发根农杆菌介导龙葵遗传转化体系优化

Optimization of Agrobacterium rhizogenes-Mediated Genetic Transformation System of Solanum nigrum

摘要

该研究旨在通过建立发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）介导的龙葵（Solanum nigrum）遗传转化体系，提高遗传转化效率及总黄酮含量。研究以龙葵叶片为外植体，探究菌株类型、菌液浓度等因素对龙葵毛状根诱导率的影响。基于该体系，构建重组质粒PBI121-6flag-SnCHI，通过农杆菌介导，诱导转SnCHI基因的毛状根，考察龙葵毛状根转SnCHI基因后的总黄酮含量变化。研究结果表明：菌株Ar.1193在OD₆₀₀为1.0、侵染25 min、共培养24 h条件下，龙葵毛状根诱导率可达88.49%。对转SnCHI基因毛状根进行qRT-PCR检测，发现其基因表达水平是空白组的28.81倍；测定转SnCHI基因毛状根的总黄酮含量，发现转SnCHI基因毛状根的总黄酮含量最高达空白组的4.14倍。成功建立龙葵遗传转化体系，对SnCHI基因的功能进行研究，为同属植物的组织培养和遗传转化研究提供参考。

Abstract

The aim of this study was to establish an Agrobacterium rhizogenes-mediated genetic transformation system for Solanumnigrum（black nightshade） with the goal of enhancing transformation efficiency and increasing its total flavonoid content. Based on this system， the recombinant plasmid PBI121-6flag-SnCHI was constructed， the hairy roots of SnCHI gene transformation were induced by Agrobacterium-mediated pathway， and the content of total flavonoids in the hairy roots of S.nigrum after SnCHI gene transformation was investigated. The results showed that the induction rate of hairy roots of S. nigrum could reach 88.49% under the conditions of OD₆₀₀ value of 1.0， infection for 25 min and co-culture for 24 h. The qRT-PCR detection of transgenic SnCHI hairy roots showed that the gene expression level was 28.81 times that of the blank group. The total flavonoid content of SnCHI transgenic hairy roots was determined， and it was found that the total flavonoid content of SnCHI transgenic hairy roots was up to 4.14 times that of the blank group. The genetic transformation system of S. nigrum was successfully established， and the function of SnCHI gene was studied， which provided a reference for tissue culture and genetic transformation of the same genus.

Graphical abstract

关键词

龙葵 / 毛状根 / 发根农杆菌 / 遗传转化体系 / 黄酮类化合物

Key words

Solanum nigrum / hairy root / Agrobacterium rhizogenes / genetic transformation system / flavonoids

龙葵（Solanum nigrum）^［1］为茄科（Solanaceae）茄属（Solanum）1年生草本，属于药食同源植物。广泛分布于中国大部分地区，尤其是长江流域及南方丘陵地带。其性寒，味苦，有小毒，归肝、胃经，具有清热解毒、消肿散结等功效，主要适用于疔疮痈肿、慢性气管炎、肿瘤等疾病^［2］。龙葵化学成分复杂，主要包括生物碱^［3］、黄酮^［4］、多糖^［5］等，具有抗炎^［6］、抗癌^［7］、抗肝损伤^［8］、抗氧化^［9］等药理作用。

毛状根（hairy root）为发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）侵染植物后产生的病理状态下形成的根，也被称为发状根或发根。毛状根具有遗传稳定、生长速度快，不受病原体和除草剂的影响等优势^［10］，能合成和累积次生代谢产物，Huang等^［11］建立博落回毛状根诱导体系，比较毛状根与野生植物体代谢产物，发现毛状根的苄基异喹啉生物碱含量明显高于野生植物体；毛状根诱导已应用于多种药用植物中，如何首乌（Polygonummultiflorum）^［12］、黄芪（Astragalus membranaceus）^［13］、白术（Atractylodes macrocephala）^［14］、西洋参（Panax quinquefolium）^［15］等。

关于发根农杆菌介导的龙葵转化体系和龙葵相关基因的次生代谢调控方面的探索少有报道。本研究以无菌龙葵苗叶片为外植体，探究菌株类型、菌液浓度、侵染时间及共培养时间对毛状根诱导效率的影响；构建重组质粒PBI121-6flag-SnCHI，通过农杆菌介导，诱导转SnCHI基因的毛状根，考察龙葵毛状根转SnCHI基因前后的总黄酮含量变化，以期为同属植物的组织培养和遗传转化研究提供参考。

