文冠果HDAC和HAT基因家族鉴定及表达模式分析

Identification and Expression Analysis of HDAC and HAT gene families in Xanthoceras sorbifolium

摘要

组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase， HDAC）和组蛋白乙酰转移酶（histone acetyltransferase，HAT）是一组催化组蛋白乙酰化/去乙酰化的可逆酶，在植物生长发育中发挥重要作用。该研究旨在探究文冠果（Xanthoceras sorbifolium）组蛋白去乙酰化酶（XsHDAC）和组蛋白乙酰转移酶（XsHAT）家族成员基因和蛋白特征，重点关注其在种胚发育中的表达模式。对文冠果XsHDACs和XsHATs家族成员进行全基因组鉴定，通过生物信息学方法分析其理化性质、基因结构、保守基序、染色体定位、共线性和顺式作用元件；通过实时荧光定量PCR分析XsHDACs和XsHATs基因在不同组织及种胚发育时期的表达模式。从文冠果基因组中鉴定出15个XsHDACs基因（分属RPD3/HDA1、HD2、SIR2亚家族）和8个XsHATs基因（分属GNAT、MYST、CBP、TAF_II250亚家族）。这些基因分散定位于文冠果9条不同染色体上。对XsHDACs和XsHATs蛋白家族成员理化特征分析显示，2个家族多数成员为亲水性蛋白质，呈酸性；亚细胞定位预测显示，XsHDACs和XsHATs蛋白家族成员主要定位于细胞核；系统进化树结果显示，文冠果与同为无患子科（Sapindaceae）的荔枝（Litchi chinensis）亲缘关系较近；蛋白结构预测结果显示，XsHDACs和XsHATs家族成员富含不规则卷曲和α-螺旋。顺式作用元件预测结果显示，XsHDACs和XsHATs基因家族成员的启动子中包含与种子发育、光响应、激素应答及胁迫响应相关元件。实时荧光定量PCR显示，大多数XsHDACs和XsHATs基因家族成员在种胚中高表达，且在种胚发育晚期表达量上升。XsHDACs和XsHATs基因家族在进化中兼具保守性与特异性，其表达模式揭示其家族可能在文冠果种胚发育和油脂合成过程中发挥重要作用。

Abstract

Histone deacetylases（HDACs） and histone acetyltransferases（HATs） are a group of reversible enzymes that catalyze histone acetylation/deacetylation， playing crucial roles in plant growth and development. This study aimed to investigate the characteristics of histone deacetylase（XsHDAC） and histone acetyltransferase（XsHAT） family member genes and proteins in Xanthoceras sorbifolium， with a focus on their expression patterns during seed embryo development. Genome-wide identification of XsHDACs and XsHATs family members in X. sorbifolium was conducted. Bioinformatics analyses were performed to examine their physicochemical properties， gene structure， conserved motifs， chromosomal localization， synteny， and cis-acting elements. The expression patterns of XsHDACs and XsHATs genes in different tissues and during seed embryo development were analyzed using quantitative real-time PCR. A total of 15 XsHDACs genes（belonging to the RPD3/HDA1， HD2， and SIR2 subfamilies） and eight XsHATs genes（belonging to the GNAT， MYST， CBP， and TAF_II250 subfamilies） were identified from the X. sorbifolium genome. These genes were distributed across nine different chromosomes. Physicochemical analysis of XsHDACs and XsHATs family members revealed that most proteins in both families were hydrophilic and acidic. Subcellular localization predictions indicated that XsHDACs and XsHATs family proteins were primarily localized in the nucleus. Phylogenetic analysis showed a close evolutionary relationship between X. sorbifolium and Litchi chinensis， both belonging to the Sapindaceae family. Protein structure predictions demonstrated that XsHDACs and XsHATs family members were rich in random coils and α-helices. Cis-acting element analysis revealed that the promoters of XsHDACs and XsHATs genes contain elements related to seed development， light response， hormone signaling， and stress responses. Quantitative real-time PCR revealed that most XsHDACs and XsHATs members were highly expressed in the embryo of seed， with increased expression levels during late-stage embryogenesis. The XsHDACs and XsHATs gene families exhibited both evolutionary conservation and specificity. The expression results suggested their potential crucial roles in the embryonic development and oil biosynthesis in X. sorbifolium.

