半夏试管块茎延缓生长保存技术

Conservation Technology of In Vitro Tubers of Pinellia ternata by Delayed Growth

摘要

为建立半夏（Pinellia ternata）试管块茎延缓生长保存技术体系，该研究采用不同蔗糖质量浓度、蔗糖和甘露醇配比、低温方法保存半夏试管块茎，360 d后恢复生长，观察统计其生长指标，并采用石蜡组织切片技术研究块茎中淀粉粒的变化，采用ISSR-PCR和RAPD分子标记技术检测保存后再生植株的遗传稳定性。结果表明：成熟块茎接种在新鲜的1/2MS+30 g⋅L^-1蔗糖+60 g⋅L^-1甘露醇的培养基上4 ℃保存360 d，恢复生长后块茎的成苗率高达96.67%，植株生长良好，保存效果最好；90 g⋅L^-1蔗糖处理的块茎恢复生长后成苗率高达90.00%，但因渗透压过高生长缓慢。成熟块茎在原培养基1/2MS+30 g⋅L^-1蔗糖中4 ℃保存360 d，恢复生长后块茎的成苗率最低，仅为36.70%。组织学研究表明，保存后死亡的块茎，叶原基少，细胞中几乎无淀粉粒，无黏液细胞。成苗率高和成苗率低的处理恢复生长的块茎中均储藏有大量的淀粉粒，但成活率高的处理茎尖叶原基层数更多，黏液细胞数量较少，植株生长更旺盛。采用分子标记技术共扩增条带1 140条，均未检测到变异条带，表明延缓生长保存后再生植株遗传稳定。该研究建立了简便、高效的半夏延缓生长保存技术，为半夏种质资源中短期保存提供了一条可行途径。

Abstract

To establish a technology system for the delayed growth preservation of Pinellia ternata tubers in vitro， this study valuated different sucrose mass concentrations， the ratio of sucrose to mannitol， and low-temperature methods to preserve the in vitro tubers. After 360 days， the tubers were allowed to resume growth， and the growth indicators were observed and statistically analyzed. Starch grain dynamics in the tubers were examined using paraffin sectioning technique. The genetic stability of regenerated plants after preservation was assessed using ISSR-PCR and RAPD molecular markers. Mature tubers were inoculated on fresh 1/2MS+30 g⋅L^-1 sucrose+60 g⋅L^-1 mannitol medium and stored at 4 ℃ for 360 days， the sprouting rate of tubers after recovery growth was as high as 96.67%， and the plants grew well with the best preservation effect. Tubers cultured on medium containing 90 g⋅L^-1 sucrose， showed reduced growth despite a sprouting rate of 90.00%， likely due to the excessively high osmotic pressure. When mature tubers were stored in the old medium of 1/2MS+30 g⋅L^-1 sucrose at 4 ℃ for 360 days， the sprouting rate of tubers after recovery growth was the lowest， only 36.70%. Histological studies showed that in the dead tubers after preservation， there were a few leaf primordia， almost no starch grains in the cells， and no mucilage cells. Both the high sprouting rate and low sprouting rate treatments had a large amount of starch grains stored in the tubers after recovery growth， but the treatment with high survival rate had more layers of leaf primordia in the stem tips and fewer mucilage cells， and the plants grew more vigorously. A total of 1 140 bands were amplified using molecular marker techniques， and no variant bands were detected， indicating genetic stability of regenerated plants after delayed growth preservation. This study established a simple and efficient technique for the delayed growth preservation of P. ternatain vitro tubers， providing a feasible approach for short-term preservation of P. ternata germplasm.