1 材料和方法

1.1　试验材料

1.1.1　植物材料

试验材料为哈尔滨商业大学药学院实验室培养的龙葵无菌苗。龙葵成熟种子，用75%乙醇消毒1 min，0.3%苯扎溴铵浸泡45 min，灭菌水清洗3~5次，无菌纸吸干水分，置于湿润的1/2MS液体培养基灭菌纸培养皿中于恒温培养箱内培养发芽，发芽种子于26 ℃、8 h·d^-1、光照度3 400 lx条件下培养。

1.1.2　菌株和载体

所用的感受态农杆菌Ar.1193、K599、Ar.A4、Ar.Qual均购于上海唯地生物技术有限公司，保存于-80 ℃；PBI121-6flag载体由东北林业大学林学院提供；pCloneEZ-TOPO载体购自中美泰和生物技术（北京）有限公司。

1.2　试验方法

1.2.1　侵染液制备

从-80 ℃取出感受态发根农杆菌冰浴解冻，取50 μL加入75 mL的LB液体培养基中，在含K599、Ar.A4的培养基中加入50 μg·mL^-1的链霉素（Strep），在含Ar.1193的培养基中加入20 μg·mL^-1的利福平（Rif），在Ar.A4的LB液体培养基中加入50 μg·mL^-1的硫酸卡那霉素（Kan）；暗光28 ℃，160 r·min^-1振荡培养8~72 h（依菌株调整）。待培养基浑浊后，取出2~3 mL测定其OD₆₀₀。选择所需OD₆₀₀的菌液，4 000 rpm离心10 min，弃上清，加入等体积1/2MS液体培养基后，用于侵染试验。

1.2.2　龙葵毛状根诱导优化试验

在龙葵毛状根的诱导过程中，不同的菌株类型、菌液浓度、侵染时间及共培养时间均会对龙葵毛状根的诱导率产生影响。以无菌龙葵叶片为外植体，分别筛选发根农杆菌菌株类型（Ar.1193、K599、Ar.A4、Ar.Qual）、菌液浓度OD₆₀₀（0.4、0.6、0.8、1.0、1.2）、侵染时间（10、15、20、25、30、35 min）、共培养时间（0、24、48、72 h）。

取1.0~1.5 cm²大小的龙葵叶片为侵染用外植体，浸泡发根农杆菌菌液（其间轻摇，使外植体与侵染液充分接触），灭菌纸吸干多余菌液，置于1/2MS固体培养基中，28 ℃黑暗条件下共培养。共培养结束后，用灭菌水清洗外植体，移至1/2MS固体除菌培养基，每7 d更换1次除菌培养基。每组处理84片外植体，每次处理重复3次，统计期间外植体变化及生根情况。

毛状根诱导率=（产生毛状根的外植体数量/84）×100%（1）

1.2.3　 SnCHI基因克隆

采用CTAB法提取毛状根DNA，PCR验证rolB基因和rolC基因，确定毛状根是由发根农杆菌诱导形成。引物如表1。提取实生苗RNA，逆转录成cDNA作为PCR反应模板。根据本课题组前期基于龙葵转录组分析得到SnCHI全长转录本序列，借助NCBI Primer-BLAST工具设计引物（表2）并进行PCR，胶回收产物与pCloneEZ-TOPO载体连接，转至大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α感受态细胞中，挑取单克隆菌落扩大培养，进行PCR反应验证阳性单克隆及测序比对。

1.2.4　重组PBI121-6flag-SnCHI质粒表达载体的构建

PBI121-6flag载体质粒用SalI快速内切酶切成线性载体并纯化，用酶切引物通过PCR反应扩增SnCHI-flag片段并胶回收纯化，将回收产物SnCHI-flag片段与线性化PBI121-6flag载体连接后转化大肠杆菌，涂板过夜挑单克隆振荡培养，菌液为模板进行PCR反应，初步验证重组质粒是否成功。阳性单克隆测序比对。引物35S Promoter-F 5′-CCCA CTATCCTTCGCAAGACC-3′；SnCHI-R 5′-CTGGA TTGAGGGTAGCTCAC-3′。