Graphical abstract

关键词

文冠果 / 组蛋白去乙酰化酶 / 组蛋白乙酰转移酶 / 基因家族 / 基因表达分析

Key words

Xanthoceras sorbifolium / histone deacetylase / histone acetyltransferase / gene family / gene expression analysis

文冠果（Xanthoceras sorbifolium）属于无患子科（Sapindaceae）文冠果属（Xanthoceras）落叶灌木或小乔木，是我国特有的木本油料树种，主要分布在我国北方地区，具有耐寒、抗旱、耐盐碱等优点^［1］，种子富含油脂、蛋白质和皂苷等多种活性成分，种胚含油量高达60%，除油酸（30.6%）和亚油酸（41.6%）等不饱和脂肪酸外^［2］，还含有神经酸，可以保护神经细胞，促进神经细胞生长和发育，具备治疗阿尔茨海默病的潜力^［3］。

近年来，表观遗传调控被证明在植物生长发育及逆境胁迫响应中扮演关键角色。其中，组蛋白乙酰化修饰作为一种可逆的、动态的核心表观遗传方式，与基因转录关系密切。由组蛋白乙酰转移酶（histone acetyltransferase，HAT）和组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase，HDAC）共同催化，HAT将乙酰基转移到组蛋白的N端赖氨酸残基上，使DNA与组蛋白之间的相互作用减弱，从而激活转录，相反，HDAC通过组蛋白N端的去乙酰化，使其与DNA紧密结合，从而抑制转录^［4］。

植物HDAC可分为3个亚家族：RPD3/HDA1、HD2和SIR2^［5］。HDAC在调控植物生长发育过程中发挥重要作用。RPD3/HDA1亚家族成员含有一个典型的组蛋白去乙酰化酶结构域，发挥其酶活性需要Zn²⁺的存在^［6］。在拟南芥（Arabidopsis thaliana）中，HDA6与FVE和FLD形成复合体调控开花时间^［7-8］；HDA6和HDA19在调控种子胚胎发生和萌发过程中存在功能冗余，HDA6和HDA19直接抑制胚胎发生相关基因LEAFY COTYLEDON1（LEC1）和FUSCA3（FUS3）表达^［9］，在种子萌发阶段，成熟相关基因的转录活性受到负调控抑制^［10］；在苹果（Malus domestica）中，MdHDA19与MdERF4-MdTPL4形成抑制复合体，直接抑制乙烯合成关键基因MdACS1表达，调节苹果果实成熟过程^［11］。HD2家族蛋白是植物体内特有的一类组蛋白去乙酰化酶。HD2A和HD2B在种子休眠中发挥作用，hd2a/hd2b突变促进种子休眠，HSI2和HSL1将AtHD2A和AtHD2B募集到种子休眠关键调节因子DELAY OF GERMINATION 1（DOG1）位点上，从而负调节DOG1表达并减少种子休眠，影响种子萌发过程^［12］。SIR2家族蛋白需要核心结构域SIR2与NAD辅助因子作用来发挥功能，SRT1基因在植物叶片及花器官的发育早期阶段呈现特异性表达，而SRT2基因表达则集中于配子体发育进程及果实成熟阶段^［13-14］。

