过表达PtrMYB002基因抑制拟南芥生长并提高其抗旱性

Overexpression of the PtrMYB002 gene Inhibits Growth of Arabidopsis thaliana and Enhances Its Drought Resistance

摘要

该研究针对全球干旱加剧导致杨树生长受抑及死亡的问题，以毛果杨（Populus trichocarpa）R2R3-MYB转录因子PtrMYB002为对象，通过基因克隆、表达载体构建、拟南芥（Arabidopsis thaliana）遗传转化和杨树（Populus L.）瞬时转化等手段，结合生物信息学、亚细胞定位、表型观察、生理指标测定及基因表达分析等方法，探究其在植物生长与抗旱性调控中的功能。结果表明：PtrMYB002定位于细胞核，其表达受干旱与ABA处理的显著诱导；过表达PtrMYB002基因显著负影响拟南芥的子叶面积、下胚轴长度、根长、莲座直径、地上部分鲜质量及花薹高度，但提高其抗旱性，表现为干旱条件下转基因株系的净CO₂同化速率、电子传递速率（ETR）、实际光化学效率（Y（Ⅱ））、光化学淬灭系数（qP）和非光化学淬灭系数（NPQ）均显著高于野生型（WT），而气孔导度、蒸腾速率和相对电导率则显著低于WT，同时转基因株系中抗旱相关基因AtRD29A与AtDREB2的相对表达量显著上调。此外，瞬时转化PtrMYB002基因的‘84K’杨（P. alba×P. glandulosa ‘84K’）中PagRD29A与PagDREB2B基因相对表达量显著高于对照组，表明其调控机制在杨树中可能具有一定的保守性。综上，过表达PtrMYB002基因抑制拟南芥生长，同时增强其抗旱性，体现了其参与植物“生长与防御权衡”策略，该研究结果为杨树抗旱分子育种提供了新的基因资源与理论依据。

Abstract

This study addressed the issue of growth suppression and mortality in poplar caused by increasing global drought， focusing on the R2R3-MYB transcription factor PtrMYB002 from Populus trichocarpa. Utilizing methods including gene cloning， expression vector construction， genetic transformation of Arabidopsis thaliana， and transient transformation in poplar， combined with bioinformatics analysis， subcellular localization， phenotypic observation， physiological index measurement， and gene expression analysis， we investigated its role in regulating plant growth and drought tolerance. The results showed that PtrMYB002 was localized in the nucleus and its expression was significantly induced by drought and ABA treatment. Overexpression of PtrMYB002 gene significantly inhibited the cotyledon area， hypocotyl length， root length， rosette diameter， above-ground fresh mass， and inflorescenced stem height in Arabidopsis， but enhanced its drought tolerance. Under drought conditions， the transgenic lines exhibited significantly higher net CO₂ assimilation rate， electron transport rate（ETR）， actual photochemical efficiency（Y（Ⅱ））， photochemical quenching coefficient（qP）， and non-photochemical quenching coefficient（NPQ）， while the stomatal conductance， transpiration rate， and relative electrical conductivity were significantly lower compared to the wild-type（WT）. Concurrently， the expression levels of drought-responsive genes AtRD29A and AtDREB2 were significantly upregulated in the transgenic lines. Furthermore， in the ‘84K’ poplar with transient overexpression of PtrMYB002 gene， the expression levels of PagRD29A and PagDREB2B genes were significantly higher than that in the control group， indicating that this regulatory mechanism was likely conserved in poplar. In conclusion， the overexpression of PtrMYB002 gene suppressed growth in Arabidopsis while enhancing its drought tolerance， demonstrating a potential role of the gene in participation of “growth and defense trade-off” strategy， and provided new genetic resources and a theoretical basis for molecular breeding of drought-tolerant poplar.

Graphical abstract

关键词

毛果杨 / 拟南芥 / PtrMYB002 / 生长发育 / 抗旱性

Key words

Populus trichocarpa / Arabidopsis thaliana / PtrMYB002 / growth and development / drought resistance

全球气候变化导致的干旱事件频发。2010—2020年，全球因干旱造成的农作物产量损失约300亿美元，并且，预计到2050年，气候变化将使全球可利用淡水资源减少一半^［1］。杨树（Populus L.）是我国重要的林木之一，具有重要的生态和经济价值。干旱胁迫会严重影响杨树的水分运输，导致其叶片萎蔫或脱落，光合作用和生长受限，甚至死亡^［2-3］。近年来，干旱造成我国“三北”防护林中杨树的大面积衰退^［4］。因此，通过分子育种技术快速培育抗旱性更强的杨树品种已成为杨树研究领域的当务之急。

