DH1588、DH3-50、DH1717、DH1716）为材料，分析其生长性状、叶片表型及茎解剖结构，旨在探究亲本与DH系和不同DH系植株之间生长发育的差异，揭示DH系在次生生长方面的差异，为单倍体遗传变异及木材形成等研究提供参考。

1 材料与方法

1.1　试验材料

本研究试验材料包括1个小黑杨亲本和4个DH无性系，分别为DH1588、DH3-50、DH1717和DH1716。2024年1月，采集试验材料插条，在东北林业大学温室扦插扩繁，室内温度为（25±1） ℃，选取活性较高、侧芽饱满、无病虫害的枝条。每根穗条长度为15~20 cm，切口位置上平下斜，下切口斜剪约45°，扦插基质为V（黑土）∶V（蛭石）∶V（珍珠岩）=5∶2∶1，每种试验材料包括30个重复。

1.2　表型测定

2024年5月，测定生长4个月的小黑杨亲本及DH系生长性状，分别使用钢尺和游标卡尺测量株高和地径，同时，记录每个单株的茎节数量和叶片数量，每个无性系包括30个重复。其后，测定、分析叶片性状参数，每个无性系随机选择3个植株，从顶芽下方第1片完全展开的叶片视为第1片叶，测定第5~8片叶的节间距，然后将片叶带回实验室，在方格纸上拍照后，利用ImageJ软件（https：//ij.imjoy.io/）测定、分析叶长、叶宽和叶面积，叶片长宽比为叶长与叶宽比值。

1.3　石蜡切片

顶芽下面第1个茎节视为第1茎节，自上而下取12个茎节，用双面刀片切成2~4 mm的茎段，立即置于FAA固定液中，带回实验室，经包埋、切片和脱蜡后，再利用0.1%甲苯胺蓝、0.1%番红和0.1%固绿进行染色，在光学显微镜下，观察顶芽和茎段的解剖结构并拍照。根据采集的图像，利用ImageJ软件，采取随机抽样方法，从亲本及不同DH系的第3、5、7、9及11茎段的横切面内随机选取3个比例相同的区域，统计导管细胞、纤维细胞数量及导管细胞面积。

1.4　数据处理

本研究使用Excel 2021对试验数据进行整理。使用IBM SPSS Statistics 25.0软件对株高等性状进行单因素方差分析（one-way ANOVA），采用LSD法进行事后多重比较。使用GraphPad 9软件作图。

2 结果与分析

2.1　生长性状及植株表型分析

生长性状分析结果显示，DH系具有明显的生长缺陷，其株高、地径、叶片数量、根系数量和茎节数量均显著低于亲本（P<0.01）（图1），其中，DH1588生长状态最好，但也显著低于亲本（P<0.01），其次是DH3-50、DH1717、DH1716。亲本株高、地径、叶片数量和茎节数量平均值分别为122.9 cm、6.9 mm、36和36。与亲本相比，DH1588、DH3-50、DH1717、DH1716株高分别降低67.01%、80.55%、80.71%和93.60%，地径分别降低51.26%、56.08%、56.03%和67.33%，叶片数量分别减少41.67%、59.26%、63.89%和86.11%，茎节数量分别减少49.09%、55.45%、61.82%和82.73%。第5~8茎节的节间距统计分析结果显示：仅有DH1716的5~6茎节的节间距显著低于亲本（P<0.01），而所有DH系的第6~7、7~8茎节的节间距显著低于亲本（P<0.01）。

2.2　叶片表型分析

本研究对4月龄的小黑杨亲本和4个DH系自上而下的第5~8片叶的表型进行观测（图2）。如图所示，亲本的叶形呈三角形，DH1588和DH3-50的叶形呈卵形，而DH1717的叶形呈菱形，DH1716的叶形呈长椭圆形。同时，对第5~8片叶的叶长、叶宽和叶面积进行测定分析（表1）。结果显示：亲本的叶长、叶宽和叶面积均最大，DH系次之，其中，DH3-50>DH1717>DH1588>DH1716。

2.3　顶芽解剖结构分析

解剖及组织化学染色观察结果表明，亲本及不同DH系的生长点均被两侧叶原基包裹，但DH系的顶端分生组织与亲本相比存在明显差异；亲本顶芽生长点向上隆起，呈圆锥形，相较于DH系更尖锐（图3）。

2.4　茎部解剖结构分析

观察经甲苯胺蓝染色的茎段横切面细胞发现，DH系形成层细胞数量与亲本之间存在明显差异（图4），亲本形成层数量显著多于DH系（P<0.01）（图5）。

与DH1588和DH3-50相比，亲本及DH1717、DH1716均在第3茎节木质部区域出现相对明显的着色（图6）；随着茎节的增加，DH系的木质部髓射线排列更加紧密，木质部导管细胞面积较亲本更小，且纤维细胞数量较少。

进一步对单位面积内的导管细胞数量、单位面积内纤维细胞数量及单个导管细胞面积进行统计分析，由于DH1716植株较矮，无第11茎节，故仅统计第9茎节内的导管细胞数量、纤维细胞数量及导管细胞面积。结果如图7所示，DH系的导管和纤维细胞数量均极显著高于亲本（P<0.01），但亲本单个导管细胞面积极显著大于DH系（P<0.01）。