植物HAT可以分为4个亚家族：GNAT、MYST、CBP、TAF_II250^［15］。GNAT和MYST含有乙酰辅酶A同源序列，使组蛋白H3上的赖氨酸位点乙酰化；而MYST亚家族则作用于H4上赖氨酸位点乙酰化。在拟南芥中，AtHAG1抑制花分生组织相关基因包括WUS、AGAMOUS和LEAFY的表达来调控花发育^［16］；AtHAM1和AtHAM2通过调节FLC和MAF3/4基因表达来影响开花时间^［17］。作为转录共活化因子，CBP家族成员与多种转录因子相互作用，特异性增强靶基因启动子区域的转录活性^［18］，拟南芥AtHAC1基因突变引起植株开花推迟、育性降低^［19］。拟南芥TAF_II250蛋白包含TAF_II250型-HAT结构域、泛素结构域、C2HC锌指结构和bromodomain结构域^［20］，其中，泛素结构域在植物中特有^［21］，AtHAF2作为转录共活化因子可活化光诱导基因的转录^［22］。

文冠果作为重要的木本油料作物，组蛋白乙酰化修饰在种胚发育和油脂合成代谢的调控机制尚未被完全阐明。目前，文冠果的基因组测序工作已经完成，文冠果含有15条染色体，其基因组大小约为490 Mb，编码基因约21 059个^［23］，为筛选和鉴定XsHDACs和XsHATs家族成员提供了数据支持。鉴于文冠果种子具有高油脂含量和合成特殊脂肪酸的独特价值，解析XsHDACs和XsHATs家族成员，并探究它们在种胚发育过程中的表达模式，对于从表观遗传层面理解文冠果油脂合成调控网络至关重要。因此，本研究对文冠果XsHDACs和XsHATs家族成员进行鉴定，并对其蛋白质理化性质、系统进化、染色体定位、基因和蛋白质结构、启动子顺式作用元件和表达模式进行了分析，并着重探究其在种胚发育过程中的表达特性，旨在为揭示组蛋白乙酰化修饰调控文冠果种子发育和油脂合成的分子机制提供参考。

1 材料与方法

1.1　试验材料

本研究所用文冠果植物材料采自北京林业大学，在2024年4月采集叶片和花序，于4月15日至20日，分别采集授粉后35、45、65、75 d（DAF）4个不同生长时期的果实和种子，每个生长时期的果实与种子样本均设置3个生物学重复。从相同种质收集的所有时间点的种子样品用于RNA测序分析。所有样品均在液氮中快速冷冻，随后在超低温冰箱中-80 ℃保存。

1.2　 XsHDACs 和 XsHATs 基因家族成员鉴定

文冠果基因组数据来自文冠果基因数据库（https：//yellowhorn.plantgenie.org）^［24］，以拟南芥HAT和HDAC蛋白序列作为查询，使用BlastP方法搜索HAT和HDAC同源蛋白^［25］。将候选基因的蛋白序列提交至Pfam（http：//pfam.xfam.org）^［26］、CDD（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）^［27］、SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de）蛋白数据库分析其保守结构域^［28］，确定文冠果XsHATs和XsHDACs基因家族成员。

1.3　 XsHDACs 和 XsHATs 基因编码蛋白家族成员理化性质分析

利用软件ExPASy（https：//web.expasy.org/protparam）预测HDAC和HAT蛋白的理化性质，包括基因长度、氨基酸数量、蛋白分子质量和等电点等；使用WoLF PSORT软件（https：//wolfpsort.hgc.jp）在线预测蛋白家族成员的亚细胞定位信息。

1.4　 XsHDACs和XsHATs系统发育树构建

从植物ChromDB数据库中检索来自4种不同植物（拟南芥、水稻（Oryza sativa）、荔枝（Litchi chinensis）和茄子（Solanum melongena））共59个HDAC和46个HAT蛋白序列，与文冠果蛋白序列进行ClustalW氨基酸多重比对^［29］，然后使用MEGA 5程序构建全部物种的系统发育树^［30］，采用遗传距离建树法的相邻连接法（neighbor-joining，NJ）建树^［31］，对该树进行1 000次的Bootstrap校正，利用在线工具iTOL（https：//itol.embl.de/upload.cgi）进行美化。