1.2.5　转SnCHI基因毛状根的诱导、鉴定及培养

将重组质粒PBI121-6flag-SnCHI转入感受态的农杆菌Ar.1193中，使用优化的遗传转化体系诱导龙葵叶片产生毛状根，同时以空白质粒的Ar.1193侵染为对照。提取DNA，PCR验证SnCHI基因、PBI121-6flag载体及rolB基因的存在，引物同表1和1.2.4。阳性毛状根于80 mL 1/2MS液体培养基中26 ℃震荡培养。

1.2.6　龙葵转SnCHI基因的表达量及总黄酮含量分析

将阳性毛状根RNA反转录并进行qRT-PCR分析，引物如表3。基因表达水平数据计算采用2^-ΔΔCt法进行相对定量分析。参考李凤霞^［16］试验方法，以芦丁为标准品，硝酸铝为显色剂，比色法测定转基因毛状根总黄酮含量并比较与空白组总黄酮含量差异。

1.2.7　数据处理

采用Excel 2021进行相关试验的数据记录，采用GraphPad Prism 10.1.2软件对试验数据进行处理，多组间比较采用单因素方差分析，采用Tukey法进行事后多重比较。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1　不同因素对龙葵毛状根诱导率的影响

2.1.1　不同菌株对龙葵毛状根诱导率的影响

选用Ar.1193、K599、Ar.A4、Ar.Qual农杆菌分别侵染龙葵叶片外植体，结果如图1，研究发现4种不同菌株均可诱导出龙葵毛状根，Ar.1193（92.86%）显著高于Ar.A4（87.70%）、Ar.Qual（80.55%）和K599（68.65%）。图2中Ar.1193外植体生长状态良好，主根及侧根发达，褐化程度低；Ar.A4和Ar.Qual主根较为发达，无侧根；K599（68.65%）主根发达，但生长缓慢，无侧根，褐化程度高，因此Ar.1193为龙葵诱导毛状根最佳菌株。

2.1.2　不同菌液浓度对龙葵毛状根诱导率的影响

用Ar.1193不同菌液浓度（OD₆₀₀为0.4、0.6、0.8、1.0、1.2）分别侵染龙葵叶片外植体，结果如图1，5种菌液浓度诱导率均高于66.00%，当菌液浓度OD₆₀₀为0.4~1.0时，诱导率随菌液浓度增加而增加，当OD₆₀₀为1.2时，诱导率降低。OD₆₀₀为1.2时诱导率（72.62%）显著低于OD₆₀₀为0.6（78.97%）但高于OD₆₀₀为0.4（66.27%）。OD₆₀₀为0.8时诱导率（81.35%）与OD₆₀₀为1.0（82.14%）虽无显著差异，但OD₆₀₀为1.0时诱导率较高且主根、侧根均发达，因此OD₆₀₀为1.0为最佳诱导菌株浓度。

2.1.3　不同侵染时间对龙葵毛状根诱导率的影响

适宜的侵染时间可诱导出状态良好的毛状根。选用OD₆₀₀为1.0的Ar.1193对龙葵叶片进行不同时间的侵染（10、15、20、25、30、35 min），结果如图1，随着侵染时间增加诱导率先增后减，侵染25 min诱导率（88.89%）最高，显著高于其他所有组，毛状根主根和侧根生长状态佳；故最佳侵染时间为25 min。

2.1.4　共培养时间对龙葵毛状根诱导的影响

共培养时间分别为0、24、48、72 h，结果如图1，研究发现共培养0 h（47.62%），也可诱导出毛状根；共培养72 h诱导率（61.90%）显著高于0 h但低于48 h（78.57%）；在共培养48 h和72 h，毛状根生长状况较好；共培养24 h（86.90%）与48 h诱导率存在显著性差异且共培养诱导率最高、毛状根生长状况较好，因此24 h为最佳共培养时间。