Graphical abstract

关键词

半夏 / 试管块茎 / 延缓生长 / 再生植株 / 淀粉粒分布 / 遗传稳定性

Key words

Pinellia ternata / in vitro tuber / delayed growth preservation / regenerated plants / starch granule distribution / genetic stability

半夏（Pinellia ternata）为天南星科（Araceae）多年生草本植物，以干燥的地下块茎入药，具有燥湿化痰、降逆止呕、消痞散结等多种功效^［1］，是我国常用大宗中药材之一，距今已有2 000多年的药用历史。近年来研究^［2］发现，半夏主要化学成分包括核苷类、生物碱类、有机酸类、甾醇类成分及挥发油等，具有抗肿瘤、抗炎、抗菌、抗癫痫等多种重要作用。半夏需求量逐年增多，由于环境恶化和不节制地采挖，野生资源正逐渐减少。因此，半夏人工种植生产已成为满足市场需求的主要途径^［3］。半夏主要依靠珠芽进行无性繁殖，种质退化及混杂问题非常严重^［3］。种质资源是植物育种的物质基础，同时也是进行植物生物学研究的重要材料，因此开展半夏种质资源保存技术研究具有重要的价值。无性繁殖作物种质资源主要采用田间保存和延缓生长保存。田间保存需要占用大量的土地及人力资源，保存成本高，并且在保存过程中容易遭受各种自然灾害的侵袭。延缓生长保存通过改变离体培养的培养基和培养条件使培养物的生长减慢，又不致死亡，以达到中短期保存的目的。该保存方法不仅可以节省土地及劳动力，保存方法也比较简单，而且能够在保存过程中不受病毒等微生物的危害^［4］。采用延缓生长保存时常用的措施主要有3种：提高培养基的渗透压、向培养基中加入生长延缓剂和降低培养的温度^［4］。目前，延缓植物生长保存技术已在月季（Rosa chinensis）^［5］、百合（Lilium）^［6］、菊花（Chrysanthemum）^［7］、马铃薯（Solanum tuberosum）^［8］等多种植物的种质资源保存中广泛应用。种质资源保存后的植株再生能力及其遗传稳定性是该技术能否应用于实践的关键所在。课题组前期建立了半夏试管块茎快速繁殖技术^［9］，在此基础上，本研究采用低温和高渗透压方法保存试管块茎，并进一步对试管块茎延缓生长保存后的再生能力和遗传稳定性进行分析，旨在为半夏种质资源中短期保存提供理论依据和技术支撑。

1 材料与方法

1.1　试验材料

半夏试管苗由甘肃中医药大学植物组织培养实验室提供。以半夏试管苗1 cm长的叶柄段作为外植体，接种在1/2MS+8 g·L^-1琼脂、pH=5.8的基本培养基中，放置在人工气候箱（LRH-550-G，中国）中25 ℃黑暗培养，诱导获得成熟块茎，即块茎形态完整但未萌发，成熟块茎萌发成苗即得到一代试管苗和一代块茎。

1.2　试验方法

1.2.1　成熟块茎低温保存

成熟块茎连同原有培养基放置在冰箱中4 ℃保存360 d。保存期间观察统计茎尖萌动率、萌动茎尖的状态、生根率、成苗率、块茎的状态及培养基的状态。

1.2.2　一代试管苗（带块茎）低温保存

成熟块茎第1次萌发成苗（一代试管苗）后连同原有培养基放置在冰箱中4 ℃保存360 d。低温保存期间，观察统计新鲜叶柄数量、干枯叶柄数量、再次萌动的茎尖数量、再次萌动的茎尖状态、块茎状态及培养基状态。

1.2.3　高渗透压结合低温保存成熟块茎

将成熟块茎转接到含有不同质量浓度的蔗糖（30 g·L^-1、60 g·L^-1、90 g·L^-1）及蔗糖与甘露醇配比使用（30 g·L^-1蔗糖+20 g·L^-1甘露醇、30 g·L^-1蔗糖+ 40 g·L^-1甘露醇、30 g·L^-1蔗糖+60 g·L^-1甘露醇、60 g·L^-1蔗糖+20 g·L^-1甘露醇、90 g·L^-1蔗糖+20 g·L^-1甘露醇）的1/2MS+8 g·L^-1琼脂、pH=5.8的培养基中。放置在冰箱中4 ℃保存360 d。

1.2.4　再生植株形态学指标观察与测定

将延缓生长保存后的块茎接种在1/2MS+8 g·L^-1琼脂、pH=5.8的培养基上，在25 ℃、光照强度1 500 lx、光照时间12 h·d^-1条件下恢复生长，观察统计不同处理保存后成苗块茎数量、恢复培养后成苗率、叶柄数量/每块茎、平均叶柄长度及叶色。