1.5　 XsHDACs 和 XsHATs 基因家族成员染色体定位及共线性分析

利用文冠果基因组中的gff3文件在TBtools软件中获得XsHDACs和XsHATs基因家族成员的染色体定位信息，并绘制分布图。将gff文件提交到TBtools中处理，获得文冠果的基因密度文件、共线性文件、collinearity文件及XsHDACs和XsHATs基因定位文件后共同提交到Advanced Circos工具中进行可视化。

1.6　 XsHDACs 和 XsHATs 基因家族成员结构及其编码蛋白保守基序分析

利用MEME^［32］（http：//meme-suite.org/tools/meme）分析基因保守基序，使用默认参数。NCBI在线网站WebCD-SearchTools（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cg）进行保守结构域分析，利用TBtools软件对Motif和保守结构域进行可视化处理^［33］。

1.7　 XsHDACs和XsHATs蛋白家族成员二级和三级结构分析及预测

利用Prabi（https：//npsa-prabi.ibcp.fr）和SWISS MODEL（https：//swissmodel.expasy.org）对XsHDACs和XsHATs蛋白的二、三级结构进行预测。

1.8　 XsHDACs 和 XsHATs 基因家族成员启动子区顺式作用元件分析

在文冠果基因数据库（https：//yellowhorn.plantgenie.org）网站下载XsHDACs和XsHATs基因家族起始密码子上游2 000 bp启动子序列，利用PlantCare^［34］（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html）预测分析顺式作用元件，利用TBtools软件对其位置进行可视化。

1.9　 RNA提取和实时荧光定量

利用RT-qPCR定量分析XsHDACs和XsHATs基因在文冠果的叶、花、果皮及不同发育时期种胚的表达情况。使用TIANGEN RNA prep Pure植物总RNA提取试剂盒（RNA prep Pure Plant Plus Kit），分别提取文冠果不同发育时期的种胚及叶片、花、果皮的总RNA，然后使用FastKing cDNA合成试剂盒（FastKing RT Kit）合成cDNA，RT-qPCR检测采用SYBR Green Supermix试剂盒，在Bio CFX96仪器上完成（表1）。以文冠果GAPDHF基因作为内参，通过2^-∆∆Ct法分析各基因的相对表达量，进行3次生物学重复。用Graphpad Pism 9.5软件对数据进行整理和绘图。

2 结果与分析

2.1　 XsHDACs 和 XsHATs 基因家族成员鉴定及编码蛋白理化特征

通过序列比对，在文冠果基因组数据库中筛选出15个XsHDACs基因和8个XsHATs基因。XsHDACs蛋白家族可分为3个亚家族，其中RPD3/HDA1亚家族有8个成员，HD2亚家族有3个成员，SIR2亚家族有4个成员。XsHATs蛋白家族可分为4个亚家族，其中GNAT亚家族有3个成员，MYST亚家族有2个成员，CBP亚家族有1个成员，TAF_II250亚家族有2个成员（表2）。

蛋白质的理化性质和细胞器定位与其功能密切相关，分析文冠果XsHDACs和XsHATs蛋白家族成员等电点发现，XsHDACs中RPD3/HDA1亚家族和HD2亚家族蛋白家族成员均为酸性，仅XsHDA5例外，呈中性；而SIR2亚家族4个成员均呈碱性。XsHATs中除了XsHAM2、XsHAC1、XsHAF1呈碱性，XsHAG3呈中性，其他均呈酸性。分析其疏水性特点发现，除XsHDA14和XsSRT6a外，XsHDACs和XsHATs蛋白均属于亲水性蛋白（表2）。亚细胞定位分析结果表明，XsHDACs蛋白家族和XsHATs蛋白家族成员主要定位于细胞核，其次是细胞质，少量定位在叶绿体、细胞骨架等部位（表2）。