植物在进化过程中形成了精密的分子调控网络，其中转录因子是核心调控成员。MYB（v-myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog）转录因子是植物中庞大的转录因子家族之一。MYB蛋白的C端为转录调控区域，N端具有多个由重复序列构成的保守的DNA结合域，重复序列是由50个左右的氨基酸残基形成的helix-helix-loop-helix二级结构，其中富含几个与DNA结合有关的高度保守的色氨酸残基^［5］。根据重复序列重复次数的不同，MYB蛋白分为4类：1R-MYB、2R-MYB、3R-MYB和4R-MYB（R：repeat）。其中，2R-MYB里的R2R3-MYB在植物中数量占比最多且研究较为深入。该类型的MYB转录因子广泛参与植物的生长发育、初级与次级代谢及生物与非生物胁迫等过程^［6-8］。

R2R3-MYB转录因子在杨树环境适应机制中发挥关键作用。PsnMYB108和PagMYB73可通过提高植株对活性氧（ROS）物质的清除能力并促进植株体内脯氨酸的积累来分别提高烟草（Nicotiana tabacum）和杨树的耐盐性^［9-10］；PtoMYB142促进PtoCER4和PtoKCS6基因表达，使转基因杨树叶片表面的蜡质增多，显著增强其抗旱性^［11］；PtrMYB94通过促进脱落酸（ABA）合成及上调PtrABA1和PtrDREB2B等基因的表达来提高杨树的抗旱性^［12］；PdbMYB6通过增强植物体内活性氧的清除能力、降低气孔开放程度及调控渗透平衡来提高杨树的耐旱性^［13］；PeRAX2抑制PeANN1基因表达，减少叶片Cd²⁺积累，从而在镉胁迫下维持植株正常生长，稳定其光合作用效率并保持活性氧稳态^［14］；PagMYB147通过参与调控ROS稳态及水杨酸（SA）和茉莉酸（JA）信号通路正调控杨树对马格栅锈菌（Melampsora magnusiana）的抗性^［15］；过表达PtoMYB115基因的杨树对聚生小穴壳菌（Dothiorella gregaria）的抗性显著增强^［16］。此外，杨树等木本植物R2R3-MYB转录因子同时调控植物的生长发育和抗逆性。PdMYB2R089和PdMYB2R151分别促进转基因拟南芥（Arabidopsis thaliana）根的生长和种子萌发，并显著增强其抗旱性^［17］；过表达PagMYB151基因使杨树的株高和鲜质量显著增加，根系更发达且活力更强，同时增强其耐盐性^［18］；异源过表达PtoMYB142基因的拟南芥植株矮小且生长减缓，但可显著增强其抗旱性^［19］；过表达PtrSSR1基因的拟南芥中AtNCED3、AtABI1和AtCBL1等基因表达上调且内源ABA含量提高，其侧根生长受到抑制，但其耐盐性显著提高^［20］。异源过表达BpMYB4基因使拟南芥花序茎和侧枝的数量增加，且抑制木质素合成，促进纤维素合成，同时通过提高植株对活性氧的清除能力来减少细胞损伤^［21］。

毛果杨（Populus trichocarpa）MYB家族共包含354个成员，其中有152个1R-MYB、196个2R-MYB（全部为R2R3-MYB）、5个3R-MYB和1个4R-MYB成员^［22］。有关毛果杨R2R3-MYB转录因子PtrMYB002功能的研究仅见于其调控植物次生壁的生物合成^［23］。本研究揭示并补充PtrMYB002转录因子在调控拟南芥宏观生长及抗旱性方面的功能，不仅从更多角度挖掘该基因的功能，还为通过基因工程手段培育高抗旱性的杨树品种提供新的基因资源。

1 材料与方法

1.1　试验材料与生长条件

本试验涉及的植物材料有毛果杨、拟南芥、本氏烟草（Nicotiana benthamiana）和‘84K’杨（P. alba×P. glandulosa ‘84K’）。将继代培养1个月的毛果杨微繁苗种植在含有培养基质（V（草炭土）∶V（蛭石）=2∶1）花盆中，并在北京林业大学苗圃温室（相对湿度在70%左右，温度23~25 ℃，光照强度200 μmol·m^-2·s^-1，光周期为16 h光照/8 h黑暗）里培养5个月后进行ABA喷施处理、干旱处理及RT-qPCR分析。用于花序侵染的哥伦比亚型（Col-0）拟南芥生长于人工气候箱中（相对湿度在60%左右，温度20~22 ℃，光照强度150 μmol·m^-2·s^-1，光周期为16 h光照/8 h黑暗，CO₂摩尔分数为500 μmol·mol^-1）。用于亚细胞定位试验的本氏烟草生长在光照培养箱中（相对湿度在50%~60%，温度20~22 ℃，光照强度150 μmol·m^-2·s^-1，光周期为16 h光照/8 h黑暗）。‘84K’杨微繁苗继代于含有木本植物生根培养基（WPM+0.05 mg·L^-1 IBA+0.05 mg·L^-1 NAA+30 g·L^-1蔗糖+6 g·L^-1琼脂，pH=5.8）的无菌组培瓶中，并在植物组织培养室（温度25 ℃左右，光照强度150 μmol·m^-2·s^-1，光周期为16 h光照/8 h黑暗）里培养15~20 d后用于瞬时转化试验。