1.2.5　再生植株分子水平遗传稳定性检测

1.2.5.1　基因组DNA的提取及检测

从恢复生长后存活率最高的2个处理（90 g·L^-1蔗糖和30 g·L^-1蔗糖+60 g·L^-1甘露醇）中随机取10株半夏试管苗的嫩叶，采用改良的CTAB法^［10］提取总DNA，取2 μL DNA用8 g·L^-1琼脂糖凝胶电泳检测，DNA样品于-20 ℃保存备用。

1.2.5.2　RAPD及ISSR-PCR体系扩增

本试验从12条RAPD和ISSR引物中筛选出6条扩增条带清晰、多态性好及稳定性好的引物用于遗传稳定性分析，根据其理论退火温度筛选出最佳退火温度（表1）。PCR扩增体系^［5］为总体积25 μL，内含12.5 μL 2×Taq PCR Master Mix‖（含染液）溶液、9.5 μL ddH₂O、1 μL引物、2 μL DNA混合均匀。扩增程序：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，50.2~60.6 ℃退火45 s，72 ℃延伸2 min，35个循环，结束后72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。扩增完成后，在15 g·L^-1的琼脂糖凝胶上取5 μL扩增产物进行电泳，每80 mL加入2 μL绿色荧光核酸染料，电泳缓冲液为0.5×TBE，DL 2000 Marker作为分子量标准，电压110 V，电泳90 min，电泳结束后在凝胶成像仪上成像和拍照。

1.2.6　淀粉粒组织化学定位

采用石蜡组织切片技术和改良的高碘酸-希夫试剂进行制片和多糖染色并在显微镜下进行观察拍照。分析对比30 g·L^-1蔗糖处理保存后死亡的块茎和恢复生长的块茎及成苗率最高处理（30 g·L^-1蔗糖+60 g·L^-1甘露醇）恢复生长块茎的淀粉数量和分布部位及黏液细胞数量的差异。

1.3　数据处理

本试验采用单因素试验设计，每个处理5瓶，每个重复6个外植体，利用Excel 2016软件进行数据统计，IBM SPSS 26.0 Duncan新复极差法进行方差分析。对扩增的DNA电泳条带进行人工识别图谱条带，电泳图中有条带图谱记为“1”，无条带记为“0”，同一处理间出现条带的增多或缺失为变异条带。

2 结果与分析

2.1　低温黑暗条件下半夏成熟块茎的保存效果

成熟块茎连同原培养基于4 ℃黑暗条件下保存过程中发现，块茎生长速度十分缓慢（表2），40 d内芽尖没有萌动现象，保存80 d时萌动率为10.0%，萌动的芽尖细弱，呈灰白色；保存160 d后，芽尖萌动率达到26.7%，新萌动的茎尖状态同80 d的状态，前期萌动的茎尖部分干枯没有正常生长成苗，此时培养基出现轻微干缩；保存240 d时，萌发的茎尖便全部干枯，且没有新的茎尖产生，此时培养基干缩严重（图1A）。保存360 d后将块茎进行恢复培养，1个月后，36.70%的块茎萌发成苗，平均每个块茎抽生3.27个叶柄（图2A）。

2.2　低温黑暗条件下半夏一代试管苗（带块茎）的保存效果

将半夏一代试管苗（带块茎）连同原培养基进行低温黑暗保存发现，保存前期叶柄干枯速度很慢（表3），前40 d叶柄干枯率为7.06%，说明试管苗有较强的抗寒性，并且由于所处环境温度较低，培养基失水速度很慢，仍能够为试管苗提供营养和水分。但随着保存时间的延长，培养基失水加剧，同时叶柄的干枯速度加快，保存120 d时叶柄干枯率迅速增加至45.88%，保存200 d时，叶柄已经全部干枯且此时培养基失水比较严重（图1B），块茎的叶柄干枯后未见再次萌动。保存结束后将块茎进行恢复培养，培养1周后茎尖萌动率为33.30%，1个月后，50.00%的块茎萌发成苗，平均每个块茎抽生2.20个叶柄（图2B）。