2.2　 XsHDACs 和 XsHATs 基因家族成员染色体定位及共线性关系

文冠果一共有15条染色体^［35］，对文冠果XsHDACs和XsHATs基因进行染色体定位分析，结果显示：15个XsHDACs基因分别定位于文冠果7条染色体上，分别为第1、6、8、10、12、13、15号染色体。其中，在10号染色体上有3个基因（XsHDT1b、XsHDA9、XsHDA8）；在13号染色体上有4个基因（XsHDA5、XsHDA15、XsHDA6、XsHDT3），其他每条染色体上仅有1~2个基因（图1A）。8个XsHATs基因分别定位于文冠果5条染色体上，包括第1、4、7、12、13号染色体，其中，7号染色体上有2个基因（XsHAM1和XsHAM2），13号染色体上有3个基因，包括XsHAG3、XsHAC1和XsHAF1（图1B）。结果说明，XsHDACs和XsHATs基因在染色体组中呈分散分布状态。在XsHDACs和XsHATs共线性分析之后，发现有1对节段重复事件（图1C），XsHDT1a和XsHDT1b可能由片段复制产生，所以基因的串联和节段复制事件主要发生XsHDACs家族中。

2.3　 XsHDACs和XsHATs蛋白家族成员系统进化树、基因结构和保守基序

为了研究文冠果XsHDACs和XsHATs蛋白家族成员在多物种间的进化关系，将其与拟南芥、水稻、荔枝和茄子的HDAC和HAT蛋白序列分别构建系统进化树（图2A、2B）。结果表明，文冠果XsHDACs和XsHATs与木本植物荔枝的亲缘关系最近，而与单子叶植物水稻的亲缘关系最远，可能因为文冠果与荔枝同属于无患子科，从植物分类学和进化关系上亲缘关系近。

为了了解XsHDACs和XsHATs基因结构，进一步分析XsHDACs和XsHATs基因家族成员内含子和外显子数量和分布情况（图3A、3B）。结果显示，XsHDACs基因家族成员中RPD3/HDA1亚家族成员的基因结构存在较大差异，而HD2和SIR2亚家族内部成员基因结构较相似，多数成员含有5~15个外显子，而XsHDA5基因含有29个外显子，XsHDA14和XsHDA8基因仅含有3个外显子；XsHATs基因家族成员中亚家族成员内部基因结构较相似，外显子数目为9~19个。

蛋白结构中保守基序通常与蛋白质的功能相关，利用MEME软件预测了XsHDACs和XsHATs蛋白家族成员保守基序，结果显示（图3A、3B），在RPD3/HDA1亚家族所有成员中均含motif 1、motif 6和motif 8，这些基序为该亚家族成员特有的保守基序，推测共同构成组蛋白去乙酰化酶催化功能的核心结构。而为SIR2亚家族特有的motif 7通常包含与NAD⁺辅因子结合相关的关键氨基酸残基，视为该类酶独特催化机制的基础。在XsHATs蛋白家族中，TAF_II250和MYST 2个亚家族显示较高的保守性：TAF_II250亚家族的2个成员均含有motif 2、motif 4、motif 5和motif 6，这些基序可能共同组装成HAT催化活性中心；MYST亚家族的2个成员则均含有motif 1、motif 2、motif 3、motif 7和motif 8，其结构特征表明，这些区域可能负责乙酰辅酶A的结合及催化过程。

进一步对XsHDACs（图4A）和XsHATs（图4B）蛋白家族成员结构域进行预测，结果显示，各亚家族内部结构较为保守。在XsHDACs蛋白家族中，RPD3/HDA1亚家族的9个成员均含有保守的组蛋白去乙酰化酶结构域，该结构域是其催化活性及{\mathrm{Z}}_{\mathrm{n}}^{\mathrm{2}+}结合的关键；HD2亚家族的3个成员均含有Nucleoplasmin结构域（PF03066），主要介导蛋白与核仁的靶向及蛋白寡聚化；SIR2亚家族的4个成员则均含有SIR2结构域（PF02146），该结构域定义其NAD⁺依赖性的去乙酰化机制。在XsHATs蛋白家族中，GNAT亚家族含有的结构域差异较大：XsHAG2蛋白N端含有保守的HAT结构域，负责乙酰转移酶活性；XsHAG3蛋白含有延伸因子亚基ELP3结构域；CBP/p300亚家族成员XsHAC1蛋白含有2个TAZ类型的锌指结构域（介导与多种转录因子的相互作用）和1个HAT结构域（执行乙酰化催化功能）；TAF_II250亚家族2个成员XsHAF1和XsHAF2蛋白均含有保守的TFIID转录因子亚基DUF3591，C端均含有1个Bromodomain结构域，该结构域作为“阅读器”特异性识别并结合乙酰化的组蛋白尾巴，从而将复合物锚定于特定染色质区域；MYST亚家族2个成员均含有MYST-like组蛋白乙酰转移酶结构域（PLN00104），该结构域定义该类酶特有的催化机制。