1.2　试剂、菌株和仪器

本试验中所使用的EASYspin Plus植物（含多糖多酚）RNA快速提取试剂盒和2×SybrGreen qPCR Mix荧光定量酶预混液购自北京艾德莱生物科技有限公司；FastQuant cDNA第一链合成试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒和质粒提取试剂盒购自天根生化科技有限公司；克隆载体pMD-18T和T4-DNA连接酶购自TaKaRa公司；大肠杆菌（Escherichia coli）Top10菌株和农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）GV3101菌株购自上海唯地生物技术有限公司；限制性核酸内切酶SmaⅠ和KpnⅠ购自New England Biolabs公司。本试验中所使用的CFX96 Real-Time PCR仪由美国Bio-Rad公司生产；LI-6400便携式光合测定系统由美国内布拉斯加州林肯市Li-Cor公司生产；Dual-PAM-100测定系统由德国埃费尔特里希市瓦尔兹·海因茨有限公司生产；SP-756P紫外可见分光光度计由上海光谱仪器有限公司生产；DDS-307电导率仪由上海仪电科学仪器股份有限公司生产；激光共聚焦显微镜SP8由德国徕卡公司生产。

1.3　基因克隆和表达载体构建

使用EASYspin Plus植物（含多糖多酚）RNA快速提取试剂盒提取毛果杨全株（即取毛果杨的根、茎和叶组织并混样，下同）的总RNA，再使用FastQuant cDNA第一链合成试剂盒反转录得到cDNA。以cDNA为模板，使用特异性引物F（5′-AT GAGGAAGCCAGAGGCCTCTG-3′）和R（5′-ACTT TGGAAATCAAGAGAAGGACAGGC-3′）扩增得到PtrMYB002基因（基因ID：Potri.001G258700）全长编码序列。使用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收PCR产物后连接到克隆载体pMD-18T上，并转化到Top10菌株中，菌液涂布于含有100 mg·L^-1氨苄（ampicillin）的LB平板上，37 ℃倒置培养8 h后，挑取单克隆并进行PCR检测，检测结果为阳性的单克隆菌送至生工生物工程股份有限公司测序。

以测序正确的基因片段为模板，通过PCR分别在其5′和3′端加上限制性酶切位点SmaⅠ和KpnⅠ，对加上酶切位点的目的基因和改造过的pCAMBIA1300载体同时进行双酶切，然后将PtrMYB002基因全长开放阅读框通过T4-DNA连接酶连接到表达载体上并转化大肠杆菌，PCR检测出阳性单克隆后进行测序。使用质粒提取试剂盒提取测序正确的阳性单克隆菌液里的质粒并转化到GV3101菌株中，菌液涂布于含有100 mg·L^-1卡那霉素（kanamycin）和50 mg·L^-1利福平（rifampicin）的YEB平板上，28 ℃倒置培养48 h后，挑取单克隆并进行PCR检测，保存PCR检测结果为阳性的单克隆菌液，用于转化拟南芥。

1.4　拟南芥遗传转化

采用花序侵染法转化拟南芥^［24］，收种后撒播到筛选培养基（1/2 MS+25 mg·L^-1 hygromycinB+20 g·L^-1蔗糖+6 g·L^-1琼脂，pH=5.8）上，能正常萌发生根的幼苗初步认定为阳性苗。幼苗长大后剪取叶片，使用CTAB法提取DNA，用特异性引物F（序列同1.3）和R1（5′-TCCAGCTTGTGCCCCAGGATG-3′，以pCAMBIA1300载体上一段序列为模板所设计的引物）进行PCR检测（以1.3中包含目的基因的质粒为正对照；以野生型拟南芥的总DNA为负对照）。PCR鉴定为阳性的T₁代拟南芥株系自交并通过筛选获得T₃代纯合体。