2.3　低温黑暗条件下半夏成熟块茎高渗透压保存效果

将半夏成熟块茎转接在含不同质量浓度蔗糖或同时添加蔗糖和甘露醇的培养基中，于4 ℃黑暗条件下保存360 d后进行恢复培养，块茎的成苗率、平均叶柄数量及叶柄长度均存在一定差异（表4，图2C~2J）。3种蔗糖培养基中保存的成熟块茎恢复培养后，块茎成苗率及平均叶柄数量随着保存蔗糖质量浓度的升高总体呈上升趋势，平均叶柄长度则显著降低：30 g·L^-1蔗糖培养基中保存块茎的成苗率为76.67%，平均叶柄数量2.81个，平均叶柄长度4.75 cm；90 g·L^-1蔗糖中保存块茎的成苗率为90.00%，平均叶柄数量3.05个，而叶柄长度却显著降低至3.05 cm。其原因是高质量浓度蔗糖条件下培养基中渗透压较高，结合低温条件减缓块茎的生理生化代谢，从而有效维持块茎活力，提高其恢复生长后的成苗率。

在30 g·L^-1蔗糖同时添加不同质量浓度的甘露醇处理中，成苗率随甘露醇质量浓度的增加而增加，其中30 g·L^-1蔗糖+60 g·L^-1甘露醇培养基中块茎的成苗率为96.67%，显著高于其他处理，且平均叶柄数量最多（3.44个），平均叶柄长度4.24 cm，仅低于30 g·L^-1蔗糖处理，说明恢复生长后试管苗生长良好。但90 g·L^-1蔗糖浓度保存块茎的植株生长受到一定的抑制，可能是过高渗透压对块茎造成一定的生理损伤而导致生长缓慢。因此，从块茎保存成苗率和试管苗生长的情况来看，90 g·L^-1蔗糖、30 g·L^-1蔗糖+60 g·L^-1甘露醇处理成苗率均较高，保存效果较好，再生植株与正常继代试管苗形态表现一致，所以半夏块茎延缓生长保存的适宜培养基为1/2MS+30 g·L^-1蔗糖+ 60 g·L^-1甘露醇+8 g·L^-1琼脂或1/2MS+90 g·L^-1蔗糖+8 g·L^-1琼脂。

2.4　低成苗率与高成苗率处理组半夏块茎组织学差异

淀粉粒、叶原基和黏液细胞数量与块茎是否成活及恢复生长状况密切相关。4 ℃黑暗条件下，成熟块茎在含30 g·L^-1蔗糖的原培养基中保存360 d后，成苗率仅为36.70%，多数块茎干缩严重，无法恢复生长（图1A）。死亡块茎的组织学观察表明，块茎表面虽具有鳞片，但茎尖仅由1个叶原基组成，茎尖和块茎中部细胞中几乎无淀粉粒分布，块茎中也未见晶簇、维管束（图3A）。其原因是成熟块茎比较幼小，抗寒和抗旱能力弱，加之，原培养基含水量低，长期的保存造成极度的干旱缺水，导致淀粉粒解体，细胞内的碳源和能量耗尽，块茎死亡。30 g·L^-1蔗糖处理下恢复生长的块茎，茎尖具有2个叶原基，茎尖分生组织及其下方、块茎中部细胞中均储藏大量淀粉粒，黏液细胞数量多（图3B），说明成活块茎在新的培养基得到良好的营养物质供给，逐渐恢复正常生长。成苗率高（96.67%）的处理（30 g·L^-1蔗糖+60 g·L^-1甘露醇）块茎恢复生长后植株组织中均储藏大量淀粉粒，该处理茎尖叶原基层数更多，但茎尖分生组织及其下方的淀粉粒和黏液细胞数量较少，维管束也较少（图3C），说明成活率高的处理块茎保存良好，受到的损伤小，生长更加旺盛，而30 g·L^-1蔗糖处理的块茎在保存过程中受到的损伤严重，恢复培养成苗率低，且块茎叶原基数量少，黏液细胞数量多，植株生长缓慢。