同时，对亲本及不同DH系的横切面进行观察（图8），结果发现，亲本茎段横切面呈五边形，而DH系则趋于圆形。

3 讨论与结论

以往研究^［25］表明，在生殖细胞第1次减数分裂期间，同源染色体配对并互换，从而重组连锁序列变异，并在单倍体配子中产生遗传多样性；而单倍体仅携带其二倍体亲本一半的染色体，隐性基因的表达可能导致DH植物中出现不寻常的表型^［26］。因此，每个单倍体产物具有独特的遗传组成。例如，玉米DH系的遗传变异同样显著高于自交系^［27］。杨树具有高度杂合的基因组，理论上，DH系基因组差异较大会导致表型存在明显差异。由于林木单倍体获得极其困难，在以往的研究中难以获得规模化的遗传群体，无法开展DH表型差异相关研究。本研究以亲本和DH系株系为试验材料，尽管不同DH系均来源于相同的亲本，但相较于亲本及不同DH系之间仍存在显著差异，包括株高和地径等，这可能是由于小黑杨是高度杂合的品种，其DH系遗传基础差异较大，因而产生明显的遗传变异。

叶片是植物重要的营养器官，是植物进行光合作用的主要场所。在叶片发育过程中，茎端分生组织中的叶原基分化形成叶片。叶片形态是由叶片扩展和成熟过程共同决定的^［28］，其中，叶片增大早期主要依赖细胞增殖，后期则主要依靠细胞体积膨大实现^［29］，叶片大小也会影响植株的生长发育。基因通过调控细胞发育过程影响叶片性状。在拟南芥（Arabidopsis thaliana）中，AtGEF9基因通过抑制细胞增殖来限制细胞叶原基的大小，从而抑制叶片发育^［30］；鹿凯峰等^［31］分析PagKNAT2/6a基因，发现该基因通过抑制细胞扩展影响叶片大小；转录因子MeTCP3a在木薯（Manihot esculenta）中通过调控下游基因影响叶片发育，导致木薯叶片出现畸形现象^［32］。本研究结果表明，DH系叶面积显著低于亲本（P<0.01），且在生长过程中，DH系顶芽较早地开始休眠，可能是顶芽发育异常影响叶片发育。因此，本研究对DH系顶芽形态结构进行解剖学观察，结果发现，与DH系相比，亲本顶芽生长点呈较尖状态，圆锥形，而DH系顶芽生长点较扁平。有研究^［33］表明，顶端分生组织是生长发育的重要部位，该部分细胞分裂最为活跃，细胞分裂能力更强，所以推测亲本与DH系顶芽生长点形态的不同导致细胞分裂活跃程度产生差异，进而导致亲本与DH系的株高和节间距存在差异。后续可以通过基因组测序进一步探究DH系植株叶片与亲本叶片存在差异的原因。

石蜡切片是最常用的组织制片技术，用于清晰观察细胞与组织的形态结构。通过对亲本及DH系植株第3、5、7、9、11茎节进行细胞形态学观察发现，DH系茎形成层数量减少，抑制了形成层细胞增殖，进而影响木质部细胞发育；与亲本相比，DH系的导管细胞变小，数量变多。由于导管是植物水分运输的主要通道，导管数量和面积会影响植物的耐旱能力^［34］。导管面积变小会降低水分疏导效率，进而抑制茎的伸长。结合前面的研究结果可知，DH系的节间距缩短，导管面积变小，推测这可能是顶端分生组织异常分化导致的，该分化还间接导致DH系植株矮小、次生生长缓慢，进而引发枝条生长缓慢，甚至停滞。已有研究^［35］发现，亲本和不同DH系之间存在多种差异表达的基因，DH植物的纯合基因组导致植物表型和基因表达的显著改变。其中，在脱落酸的影响下，PsnMYB73/77和PsnE2F基因的表达受到抑制^［36］，而PsnHFR1/DELLA和PsnRGA/DELLA基因的表达上调，抑制生长素合成，进而抑制根和芽生长，据此推测DH系顶端分生组织中的基因表达水平影响生长激素含量和分布，进而导致顶芽提早休眠并停止生长。同时，PsnRGA/DELLA和PsnROGA/DELLA基因表达上调还会促进形成层衰老，延缓分生组织发育，最终导致整株衰老。因此，关于调控DH系与亲本植株生长表型及解剖结构差异特定基因的分子作用机制尚需深入研究，下一步将探究这些机制是如何通过调控细胞分裂、激素信号响应及次级代谢产物合成，进而影响植株的表型特征和内在结构。

综上所述，本研究以小黑杨亲本和不同DH株系为材料，对其生长性状、叶片表型及茎部解剖结构进行分析，结果发现，DH系在生长发育和形态特征方面存在明显缺陷，其顶芽和茎部解剖特征均存在明显差异。研究结果可为后续基因功能解析及育种策略优化提供依据。

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基金资助

国家重点研发计划项目(2021YFD2200203)