1.5　生物信息学分析

利用NCBI网站（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）的BLAST功能（e-value值设定为1×10^-10）得到毛果杨、拟南芥、白桦（Betula platyphylla）、苹果（Malus domestica）、巨桉（Eucalyptus grandis）、水稻（Oryza sativa）和玉米（Zea mays）中与PtrMYB002亲缘关系较近的MYB家族成员的全长氨基酸序列，在MEGA7软件中进行比对并使用NJ（neighbor-joining）法构建系统进化树。使用ESPript 3.0（https：//espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/）对PtrMYB002、Ptr-MYB003、PtrMYB020、PtrMYB021、AtMYB46、AtMYB83、MdMYB46、EgMYB46、BplMYB46、OsMYB83和ZmMYB38的氨基酸序列进行比对并分析保守结构域。利用Plant CARE网站（https：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）分析PtrMYB002基因ATG上游2 000 bp长度的启动子区域的顺式作用调控元件。

1.6　基因表达模式分析

利用PlantGenIE.org网站（https：//plantgenie.org/）分析PtrMYB002基因在干旱、虫害和机械损伤条件下表达水平的变化。

为研究PtrMYB002基因在毛果杨不同组织中的表达情况，分别选取生长健康的半年生毛果杨的根、茎和叶（5~8节间，下同）组织进行RT-qPCR分析。

为分析PtrMYB002基因对ABA的响应情况，分别选取50 μmol·L^-1 ABA（同时添加体积分数0.02%的吐温20）喷施处理后0、1、3、6、9 h的半年生毛果杨相同部位的叶片进行RT-qPCR分析。

为探究PtrMYB002基因对干旱胁迫的响应情况，将半年生的毛果杨转移到相对湿度为50%左右且温度为25 ℃左右的温室中，浇足水后培养一夜，翌日上午10：00时取叶片为试材（即干旱处理0 d的叶片材料），同时不再继续浇水，开始进行干旱处理，后续再分别选取干旱处理3、6、9 d（每次取材的时间均为上午10：00时）的相同部位的叶片为试材进行RT-qPCR分析。

分别选取干旱处理前后野生型（WT，下同）、过表达株系1（OE-1，下同）和过表达株系2（OE-2，下同）拟南芥全株比较不同基因型拟南芥中响应干旱胁迫相关基因RD29A和DREB2的表达水平。

提取上述材料的总RNA并反转录为cDNA。使用2×SybrGreen qPCR Mix预混液和特异性引物，在CFX96 Real-Time PCR仪中进行RT-qPCR分析并绘制熔解曲线。采用2^-ΔΔCt法计算基因的相对表达量。杨树和拟南芥分别用多聚泛素酶基因（UBQ）和肌动蛋白基因2（Actin2）作为内参基因，所使用的特异性引物序列见表1。RT-qPCR分析均设置3个以上生物学重复，且每个生物学重复对应至少3次技术重复。

1.7　亚细胞定位

根据农杆菌介导的烟草瞬时转化法^［25］，分别用包含35S：GFP和35S：MYB002-GFP表达载体的农杆菌（菌液OD₆₀₀=0.8）同时侵染本氏烟草的叶片。先暗处理1 d，再光照培养2 d后，使用激光共聚焦显微镜SP8分别观察GFP蛋白和MYB002-GFP融合蛋白在烟草叶肉细胞中的定位情况。

1.8　不同基因型拟南芥生长情况观察

播种前，先后用75%的乙醇溶液、1%的次氯酸钠溶液和无菌水对拟南芥种子进行消毒和清洗。WT、OE-1和OE-2拟南芥的种子分区域播种于同一1/2 MS（Murashige and Skoog）固体培养基（1/2 MS+20 g·L^-1蔗糖+6 g·L^-1琼脂，pH=5.8）上，4 ℃避光环境下春化2 d后，放置于人工气候箱（参数同1.1）中培养至第7天，拍照记录植株生长情况。再将以上拟南芥幼苗转移到装有培养基质（V（草炭土）∶V（蛭石）∶V（珍珠岩）=2∶1∶1）的独立小盆（每盆5株幼苗）中继续培养，分别在生育第15天与第40天观察植株生长情况。使用ImageJ 1.54测量拟南芥的子叶面积、下胚轴长度、根长、莲座直径和花薹高度。使用电子天平测量拟南芥地上部分的鲜质量。以上试验中所设置的具体生物学重复详见图注。

1.9　拟南芥干旱处理

对1.8中同时期播种并在相同环境下生育至第15天的WT、OE-1和OE-2拟南芥停止浇水，于人工气候箱（相对湿度40%~50%，温度20~22 ℃，光照强度150 μmol·m^-2·s^-1，光周期为16 h光照/8 h黑暗，CO₂摩尔分数为500 μmol·mol^-1）中进行为期15 d的干旱处理，拍照记录干旱前后的拟南芥。