2.5　半夏试管块茎延缓生长保存后再生植株遗传稳定性

2.5.1　试管块茎延缓生长保存后再生植株遗传稳定性RAPD检测结果

分别对存活率较高的2个处理（90 g·L^-1蔗糖、30 g·L^-1蔗糖+60 g·L^-1甘露醇）保存块茎恢复生长后的试管苗进行RAPD检测，用筛选出的3条引物进行样品DNA扩增，结果表明，3条引物在20份样品中共产生420条RAPD谱带，平均每个引物扩增出140条，这2个处理在所选用的引物中均未出现标记的缺失与增加（图4），说明这2种延缓生长保存方法能够保持半夏种质的遗传稳定性。

2.5.2　试管块茎延缓生长保存后再生植株遗传稳定性ISSR检测结果

采用ISSR技术对20株半夏块茎延缓生长保存后恢复生长的植株DNA进行检测，经引物扩增共得到电泳图谱1 140条（图5），没有变异条带产生，说明该延缓生长保存技术能够保持半夏种质的遗传稳定性。

3 讨论

3.1　低温和水分对块茎延缓生长保存的影响

温度、光照及其强度、生长延缓剂均能不同程度地影响植物器官或组织的离体生长，还可以产生协同效应，所有因素的相互作用将决定材料离体保存的最长时间^［11］。降低温度是延缓生长保存最常用的方法，低于最适生长所需温度的培养会降低植物呼吸、失水、萎蔫和乙烯生成等代谢活动^［1］。兰伟等^［12］将那贺川野菊（Chrysanthemum yoshinaganthum）试管苗接种在MS培养基中，4 ℃下保存360 d后仍有96.15%的成活率。王晨等^［13］将苹果（Malus domestica）组培苗接种在培养基中，置于8 ℃下，可保存18个月，且恢复培养后成活率为100%。本研究将半夏成熟块茎及一代试管苗（带块茎）连带原培养基于4 ℃下黑暗保存，发现成熟块茎保存结束进行恢复培养后，块茎的成苗率较低，其原因是由叶柄诱导形成成熟块茎需30 d左右，刚形成的块茎抗性较弱，加之，此时培养基失水较多，低温加上长期缺水导致块茎恢复生长后的植株成活率大大降低，仅为36.70%。一代试管苗恢复培养后与成熟块茎延缓生长保存后恢复培养相比有较高的成苗率，为50.00%，其原因可能是块茎成苗后其自身的生理发育更加完全，有更强的抗寒性，但形成一代试管苗约需60 d时间，培养基失水严重，低温加上长期缺水，成苗率也不高。因此，半夏成熟块茎和一代试管苗直接低温保存效果不佳。由上可知，材料生理年龄不同其抗旱性有很大差异，此外，低温保存的幼小材料需要一定的水分供给。