2.2　 SnCHI 基因克隆及重组表达载体的构建

对龙葵毛状根进行PCR检测，在500~750 bp、250~500 bp处发现与rolC基因（626 bp）、rolB基因（423 bp）条带长度一致的亮带（图3），即毛状根是由发根农杆菌诱导形成；PCR扩增SnCHI基因，在500~750 bp间出现清晰条带，与SnCHI基因完整ORF（654 bp）相符，PCR扩增成功。测序比对后，获得SnCHI基因的ORF序列（登录号PQ373901），包含起始密码子（ATG）和终止密码子（TAA），编码217个氨基酸（图4）。重组质粒转化大肠杆菌过夜，挑取单克隆菌落进行PCR反应，SnCHI基因序列和PBI121-6flag载体上的部分CAMV 35S promoter长度共为815 bp（图5）。凝胶电泳在750 bp左右出现清晰条带，重组质粒转化成功。

2.3　转 SnCHI 基因龙葵毛状根诱导、鉴定及培养

PCR验证转基因毛状根（图6），扩增出750~1 000 bp的条带，含SnCHI基因和PBI121-6flag载体中的部分CaMV 35S promoter的片段长度共同为815 bp，与条带扩增结果一致且为农杆菌诱导的毛状根。转SnCHI基因毛状根的诱导及培养过程如图7。

2.4　 SnCHI 基因表达及总黄酮含量分析

在获得的3个SnCHI转化体系中（图8），I5的SnCHI基因相对表达量最高，是空白毛状根K15的28.81倍；I3、I5的SnCHI基因相对表达量依次为空白毛状根K15的8.80倍、2.88倍。比色法测定毛状根样品中总黄酮含量，如图8中转SnCHI基因毛状根（I3、I5、I9）的总黄酮含量显著高于空白组K15，总黄酮含量I3>I5>I9>K15。I3是样品中总黄酮含量最高的体系，总黄酮含量为14.68 mg·g^-1，是K15的4.14倍。

3 讨论

农杆菌转化法是最常用的间接转基因技术，研究^［17］发现：农杆菌介导的遗传转化不仅可以增加植物次生代谢产物含量，还可应用于植物抗逆性的生理生化机制研究。如Kayani等^［18］利用转基因技术诱导青蒿（Artemisia caruifolia）毛状根，提高青蒿素的含量。Matvieieva等^［19］利用发根农杆菌对蒂氏蒿（Artemisia tilesii）进行遗传转化，可使细菌来源的rolB和rolC基因稳定整合到该植物基因组中，诱导毛状根形成，并发现不同蒂氏蒿毛状根系中类黄酮含量和抗氧化能力均有所增加。本研究发现，转SnCHI基因毛状根总黄酮含量有所增加，与其研究结果一致。

在发根农杆菌介导的遗传转化中，植物外植体的选择、菌株类型、菌液浓度等，均影响毛状根诱导和转化，其中菌株类型为关键因素，不同类型的菌株对毛状根遗传转化体系影响具有多维性。孙昊等^［20］研究比较Ar.Qua1、C58C1、K599和MSU440诱导光果柱花草（Stylosanthes leiocarpa）产生转基因毛状根的效果，发现在添加8 mg·L^-1潮霉素B的诱导培养基上，菌株K599诱导率为23.33%，阳性率达100%，为最佳菌株；朱雨萱等^［21］用Ar. Qual、Ar.1193、C58C1、K599在不同处理方法下均可诱导草莓（Fragaria×ananassa）外植体形成毛状根且Ar.1193菌株的诱导效果最为显著，毛状根阳性率最高（79.41%），本研究Ar.1193菌株为最佳菌株且诱导率显著高于其他菌株的研究结果与之相一致。确定的最佳菌液浓度OD₆₀₀=1.0、侵染时间25 min和较短的共培养时间24 h，不仅保障了高诱导率，更利于降低农杆菌过度生长风险。

本研究以龙葵叶片为外植体，筛选不同影响因素以确定最佳诱导条件，建立高效遗传转化体系克隆得到SnCHI基因并获得3个转SnCHI基因龙葵毛状根体系，比较转SnCHI基因前后的龙葵毛状根中黄酮类成分含量变化，对SnCHI基因的功能进行研究，为同属植物的组织培养和遗传转化研究提供参考，为龙葵毛状根中其他基因功能研究和积累活性代谢产物提供技术支持和研究平台。