1.10　光合和荧光参数测定

使用LI-6400便携式光合测定系统测量1.9中干旱处理前后WT、OE-1和OE-2拟南芥相同部位叶片的净CO₂同化速率、气孔导度和蒸腾速率。测量时，光合有效辐射为800 μmol·m^-2·s^-1，外界CO₂摩尔分数为500 μmol·mol^-1。使用Dual-PAM-100测定系统测量1.9中干旱处理前后WT、OE-1和OE-2拟南芥相同部位叶片的实际光化学效率（Y（Ⅱ））、电子传递速率（ETR）、光化学淬灭系数（qP）和非光化学淬灭系数（NPQ）。每种材料至少3个生物学重复。

1.11　叶绿素含量测定

称取1.9中干旱处理前后WT、OE-1和OE-2拟南芥相同部位的叶片约0.2 g，剪碎后放入装有10 mL 95%乙醇溶液的具塞刻度试管中，室温暗处浸提过夜，其间摇动3~4次。次日，叶组织全部变白后，适度离心。使用SP-756P紫外可见分光光度计分别测量浸提液在665、649、470 nm波长处的吸光值，分别计算叶绿素a和叶绿素b的含量。每种材料至少3个生物学重复。

1.12　相对电导率测定

选取1.9中干旱处理前后WT、OE-1和OE-2拟南芥相同部位的叶片，剪成大小相同的长条（避开主脉），每种材料称取鲜样0.1 g，分别置于装有10 mL去离子水的刻度试管中，室温浸泡处理12 h且期间上下颠倒混匀3次。使用DDS-307电导率仪测定浸提液电导率（R₀），然后于沸水浴中加热30 min，冷却至室温后摇匀，再次测量电导率（R₁），计算相对电导率=R₀/R₁×100%。每种材料至少3个生物学重复。

1.13　瞬时转化‘84K’杨微繁苗

利用真空渗透的方法^［26］将空表达载体和携带目的基因PtrMYB002的表达载体分别瞬时转化半月龄的‘84K’杨微繁苗，室温暗处理1 d后，光照培养到48 h时整株取材进行RT-qPCR分析（方法同1.6）。

1.14　数据与图像处理

使用Microsoft Excel 2010对数据进行统计分析。使用SPSS 21.0对数据进行方差分析，采用Tukey和Duncan法多重比较各组数据之间的差异性。使用GraphPad Prism 8.3.0对数据进行可视化处理，所有数据结果均为平均值和标准差，并标记显著性差异。使用Adobe Photoshop CS6制图。

2 结果与分析

2.1　 PtrMYB002 基因生物信息学分析

系统发育树显示（图1A），这些MYB转录因子明显分为2个主要分支。其中，AtMYB85和AtMYB42在同一分支上，说明两者亲缘关系较近。另一分支的所有蛋白均与AtMYB46同源，表明这些蛋白在进化上高度保守；其中，PtrMYB002与EgMYB46、MdMYB46和BplMYB46的亲缘关系更近，功能可能更相似。在毛果杨中，PtrMYB002和PtrMYB003的同源蛋白分别是PtrMYB021和PtrMYB020，且PtrMYB003和PtrMYB020与AtMYB83在进化上更加保守。图1B进一步展示了PtrMYB002与其同源蛋白的氨基酸序列比对情况，它们都具有R2R3保守结构域。

PtrMYB002基因的启动子上具有3个参与干旱诱导性的MYB结合位点（MBS），其中2个位点的序列均为GTCAAC，另一个为CAACCC（图2A），MBS是一类能与MYB转录因子结合的DNA顺式作用元件，干旱诱导性MBS的功能是介导植物对干旱胁迫响应基因的表达调控。此外，启动子上还有3个参与脱落酸响应的顺式作用元件（ABRE），其中2个元件的序列均为ACGTG，另一个为GTGCAC（图2A），ABRE是植物中响应ABA信号的核心顺式作用元件，直接介导ABA依赖的基因表达调控。

2.2　 PtrMYB002 基因表达模式

PlantGenIE.org网站的数据显示，与对照组相比，干旱条件下PtrMYB002基因在毛果杨叶片中上调表达（图2B）。为进一步验证此结果，本研究对毛果杨进行了干旱处理，RT-qPCR结果显示，随干旱处理时间的增加，毛果杨叶片中PtrMYB002基因相对表达水平呈现先升高后下降的趋势，且干旱处理第3天的相对表达量达到峰值（图2D）。除此之外，ABA喷施处理毛果杨叶片后，PtrMYB002基因相对表达量也呈现先升高后下降的趋势，且第6小时达到峰值（图2E）。上述结果说明，PtrMYB002基因受到干旱胁迫和ABA的诱导表达，不仅验证了图2B的结果，还进一步说明该基因在很大程度上参与调控杨树的抗旱性。另外，PtrMYB002基因在毛果杨的根组织和茎组织相对表达量显著高于叶组织（P<0.05，图2C）。