3.2　渗透压对块茎延缓生长保存效果的影响

本研究通过添加蔗糖和甘露醇升高培养基的渗透压对成熟块茎进行保存，甘露醇在延缓生长保存中常被当作渗透剂使用，而蔗糖有2种功能：适量蔗糖可以作为碳源供植物吸收利用，但是高浓度蔗糖会导致渗透压过高，抑制植物生长^［14］。本研究中，适宜半夏块茎保存的蔗糖质量浓度为90 g·L^-1，试管块茎恢复生长后表现为植株生长缓慢、矮小，但存活率高。延缓生长保存时，不同植物对蔗糖浓度的耐受性不一致。肖婉露等^［15］对韭菜（Allium tuberosum）缓慢生长离体保存研究中发现，最适合的蔗糖质量浓度为70 g·L^-1，该质量浓度下试管苗生长明显缓慢，更高质量浓度可能导致培养物死亡。兰伟等^［12］对那贺川野菊离体保存的研究结果表明，90 g·L^-1蔗糖处理时植株长势较弱。陈敏敏等^［16］将朱顶红（Hippeastrum）试管苗接种在添加75 g·L^-1蔗糖的培养基中，即使是常温下也可成功保存5个月。陈辉等^［17］对百合进行延缓生长保存时发现，在培养基中添加50~90 g·L^-1蔗糖均能保存11个月以上，但添加10~50 g·L^-1甘露醇保存的百合试管苗基部有愈伤产生，保存效果并不理想。徐志微等^［18］在研究葡萄（Vitis spp.）种质的离体保存时发现，在含有25 g·L^-1蔗糖的培养基中添加20~30 g·L^-1甘露醇可使种质成功保存210 d，说明该方法可有效抑制植株生长，并且成活率高，可用于葡萄组培种质的保存。说明不同植物材料保存所需的蔗糖和甘露醇质量浓度不同。本研究中，高质量浓度蔗糖保存的半夏块茎恢复培养后成活率高但植株矮小，而低质量浓度蔗糖与较高质量浓度甘露醇配合使用不仅成活率高且植株生长旺盛。傅伊倩等^［19］在大花卷丹（Lilium leichtlinii var. maximowiczii）的保存研究中提出，高质量浓度蔗糖保存的试管苗恢复培养后其株高明显降低，抑制效果显著；在加入蔗糖的基础上使用甘露醇，发现保存后再生植株存活率更高，生长状态更好，本研究结果与之一致。

3.3　延缓生长保存块茎成活情况与组织结构和淀粉粒的关系

半夏块茎是储藏器官，其中含有大量的淀粉粒。李彦文等^［20］对栽培半夏块茎横切面进行显微观察发现，其薄壁细胞中含大量淀粉粒，黏液细胞含草酸钙针晶束。本研究发现，30 g·L^-1蔗糖低温保存后的成熟块茎干缩，块茎中淀粉含量极少，是由于失水严重块茎趋于死亡，几乎无淀粉粒分布，也未见针晶束。高成活率与低成活率处理组的块茎均储藏有大量淀粉粒，但高成活率处理组的块茎具有茎尖分生组织及其下方的淀粉粒和黏液细胞和晶簇数量少、维管束较少等组织及组织化学特征，说明淀粉粒分布部位、数量及黏液细胞和晶簇数量与试管块茎保存效果密切相关。

3.4　延缓生长保存后恢复生长植株的遗传稳定性

保持遗传完整性是种质保存成功的核心标志，本研究采用分子水平标记技术对延缓生长保存后接种到培养基上的再生植株进行遗传稳定性检测，并比较其形态学差异，经RAPD和ISSR技术检测发现，延缓生长保存后恢复生长的植株没有出现变异条带，说明材料稳定，没有发生遗传变异，且形态学指标与正常生长的植株相似。已有研究表明，延缓生长保存法已应用于樱桃（Prunus pseudocerasu）^［21］、百合^［22］、龙眼（Dimocarpus longan）^［23］和那贺川野菊^［12］等多种植物，延缓生长保存后再生后代均保持了良好的遗传稳定性。本研究结合RAPD和ISSR 2种检测方法，进一步证实半夏块茎在离体保存过程中能够保持遗传稳定。综上，本研究建立了高效稳定的半夏延缓生长保存技术体系，可为半夏种质资源的安全保存提供一条简便可行的途径。

4 结论

本研究建立了一种简易高效的半夏种质资源中短期保存方法，即采用组织培养方法诱导试管块茎，将其转接到1/2MS+30 g·L^-1蔗糖+60 g·L^-1甘露醇+8 g·L^-1琼脂、pH=5.8培养基中，置于冰箱中4 ℃保存360 d后取出，进行恢复培养，成苗率高达96.67%，再生植株长势良好且遗传稳定。半夏试管块茎延缓生长保存技术具有省时、省地、省空间和无病虫害侵染等优点，为半夏种质资源及脱毒苗保存提供一条简便可行的途径。

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基金资助

甘肃省高等学校产业支撑计划项目(2020C-09)

甘肃省联合基金项目(24JRRA877)

甘肃省重点研发计划项目(24YFNA007)

甘肃中医药大学成果转化培育项目(2023CGZH-18)

甘肃中医药大学教学改革项目(ZHXM-2021-17)