4 结论

本研究确定了OD₆₀₀为1.0的Ar.1193对龙葵叶片侵染时间25 min，共培养24 h，诱导率可达88.49%，建立最佳龙葵遗传转化体系。对转SnCHI基因毛状根进行荧光定量PCR检测，发现其基因表达水平是空白组的28.81倍；测定转SnCHI基因毛状根的总黄酮含量，转SnCHI基因总黄酮含量最高的是空白组的4.14倍，总黄酮含量显著高于原植物，这与查尔酮异构酶在类黄酮生物合成中的关键作用一致，其通过催化查尔酮环为黄烷酮，为后续黄酮类化合物的合成提供前体。

研究结果与甘草（Glycyrrhiza uralensis）^［22］、黄芪^［23］、红花（Carthamus tinctorius）^［24］等植物中CHI基因过表达可增加黄酮类化合物含量的研究趋势相符。证实了SnCHI基因在黄酮生物合成中的关键作用，为利用毛状根培养生产龙葵黄酮有效成分提供了重要的参考依据和技术支持。本研究仍存在一定局限性，仅对转基因前后总黄酮含量进行初步探究，后续将对其他成分种类、含量及变化规律进行更深入的研究。

参考文献

[1] HIEU H T，刘哲君，万诗雨，等.龙葵不同药用部位及药效成分的抗肿瘤机理研究进展［J］.时珍国医国药，2023，34（10）：2479-2482.

[2] HIEU H T， LIU Z J， WAN S Y，et al.Research progress on the anti-tumor mechanism of different medicinal sites and pharmacodynamic components of Solanum nigrum ［J］.Lishizhen Medicine and Materia Medica Research，2023，34（10）：2479-2482.

[3] 胡港，俞赟丰，邓羿駃，等.经典名方中龙葵的本草考证［J］.中国野生植物资源，2024，43（3）：101-109.

[4] HU G， YU Y F， DENG Y J，et al.Herbal textual research on Solanum nigrum in famous classical formulas［J］.Chinese Wild Plant Resources，2024，43（3）：101-109.

[5] LIU L Y， YANG Y K， WANG J N，et al.Steroidal alkaloids from Solanum nigrum and their cytotoxic activities［J］.Phytochemistry，2022，202：113317.

[6] CHURIYAH C， NINGSIH S， FIRDAYANI F，et al.The cytotoxic，apoptotic induction，and cell cycle arrest activities of Solanum nigrum L.ethanolic extract on MCF-7 human breast cancer cell［J］.Asian Pacific Journal of Cancer Prevention，2020，21（12）：3735-3741.

[7] CHEN H， QI X D.Study on the effect of polysaccharides from Solanum nigrum Linne on cellular immune function in tumour-bearing mice［J］.African Journal of Traditional，Complementary and Alternative Medicines，2013，10（4）：41-46.

[8] RAVI V， SALEEM T M， PATEL S S，et al.Anti-inflammatory effect of methanolic extract of Solanum nigrum Linn berries［J］.International Journal of Applied Research in Natural Products，2009，2（2）：33-36.

[9] FU R J， WANG X H， HU Y，et al.Solamargine inhibits gastric cancer progression by regulating the expression of lncNEAT1_2 via the MAPK signaling pathway［J］.International Journal of Oncology，2019，54（5）：1545-1554.

[10] RAJU K， ANBUGANAPATHI G， GOKULAKRISHNAN V，et al.Effect of dried fruits of Solanum nigrum Linn against CCl₄-induced hepatic damage in rats［J］.Biological and Pharmaceutical Bulletin，2003，26（11）：1618-1619.

[11] CAMPISI A， ACQUAVIVA R， RACITI G，et al.Antioxidant activities of Solanum nigrum L.leaf extracts determined in in vitro cellular models［J］.Foods，2019，8（2）：63.

[12] BISWAS D， CHAKRABORTY A， MUKHERJEE S，et al.Hairy root culture：a potent method for improved secondary metabolite production of Solanaceous plants［J］.Frontiers in Plant Science，2023，14：1197555.

[13] HUANG P， XIA L Q， LIU W，et al.Hairy root induction and benzylisoquinoline alkaloid production in Macleaya cordata ［J］.Scientific Reports，2018，8（1）：11986.

[14] HO T T， LEE J D， AHN M S，et al.Enhanced production of phenolic compounds in hairy root cultures of Polygonum multiflorum and its metabolite discrimination using HPLC and FT-IR methods［J］.Applied Microbiology and Biotechnology，2018，102（22）：9563-9575.