2.4　 XsHDACs和XsHATs蛋白二级和三级结构

二级结构预测显示，XsHDACs和XsHATs蛋白家族所有成员主要由无规卷曲和α-螺旋组成，还有少量延伸链（表3）。利用SWISS-MODEL解析XsHDACs和XsHATs蛋白家族成员三维结构（图5），发现2个蛋白家族成员三级结构模型预测XsHDACs和XsHATs家族富含不规则卷曲和α-螺旋，还有少量延伸链，与二级结构预测相符，其中XsHDA19a和XsHDA19b、XsHDT1a和XsHDT1b、XsHAM1和XsHAM2蛋白三级结构相似度较高。预测的模型全局质量评估值为0.69~0.85，准确性较高。

2.5　 XsHDACs 和 XsHATs 基因家族成员启动子顺式作用元件

利用PlantCARE分析XsHDACs和XsHATs基因家族成员启动子顺式作用元件，结果显示（图6），这2个基因家族成员启动子序列含有大量生长发育、光响应、激素响应、防御胁迫等顺式作用元件。其中，XsHDA8和XsHDA15基因含有种子特异性元件，XsHDA5、XsHDA15、XsHDA19a、XsHDA19b、XsHAG1、XsHAM1、XsHAC1、XsHAF1基因含有参与胚乳表达顺式调控元件，由此推测，这些XsHDACs和XsHATs基因可能在文冠果的种子发育中发挥作用。同时，多数XsHDACs和XsHATs基因家族成员含有脱落酸、茉莉酸甲酯和防御反应相关元件，说明XsHDACs和XsHATs基因家族成员可能在生物胁迫响应方面发挥作用。

2.6　 XsHDACs 和 XsHATs 基因家族成员在文冠果不同组织中的表达模式

为了探究XsHDACs和XsHATs基因家族成员可能在文冠果生长发育中的功能，利用荧光定量PCR分析XsHDACs和XsHATs基因在叶、花、果皮和授粉75 d后的成熟种胚4种不同组织中的表达模式。结果显示（图7），除XsHDA19a、XsHDT1b、XsHDT3、XsHAG2、XsHAG3基因以外，其他XsHDACs和XsHATs基因家族成员均在种胚中高表达，而且其水平高于其他组织，说明这些基因在文冠果种胚发育过程中发挥重要作用。此外，XsHDA14、XsSRT4、XsSRT6b、XsHAF1基因在花中表达量较高，而XsHAM1和XsHAC1基因在果皮中表达量较高，说明这些基因可能在文冠果果实或花发育方面起作用。

2.7　 XsHDACs 和 XsHATs 基因家族成员在文冠果种胚发育过程中的表达模式

文冠果通常由3~4个心皮组成，果实呈球形或近球形。共采集花后发育4个阶段：DAF 35、DAF 45、DAF 65、和DAF 75。由图8A可看出，随着果实发育成熟，果实和种胚在大小和颜色发生明显变化。果皮由嫩绿色逐渐成熟变为褐色；种皮由白色逐渐变黑，种胚在DAF 35为子叶胚期，呈淡黄色，随着种子成熟，子叶胚不断膨大，直至充满整个种子。