2.3　 PtrMYB002亚细胞定位

35S：GFP载体瞬时转化烟草后，在叶肉细胞的细胞质及细胞核中均可检测到GFP信号，说明GFP蛋白在整个细胞中均有分布（图3A~3D）。而35S：MYB002-GFP载体瞬时转化烟草后，仅在叶肉细胞的细胞核中检测到GFP信号，说明MYB002-GFP融合蛋白仅在细胞核中分布（图3E~3H）。上述结果表明PtrMYB002定位于细胞核。

2.4　转基因拟南芥PCR鉴定结果

对侵染后并在筛选培养基上正常萌发生长的T₁代植株进行PCR鉴定。如图4所示，有2个株系的DNA产物大小与正对照一致，为阳性株系，分别命名为过表达株系1（OE-1）和过表达株系2（OE-2）。使这2个株系的拟南芥自交并通过筛选获得T₃代纯合株系。

2.5　转基因拟南芥生长表型分析

2.5.1　幼苗期生长表型比较

幼苗期，与WT相比，OE-1和OE-2拟南芥的子叶面积分别减小52.69%和53.89%（图5A、5B），2个过表达株系的下胚轴长度分别减小69.87%（OE-1）和70.50%（OE-2）（图5C、5D），且均差异显著（P<0.05）。此外，与WT相比，OE-1和OE-2拟南芥的根长分别减少21.50%和8.41%（图5E），但仅OE-1与WT之间差异显著（P<0.05）。

2.5.2　成苗期生长表型比较

在拟南芥未抽薹前，与WT相比，OE-1和OE-2拟南芥的莲座直径分别减小35.45%和36.36%（图6A、6B），2个过表达株系的地上部分鲜质量分别降低40.57%（OE-1）和45.67%（OE-2）（图6A、6C），且均差异显著（P<0.05）。拟南芥抽薹后，OE-1和OE-2拟南芥花薹高度分别比WT低27.79%和28.86%（图6D、6E），且均具有显著性差异（P<0.05）。

2.6　干旱处理前后不同基因型拟南芥生理指标分析

2.6.1　不同基因型拟南芥叶片光合和荧光参数比较

干旱处理前，WT、OE-1和OE-2拟南芥的净CO₂同化速率、气孔导度和蒸腾速率均无显著性差异；但与WT相比，OE-1和OE-2拟南芥的气孔导度分别降低15.27%和13.11%，且OE-1和OE-2拟南芥的蒸腾速率分别比WT低6.18%和4.78%（图7B~7D）。干旱处理后，WT、OE-1和OE-2拟南芥的净CO₂同化速率较干旱处理前分别显著下降40.59%、14.80%和24.02%；OE-1和OE-2拟南芥的净CO₂同化速率分别比WT高28.45%和17.53%且差异显著（P<0.05，图7B）。干旱处理后，WT、OE-1和OE-2拟南芥的气孔导度较干旱处理前分别显著降低80.14%、90.45%和88.76%；OE-1和OE-2拟南芥的气孔导度分别比WT低58.99%和50.50%且差异显著（P<0.05，图7C）。另外，干旱处理后，WT、OE-1和OE-2拟南芥的蒸腾速率分别显著下降50.30%、76.58%和77.99%；OE-1和OE-2拟南芥的蒸腾速率分别比WT低57.82%和55.79%且差异显著（P<0.05，图7D）。

叶绿素荧光参数结果显示，干旱处理前，WT、OE-1和OE-2拟南芥的ETR、Y（Ⅱ）、qP和NPQ均无显著性差异（图7E~7H）。干旱处理后，OE-1和OE-2拟南芥ETR的降幅（分别为23.65%和15.33%）低于WT（26.29%），且OE-1和OE-2拟南芥的ETR分别比WT高12.26%和13.62%（图7E）；OE-1和OE-2拟南芥Y（Ⅱ）的下降幅度（分别为31.27%和37.47%）也低于WT（61.01%），同时OE-1和OE-2拟南芥Y（Ⅱ）分别比WT高38.68%和36.52%且差异显著（P<0.05，图7F）；OE-1和OE-2拟南芥qP的降幅（分别为30.08%和36.53%）均低于WT（59.70%），OE-1和OE-2拟南芥的qP分别比WT高40.81%和37.60%且差异显著（P<0.05，图7G）；WT、OE-1和OE-2拟南芥的NPQ分别显著上升45.86%、67.78%和67.60%；OE-1和OE-2拟南芥的NPQ分别比WT高42.89%和40.34%且差异显著（P<0.05，图7H）。