[15] HWANG C， YAN S， CHOE Y，et al.Efficient hairy root induction system of Astragalus membranaceus and significant enhancement of astragalosides via overexpressing AmUGT15［J］.Plant Cell Reports，2024，43（12）：285.

[16] ZHANG C C， GUO X Z， WANG H Y，et al.Induction and metabolomic analysis of hairy roots of Atractylodes lancea ［J］.Applied Microbiology and Biotechnology，2023，107（21）：6655-6670.

[17] KOCHAN E， NOWAK A， ZAKŁOS-SZYDA M，et al. Panax quinquefolium L.ginsenosides from hairy root cultures and their clones exert cytotoxic，genotoxic and pro-apoptotic activity towards human colon adenocarcinoma cell line Caco-2［J］.Molecules，2020，25（9）：2262.

[18] 李凤霞.查尔酮异构酶基因过表达对新疆雪莲类黄酮生物合成的调控［D］.北京：中国科学院研究生院（植物研究所），2006.

[19] LI F X.Regulation of flavonoid biosynthesis by overexpression chalcone isomerase gene in Saussurea involucrata ［D］.Beijing：Institute of Botany，The Chinese Academy of Science，2006.

[20] 屈阿艳，曹佳琰，王惠玉，等.发根农杆菌介导的叶用莴苣毛状根转化体系的建立［J］.北京农学院学报，2025，40（2）：21-27.

[21] QU A Y， CAO J Y， WANG H Y，et al.Establishment of a system for Agrobacterium rhizogenes-mediated hairy root transformation of leaf lettuce［J］.Journal of Beijing University of Agriculture，2025，40（2）：21-27.

[22] KAYANI W K， KIANI B H， DILSHAD E，et al.Biotechnological approaches for artemisinin production in Artemisia ［J］.World Journal of Microbiology and Biotechnology，2018，34：54.

[23] MATVIEIEVA N A， MORGUN B V， LAKHNEKO O R，et al. Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation enhances the antioxidant potential of Artemisia tilesii Ledeb［J］.Plant Physiology and Biochemistry，2020，152：177-183.

[24] 孙昊，张建禹，罗丽娟，等.光果柱花草转基因毛状根及其原生质体制备体系的建立［J］.草地学报，2024，32（5）：1583-1591.

[25] SUN H， ZHANG J Y， LUO L J，et al.Development of transgenic hairy root induction and protoplast preparation systems for Stylosanthes leiocarpa ［J］.Acta Agrestia Sinica，2024，32（5）：1583-1591.

[26] 朱雨萱，姚明军，李斌，等.发根农杆菌介导的草莓遗传转化体系构建［J/OL］.果树学报，（2025-07-14）［2025-08-16］.

[27] ZHU Y X， YAO M J， LI B，et al.Establishment of genetic transformation system mediated by Agrobacterium rhizogenes in strawberry［J/OL］.Journal of Fruit Science，（2025-07-14）［2025-08-16］.

[28] 侯嘉铭，尹彦超，田少凯，等.过表达CHI基因提高甘草毛状根中黄酮类化合物含量的研究［J］.药学学报，2021，56（1）：319-327.

[29] HOU J M， YIN Y C， TIAN S K，et al.Overexpressing of chalcone isomerase （CHI） gene enhances flavonoid accumulation in Glycyrrhiza uralensis hairy roots［J］.Acta Pharmaceutica Sinica，2021，56（1）：319-327.

[30] 袁宇含.膜荚黄芪查尔酮异构酶基因的克隆及表达分析［D］.延边：延边大学，2020.

[31] YUAN Y H.Cloning and expression analysis of chalcone isomerase gene from Astragalus Membranaceus ［D］.Yanbian：Yanbian University，2020.

[32] 陈翠平.红花查尔酮异构酶基因的克隆表达及化学成分累积研究［D］.成都：成都中医药大学，2016.

[33] CHEN C P.The cloning and expression of chalcone isomerase gene and chemical composition accumulative study in Carthamus tinctorius L.［D］.Chengdu：Chengdu University of Traditional Chinese Medicine，2016.

基金资助

林木遗传育种国家重点实验室开放基金项目(K2017204)