为了探究XsHDACs和XsHATs基因家族成员在文冠果种胚生长发育中的功能，利用荧光定量PCR分析其在DAF 35、DAF 45、DAF 65、和DAF 75的种胚中的动态表达模式。结果显示（图8B），XsHDACs基因家族成员的总体表达趋势随种胚发育进程逐渐升高。其中，XsSRT2、XsSRT6b、XsHDT1a、XsHDT1b和XsHDT3基因在DAF 65时达到峰值，XsHDA5、XsHDA6、XsHDA8、XsHDA9、XsHDA14、XsHDA15、XsHDA19b、XsSRT4、XsSRT6a基因在DAF 75时达到峰值。XsHATs基因家族成员表达均在发育过程中逐渐增加，并于DAF 75达到峰值。

3 讨论

本研究通过生物信息学方法分析文冠果XsHDACs和XsHATs基因家族的编码蛋白理化性质、基因结构、保守基序、染色体定位、共线性和顺式作用元件，并利用实时荧光定量PCR解析XsHDACs和XsHATs基因家族成员在不同组织及种胚发育时期的表达模式。系统性揭示文冠果XsHDACs和XsHATs基因家族成员特征和表达规律，为阐明其在文冠果种胚发育中表观遗传调控机制提供新视角。

3.1　文冠果 XsHDACs 和 XsHATs 基因家族进化保守性与特异性

本研究共鉴定出文冠果15个XsHDACs基因和8个XsHATs基因，系统进化分析显示，XsHDACs和XsHATs蛋白家族成员与同为无患子科的荔枝亲缘关系最近，体现物种间进化保守性。多数XsHDACs和XsHATs蛋白家族成员为亲水性蛋白质，呈酸性，主要定位于细胞核，与同科属的龙眼（Dimocarpus longan）研究结果一致^［36-37］。保守基序和基因结构分析显示，同一亚家族内motif组成和内含子/外显子结构高度保守；三级结构显示，各亚家族内部结构高度保守，表明其功能相似；但不同亚家族间的结构存在一定差异，这可能导致它们具有功能特异性。

3.2　 XsHDACs 基因家族成员在文冠果种胚发育过程中的调控作用

组蛋白去乙酰化酶通过去除组蛋白乙酰化修饰，在染色质紧缩和基因沉默中发挥关键作用，参与植物种子发育过程，影响胚胎发生、胚乳发育、成熟及萌发等关键阶段。已有报道，组蛋白去乙酰化酶在玉米（Zea mays）中ZmHDA101、ZmHDA102和ZmHDA108基因具有相似的表达谱，在早期胚乳中积累较高，影响籽粒大小与形态建成^［38-39］；在水稻中，HDA716基因在胚乳和发芽的种子中表达水平较高；而HDA710和HDA703基因在吸水和发芽的种子中表达水平较高，表明其在种子发育和发芽过程中发挥作用^［40］。作为油料种子，文冠果种子中油脂积累是从花后33 d开始，花后40~68 d是种胚油脂累积的快速期，直至种胚成熟^［41］。文冠果种胚发育后期特异性上调且表达量较高的XsHDACs（包括XsHDA5、XsHDA6、XsHDA8、XsHDA9、XsHDA15等）基因，在种胚发育晚期（DAF 65~75）表达峰值与文冠果油脂快速积累期高度吻合，推测XsHDA5、XsHDA6和XsHDA15基因可能通过去乙酰化作用，参与胚胎发生早期活跃而后期需要关闭的基因程序，从而使代谢流转向油脂合成途径。这一机制与在拟南芥中的研究^［7，9］发现一致，HDA6和HDA19蛋白通过抑制LEC1、FUS3和ABI3等胚胎相关基因的表达，促进种子成熟和维持幼苗正常发育。