2.6.2　不同基因型拟南芥叶片叶绿素含量和电导率比较

干旱处理前，WT、OE-1和OE-2拟南芥叶片的叶绿素a和叶绿素b含量均无显著差异（图7I、7J）。干旱处理后，WT拟南芥叶片叶绿素a含量显著下降32.43%，而OE-1和OE-2叶绿素a含量降幅较小，分别为23.20%和13.59%；OE-1和OE-2拟南芥叶片叶绿素a含量分别比WT高18.24%和19.62%，但无显著性差异（图7I）。干旱处理后，WT拟南芥叶片叶绿素b含量显著降低32.94%，而OE-1和OE-2仅分别仅下降19.76%和16.90%且无显著性差异；OE-1和OE-2拟南芥叶片叶绿素b含量分别比WT高16.38%和15.22%且差异不显著（图7J）。叶片相对电导率的结果表明，干旱处理后，WT拟南芥叶片的相对电导率显著上升56.68%，而OE-1和OE-2拟南芥叶片的相对电导率增幅不明显，分别为20.22%和9.19%；并且OE-1和OE-2拟南芥叶片的相对电导率分别比WT低47.62%和42.84%且差异显著（P<0.05，图7K）。

2.7　不同基因型拟南芥和‘84K’杨中 RD29A 与 DREB2 基因表达分析

为探讨PtrMYB002基因调控拟南芥抗旱性的潜在机理，本研究对干旱处理前后WT、OE-1和OE-2拟南芥中参与干旱胁迫调控的2个关键基因RD29A和DREB2的表达水平进行分析。干旱处理前，OE-1和OE-2拟南芥AtRD29A基因相对表达量分别是WT的1.81倍和1.77倍且AtDREB2基因表达水平分别是WT的1.63倍和1.51倍（图8A、8B）。干旱处理后，WT、OE-1和OE-2拟南芥AtRD29A和AtDREB2基因相对表达量均显著上调；OE-1和OE-2拟南芥AtRD29A基因相对表达水平分别是WT的3.03倍和2.49倍且AtDREB2基因相对表达水平分别是WT的1.88倍和1.52倍，均具有显著性差异（P<0.05，图8A、8B）。

为研究PtrMYB002基因在杨树中是否具有类似的调控功能，分别对瞬时转化空载体和PtrMYB002基因的‘84K’杨中与拟南芥同源的PagRD29A和PagDREB2B基因相对表达水平进行比较分析。与对照组相比，瞬时表达PtrMYB002基因的‘84K’杨中上述2个基因相对表达水平分别上调表达3.27倍和2.31倍且差异显著（P<0.05，图8C）。

3 讨论

本研究发现，PtrMYB002是一个响应干旱胁迫和ABA信号的R2R3-MYB转录因子。过表达PtrMYB002基因显著抑制拟南芥生长并增强其抗旱性，且其抗旱调控机制在杨树中可能具有一定的保守性。

生物信息学分析表明，PtrMYB002与调控植物次生壁发育且兼有影响植物抗逆性的转录因子MYB46蛋白同源^［27-28］。此外，PtrMYB002基因启动子区域含有3个MBS和3个ABRE元件，二者分别是植物响应干旱胁迫和ABA信号的核心顺式作用调控元件^［29-30］。同时，干旱处理和ABA处理均诱导PtrMYB002基因表达。亚细胞定位结果显示，PtrMYB002-GFP融合蛋白仅定位于细胞核，这符合转录因子通过核定位调控靶基因表达的功能特性。综上，PtrMYB002基因序列特征、表达模式与定位情况均指向其作为R2R3-MYB转录因子参与调控植物抗旱性的功能。