3.3　 XsHATs 基因家族成员在文冠果种胚发育过程中的调控作用

在拟南芥中，GCN5激活FAD3等脂肪酸去饱和酶基因的表达，促进α-亚麻酸合成，表明GCN5通过表观调控影响种子油脂合成^［42］。本研究中，文冠果GNAT亚家族成员XsHAG1、XsHAG2和XsHAG3基因在种胚发育后期同样高表达（图8），这说明它们可能执行与AtGCN5相似的功能，即通过乙酰化修饰打开油脂合成通路关键基因的染色质结构，从而促进文冠果种子中不饱和脂肪酸（包括神经酸）的合成与积累。此外，拟南芥AtHAC1与MED8/MED25互作，激活糖响应基因GPT2、CHS表达，协调碳源分配至储存物质合成路径，确保储存物质积累与能量供应平衡^［43］。文冠果中XsHAC1、XsHATs基因在成熟后期高表达，是否通过类似机制调控油脂合成，仍需进一步研究。

3.4　 XsHDACs 和 XsHATs 基因家族成员在文冠果不同组织中的表达模式分析

启动子顺式作用元件分析结果表明，XsHDA8和XsHDA15基因含有种子特异性调控元件，由此推测，这些XsHDACs和XsHATs基因家族成员可能在文冠果种子发育中发挥作用。文冠果为无胚乳种子，其胚乳在发育过程中被子叶完全吸收，但本研究发现多个XsHDACs与XsHATs基因家族成员启动子中仍保留“胚乳相关”作用元件。这一现象可能有2个原因：第一，进化上的保守性。禾本科（Poaceae）等有胚乳植物的胚乳是主要的营养储存组织，而豆科（Fabaceae）、无患子科等无胚乳植物的子叶则承担这一功能，尽管最终形态不同，但调控营养物质合成、积累与储存遗传程序在进化上具有同源性^［44-45］，这些“胚乳相关”作用元件在文冠果中或被招募以调控子叶中油脂和蛋白的积累。其二，为功能的关联性。许多胚乳特异性表达的基因同样编码油脂和贮藏蛋白合成的关键酶^［46］，因此，这些顺式作用元件在文冠果中可能直接与调控油脂合成相关转录因子结合。本研究发现在种胚发育后期，XsHDACs与XsHATs基因表达显著上调并与油脂积累趋势一致，提示其可能通过调控染色质开放性，影响下游油脂合成基因（如FAD3、DGAT等）表达，从而促进文冠果子叶中油脂高效积累。

本研究发现，XsHDACs和XsHATs蛋白家族成员的表达呈现显著的组织特异性。绝大多数基因在种胚中的表达水平远高于叶、花和果皮等其他组织（图7），这表明它们的功能主要集中于种子发育过程，尤其是与胚胎发生、油脂合成与积累等关键事件密切相关。这一表达模式与同属无患子科的龙眼HDAC蛋白家族特征相似^［35］，在龙眼中，多个HDAC基因（如DlHDA6、DlHDA9、DlHDA19等）也在胚性组织和种子中优势表达，进一步支持HDAC和HAT在木本植物种子发育中的功能保守性。此外，部分基因在其他组织中表现出特异性表达模式，例如，XsHDA14、XsSRT4、XsSRT6b和XsHAF1基因在花中表达量较高，提示它们可能参与花的发育或开花调控；而XsHAM1和XsHAC1基因在果皮中高表达，暗示其可能在果实发育中发挥作用。这些发现揭示了XsHDACs和XsHATs基因家族功能的多样性，表明其在协调文冠果整个生长发育过程中均扮演着重要角色，而非仅限于种胚发育。

4 结论

本研究系统地研究了文冠果XsHDACs和XsHATs基因家族成员的基因和蛋白结构、理化性质、系统发育、蛋白质的二级和三级结构及启动子顺式元件等关键特征，这些关键基因和蛋白特征能够为文冠果XsHDACs和XsHATs基因家族进化和功能解析提供理论参考。此外，还探究了这些基因家族成员在不同组织和种胚发育时期的动态表达，为理解文冠果种胚发育及油脂合成的表观遗传调控机制提供了重要视角。

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基金资助

国家自然科学基金面上项目(32371833)