过表达PtrMYB002基因显著抑制拟南芥生长，这与PtoMYB142、PtrSSR1、VyMYB24和SmMYB52等不同植物R2R3-MYB转录因子抑制植物生长的作用有相似之处^{［19-20， 31-32］}。PtrMYB002的生长抑制效应可能与激素信号的交叉调控有关。ABA既调控植物的抗逆性，也影响植物的生长发育，它可通过抑制赤霉素或生长素的合成及下调细胞周期相关基因（如CDKB2；2和CYCB1；1等）来延缓植物生长^［33-35］。本研究发现，PtrMYB002基因受ABA诱导表达，该基因在拟南芥中过表达可能会进一步激活ABA信号下游通路，强化ABA对拟南芥生长的抑制作用。此外，本研究表明，PtrMYB002在拟南芥和杨树中可分别上调AtDREB2和PagDREB2B基因表达，其介导的生长抑制作用可能与OsDREB2B通过赤霉素代谢负调控水稻株高类似^［36］。同时，PtrMYB002可能直接调控生长相关的靶基因来抑制植物生长。例如，GhMYB4通过抑制GhLTP4和GhSWEET12基因表达负调控棉花（Gossypium hirsutum）纤维细胞伸长^［37］；GhMYB86直接靶标并促进GhTUB7基因表达，导致纤维中微管异位排列，从而抑制棉花纤维伸长^［38］。PtrMYB002或许通过抑制类似基因的表达来减少细胞伸长与器官扩展。

过表达PtrMYB002基因显著提高拟南芥抗旱性。从生理层面看，干旱胁迫下，过表达株系的光合系统稳定性、水分保持能力及细胞膜完整性均显著优于WT：（1）干旱处理后，过表达株系的净CO₂同化速率显著高于WT，且其Y（Ⅱ）、qP下降幅度更小，而NPQ升高幅度更大。这表明PtrMYB002可通过增强过剩光能的耗散能力，减少干旱导致的光损伤来保护光系统Ⅱ，这与VyMYB24和MsMYB58等通过维持光合效率提升植物抗旱性的功能类似^［39-40］。（2）过表达株系的气孔导度与蒸腾速率在干旱处理后均显著低于WT，说明PtrMYB002可通过促进气孔关闭减少水分散失，这与PtoMYB170和PdbMYB6等通过促进气孔关闭提高植物抗旱性的功能相似^{［12，41］}。（3）干旱处理后，过表达株系的相对电导率远低于WT，且叶绿素a和b降解程度更小，表明PtrMYB002可缓解干旱导致的细胞膜破裂与光合色素降解。从分子层面看，PtrMYB002通过上调干旱响应关键基因DREB2和RD29A的表达发挥作用，这与MdMYB46直接激活MdRD29A等基因的转录及PtrMYB94上调PtrDREB2B等基因的表达相似^{［12，42］}。干旱处理后，过表达株系中AtRD29A与AtDREB2基因相对表达量显著高于WT。DREB2是AP2/ERF家族核心成员，可结合下游许多抗旱基因（如RD29A等）启动子上的DRE元件，广泛参与调控不同植物对干旱胁迫的响应^［43-45］。更重要的是，瞬时表达PtrMYB002基因的‘84K’杨中，PagRD29A和PagDREB2B基因相对表达量显著高于对照组，表明PtrMYB002对干旱胁迫响应通路的调控作用在杨树中可能具有一定的保守性。

PtrMYB002同时调控植物的生长与抗旱性，其介导的“生长与防御权衡”是植物长期进化形成的适应性策略，为杨树抗旱育种提供了精准调控的思路^［46］。PtrMYB002可能通过抑制植物生长减少对能量和物质的消耗，从而在干旱胁迫时将资源优先分配给抗旱相关通路，比如激活DREB2和RD29A等基因表达来增强植物的抗旱性。植物在启动防御响应时常以牺牲生长和繁殖为代价，此策略在干旱事件频发的背景下具有重要适应价值^［46］。但从育种角度看，生长抑制可能导致杨树生物量降低，影响其木材产量。因此，需通过调控PtrMYB002基因表达时空特异性平衡生长与抗旱。例如，使用干旱诱导型启动子（如RD29A等基因的启动子）替代组成型35S启动子，使PtrMYB002基因仅在干旱胁迫时超表达，减少其在非干旱条件下的生长抑制效应^［47］。此外，不同R2R3-MYB的生长与防御调控模式存在差异：PdMYB2R089和PagMYB151等既促进植物生长，又提高抗旱性^［17-18］；而PtrMYB002、PtoMYB142和PtrSSR1等抑制植物生长并提高抗逆性^［19-20］。原因可能在于R2R3-MYB靶基因的特异性，有的R2R3-MYB可能同时激活生长促进基因与防御基因的表达，而有的则优先激活防御基因却抑制生长促进基因的表达。

为验证PtrMYB002基因在杨树抗旱育种中的应用潜力，还需进一步通过稳定转化杨树来明确其功能。此外，需明确PtrMYB002的靶基因与互作蛋白，深入解析其调控抗旱性的分子机制；并利用基因编辑等前沿技术进行功能验证，从而为精准培育兼具抗旱性与高生物量的杨树新品种奠定坚实的理论基础与技术支撑。

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基金资助

国家自然科学基金面上项目(32071734)